Разработка системы, клинико-диагностических критериев и алгоритмов пренатального биохимического скрининга для выявления женщин группы высокого риска по осложненному течению беременности, рождению детей с врожденными пороками развития и синдромом Дауна.
При низкой оригинальности работы "Пренатальный биохимический скрининг - система, принципы, клинико-диагностические критерии, алгоритмы", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наукОднако массовый скрининг беременных с целью формирования группы высокого риска хромосомной патологии в городах РФ только начинает проводиться, и параметры распределения уровня маркерных белков сыворотки крови для дифференциации нормы и патологии среди беременных РФ неизвестны. Нормативные значения и параметры распределений биохимических маркеров 1 триместра для беременных РФ и, в частности, Северо-Западного региона России отсутствуют [Некрасова Е.С. и др., 2003; 2005]. Биохимический скрининг с расчетом индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна в 9-13 недель беременности в полтора раза повышает чувствительность выявления плодов с синдромом Дауна у беременных моложе 35 лет по сравнению со скринингом во 2-м триместре. Отта РАМН, на 1 и 3 съездах медицинских генетиков России (Курск, 1994; Москва, 1997); на Международном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2001, 2003, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); на II Международном конгрессе «Невский радиологический форум-2005» (Санкт-Петербург, 2005); на научно-практической конференции по профилактике ВПР в Кемеровской области (Кемерово, 2005); на Всероссийской конференции с международным участием по пренатальному скринингу (Санкт-Петербург, 2006); на Всероссийской конференции по перинатальному скринингу и пренатальной диагностике (Санкт-Петербург, 2007); на 2-м Российском Форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); на научном семинаре главных акушеров-гинекологов Тверской области (Тверь, 2008); на международном научно-практическом симпозиуме «Современные достижения в пренатальной диагностике» (Донецк, 2008); на научно-практической конференции «Профилактика врожденной и наследственной патологии у детей», посвященной 20-летию МГК ГУЗ «Республиканская больница им. Автором лично выполнены биохимические исследования содержания сывороточных маркеров в крови более 10 тысяч пациенток в 1 и 2-м триместрах; разработаны нормативные значения уровня шести сывороточных маркеров у беременных; собраны коллекции образцов крови пациенток с известными сроками и исходами беременности для установления нормативных значений маркеров; проведены клинические испытания отечественных реагентов; выполнена статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований; разработаны алгоритмы пренатального биохимического скрининга беременных в 1-м и 2-м триместре; условия проведения биохимического скрининга в диагностических центрах, не входящих в медико-генетическую службу города; поставлены задачи по созданию и предложены алгоритмы автоматизированных программ расчета индивидуального риска рождения ребенка с синдромом Дауна для различных сочетаний биохимических и ультразвуковых маркеров, определенных до 18 недель беременности.Отта РАМН совместно c ООО «Мединформатика» (в настоящее время ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург)) была разработана и внедрена оригинальная компьютерная программа автоматического расчета риска болезни Дауна у плода («Программа мониторинга синдрома Дауна», ПМСД) по результатам скрининга уровня АФП и ХГЧ во 2-м триместре у беременных Санкт-Петербурга. 1) основан на подсчете отношения правдоподобия, то есть вероятности, что результаты данной беременной принадлежат к нормальному распределению маркеров, а не к распределению для плодов с СД. Распределение уровня сывороточного маркера в норме и распределение того же маркера при СД у плода характеризуются двумя параметрами: положением максимума распределения (медианой - М) и «шириной» распределения (стандартным отклонением - СО), разница между нормой и патологией определяется сдвигом медиан. Исследование 255 образцов крови беременных с синдромом Дауна у плода позволило определить параметры и расстояние между вершинами распределений уровня маркеров для жительниц России в норме и при синдроме Дауна, которое используется в расчете индивидуального риска беременных. Поскольку СЭ у плода практически всегда сопровождается выраженной внутриутробной задержкой развития и МВПР, то беременным с пониженным в два и более раза содержанием обоих маркеров рекомендовали УЗИ 2-го уровня (в специализированном пренатальном центре).Комбинированный биохимический и ультразвуковой скрининг беременных в 9-13 недель с использованием разработанных нормативных критериев и автоматических программ расчета риска позволяет выявить до 94,5% плодов с СД при 6,6% ложноположительных результатов. Дискриминантный анализ показал, что максимальные различия, выявляемые при биохимическом скрининге между нормой и патологией, наблюдаются на 11-й неделе беременности в 1-м триместре беременности и на 16-й неделе - во втором.
