Разработка биотехнологии фукозы и исследование ее биологических функций - Диссертация

Министерство образования и науки Российской Федерации ГОУ ВПО «ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ»Особую биологическую роль играет фукоза (6-дезокси-L-галактоза). Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования иммунитета (Luther et al, 2009, Becker and Lowe, 2003). Гликаны клеточной поверхности представляют собой структуры, состоящие из линейных и разветвленных цепей полисахаридов, содержащих фукозу. Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования неспецифического иммунитета. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биокаталитической технологии фукозы и исследовании ее влияния на иммунный статус и репродуктивную функцию живого организма.Фукоза (6-Дезокси-L-галактоза) C6H12O5 - представляет собой моносахарид, относящийся к дезоксигексозам. В отличие от обычных гексоз, она при кипячении с сильными минеральными кислотами образует 5-метилфурфурол, на чем основана количественная реакция определения фукозы в присутствии других гексоз. Для фукозы, как и для других дезоксисахаров, характерным является образование при окислении йодной кислотой ацетальдегида, не образующегося при окислении обычных моносахаридов [9]. Именно химические свойства фукозы предопределили уникальную биологическую роль фукозы в живых клетках. Прежде всего, фукоза является единственным сахаром, присутствующим в клетках млекопитающих в L-форме, только L-фукоза входит в состав бактериальных и растительных полисахаридов, гликопротеинов, олигосахаридов молока и других 10 природных биополимеров.Филогенетически фукоза, по-видимому, один из древнейших сахаров и присутствует уже у бактерий, грибов и водорослей. Фукоза также была найдена практически у всех Bacteria, грибов, низших и некоторых высших растений. В организмах L-фукоза синтезируется из ГДФ-D-маннозы. Известно, что фукоза входит в состав таких биологически активных веществ как: лектины, цереброзиды, сапонины, и многих гормонов. Фукоза, являясь структурным компонентом антигенов крови, служит маркером группы крови.Два пути синтеза ГДФ-фукозы в цитозоле клетки были описаны для всех тканей млекопитающих. Путь de novo представляет собой трансформацию ГДФ-маннозы в ГДФ-14 фукозу путем трех последовательных ферментативных реакций, катализируемых двумя ферментами: ГДФ-манноза-4,6-дегидратазой (ГМД) и ГДФ-кето-6-дезоксиманноза-эпимераза-4-редуктазой (так называемый FX-протеин).Этот путь синтеза фукозы был впервые исследован более 40 лет назад В. Гинзбургом, в работе которого было продемонстрировано, что ГДФ-манноза превращается в ГДФ-фукозу через промежуточный продукт ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозу [63, 64]. Первая реакция этого пути осуществляется ГМД, которая катализирует превращение ГДФ-маннозы в ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозу путем окисления гидроксильной группы у С-4 атома с отщеплением гидроксила у С-6 атома. ГДФ-фукоза является конкурентным ингибитором для ГМД и демонстрирует типичный пример обратной связи - ингибирования конечным продуктом реакции пути его синтеза. Эти исследования показали, что фукоза практически полностью идет на синтез гликолипидов с минимальной конверсией в другие сахара, что доказывало, что фукоза может непосредственно фосфорилироваться в ГДФ-фукозу путем, независимым от ГДФ-маннозы.Бактерии способны утилизировать фукозу в качестве источника углерода и энергетического ресурса, что означает наличие индуцируемого фукозой оперона, кодирующего ферменты, необходимые для катаболизма фукозы. Данный метаболический путь включает в себя следующие этапы: поглощение свободной фукозы бактериальной клеткой с помощью пермеаз, изомеризацию фукозы (альдозы) в фукулозу (кетозу), фофорилирование фукулозы в фукулоза-1-фосфат и альдолазную реакцию, катализирующую распад фукулоза-1-фосфата на лактальдегид и дигидроксиацетонфосфат [33, 51]. Ранние исследования метаболизма фукозы у бактерий в 1950-е годы показали потенциальную возможность синтеза фукозы из двух трехуглеродных фрагментов, а также с помощью обращения пути катаболизма фукозы [68, 69], но позднее не было получено результатов, подтверждающих существование подобных путей синтеза фукозы в клетке. В то же время, при внутривенном введении меченой углеродом С14 фукозы людям было обнаружено, что 39% меченого углерода было выделено с СО2 дыхания [119], что указывает на то, что фукоза частично может усваиваться организмом. Однако введение миллиграммовых количеств фукозы мышам не ведет к образованию гликогена [120], что подтверждает, что фукоза в организме млекопитающих не распадается на два трехуглеродных фрагмента и опровергает возможность утилизации фукозы в клетках млекопитающих по пути, существующему у бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕTRIAL………………………………………………..

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР…………………………...........

1.1. Строение и химические свойства фукозы…………………….

1.2 Фукоза в живых организмах……………………………………

1.2.1 Метаболизм фукозы………………………………………..

1.2.1.1 Путь de novo ……………………………………………..

1.2.1.2 Путь непосредственного фосфорилирования фукозы…………………………………………………………

1.2.1.3 Другие пути метаболизма фукозы…………………..

1.3 Строение и свойства фукоиданов………………… ……………

1.4.1 Химические способы получения фукозы…………………

1.4.2 Способы получения фукозосодержащих олигосахаридов

1.4.3 Биохимические способы получения фукозы…………….

1.4.3.1 Микроорганизмы - продуценты фукозидаз ……….

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЙ……………….

2.1. Объекты исследований…………………………………………

2.1.1. Культивирование микроскопического гриба Aspergillus awamori ВКМ F-808………………………………………………

2

2.2. Методы исследования…………………………………………..

2.2.1 Определение активности ?-L-фукозидазы……………….

2.2.2 Определение степени гидролиза фукоидана……………….

2.2.3 Биохимические и микробиологические методы исследования……………………………………………………..

2.2.4 Получение спиртоосажденного фермента……………….. 48

2.2.5 Определение уровня антителообразования………………..

2.2.6 Определение степени фукозилирования ооцита…………

2.2.7 Статистическая обработка данных……………………….

2.3 Схема экспериментальных исследований ……………………. ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ФУКОЗЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ…………

3.1 Подбор источников фукоиданов из растительного сырья…...

3.2 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей……...

3.2.1 Моделирование и оптимизация процесса экстракции фукоидана с использованием экспериментально-статистического подхода………………………………………..

3.3 Поиск активного продуцента ?-L-фукозидазы……………….

3.4 Выбор оптимальных условий культивирования продуцента фукозидазы …………………………………………………………. 3.4.1 Изучение влияния источников углерода на биосинтез фукозидазы ………………………………………………………

3

3.4.2 Исследование влияния различных факторов на синтез фукозидазы……………………………………………………….

3.4.3. Разработка условий осаждения ферментного препарата

3.5 Ферментативная деструкция фукоиданов ……………………..

3.5.1 Выбор оптимальных условий гидролиза фукоидана…….

3.6 Разработка лабораторного регламента получения фукозы………

3.6.1 Получение фукозы из растительного сырья……………... ГЛАВА 4.ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФУКОЗЫ………………………………………………………………..

4.1 Изучение пребиотических свойств фукозы…………………… 4.2 Исследование влияния фукозы на иммунный статус млекопитающих ……………………………………………….

4.3 Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих ……………………………………………….

РАСЧЕТ СЕБЕСТОИМОСТИ ФУКОЗЫ ПО ПРЕДЛАГАЕМОЙ ТЕХНОЛОГИИ……………………………..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………..

ВЫВОДЫ………………………………………………………….

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………

ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………..

4