Вывод
1. Медианы содержания АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга в норме были уточнены по результатам исследования более 50 тысяч образцов крови пациенток при сроке 14-20 недель беременности. В таблицах 1 и 2 приведены параметры распределения относительной концентрации сывороточных маркеров во 2-м триместре беременности в норме. В 1999-2000 годах в ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН совместно c ООО «Мединформатика» (в настоящее время ООО «Интеллектуальные программные системы» (Санкт-Петербург)) была разработана и внедрена оригинальная компьютерная программа автоматического расчета риска болезни Дауна у плода («Программа мониторинга синдрома Дауна», ПМСД) по результатам скрининга уровня АФП и ХГЧ во 2-м триместре у беременных Санкт-Петербурга. Алгоритм обследования (рис. 1) основан на подсчете отношения правдоподобия, то есть вероятности, что результаты данной беременной принадлежат к нормальному распределению маркеров, а не к распределению для плодов с СД. Отношение правдоподобия вычисляется следующим образом: частоту встречаемости данного уровня маркера в распределении для плодов с СД делят на частоту встречаемости данного уровня в крови беременных с нормальным кариотипом плода. Распределение уровня сывороточного маркера в норме и распределение того же маркера при СД у плода характеризуются двумя параметрами: положением максимума распределения (медианой - М) и «шириной» распределения (стандартным отклонением - СО), разница между нормой и патологией определяется сдвигом медиан. Вычисление индивидуального риска возможно только после определения параметров распределений. Распределения уровня АФП (МОМ) и ХГЧ (МОМ) были предварительно построены для каждой недели беременности в используемом диапазоне сроков и после их логарифмической трансформации были определены параметры нормальных значений маркеров (рис. 2).
Таблица 1. Медианы содержания АФП и стандартное отклонение натурального логарифма АФП (МОМ) в крови беременных Санкт-Петербурга с 14 по 20-ю неделю беременности.
Срок беременности (нед.) АФП (нг/мл) Стандартное отклонение ln АФП (MOM) Число образцов
14 33,22 0,4270 3112
15 37,71 0,4056 17502
16 42,57 0,4032 22734
17 48,48 0,3991 12521
18 52,63 0,4194 4950
19 55,36 0,4405 1483
20 56,90 0,5081 506
Среднее значение 0,4290
Таблица 2. Медианы содержания ХГЧ, коэффициенты корреляции и стандартное отклонение натурального логарифма ХГЧ (МОМ) в крови беременных СПБ с 14 по 20-ю неделю беременности.
Срок беременности (нед.) ХГЧ (ед/мл) Коэффициенты корреляции с АФП Стандартное отклонение ln ХГЧ (MOM) Число образцов
14 55,42 0,0170 0,6020 3112
15 48,11 0,0501 0,5795 17502
16 41,01 0,0962 0,5779 22734
17 34,67 0,1169 0,5800 12521
18 31,15 0,0722 0,6053 4950
19 29,13 0,0004 0,6451 1483
20 29,00 0,0000 0,6764 506
Среднее значение 0,0589 0,6095
Ниже приведены величины стандартного отклонения (СО) для АФП и ХГЧ, полученные в нашем исследовании. Рядом указаны величины СО, применяемые в расчетах риска в Англии [Cuckle et al., 1995] (табл. 3). Ввиду однородности населения Санкт-Петербурга в 1997 году параметр «этническая принадлежность» не вводили. Во второй версии программы в 2008 году авторами введена возможность учета этнического фактора в связи с растущим числом обращений беременных иного происхождения (в основном азиатского). Из литературных данных следует, что у беременных других рас существуют смещения медиан сывороточных маркеров относительно европейских нормативных значений [Wald N.J. et al., 1998]. По мере исследования образцов крови беременных других этнических групп необходимо уточнять поправки и наличие смещения в среднем уровне сывороточных маркеров.
Показанием для применения инвазивной ПД с целью кариотипирования плода, являлся риск выше, чем 1:360 (0,28%). В нашем алгоритме был выбран пороговый риск, соответствующий риску рождения ребенка с СД у женщины, которая должна родить в 35 лет и 9 месяцев.
Рис. 1. Схема обследования беременных Санкт-Петербурга при сроке 15-18 недель на содержание АФП и ХГЧ.
Таблица 3. Среднее стандартное отклонение десятичного логарифма АФП и ХГЧ (в единицах МОМ) и коэффициенты корреляции, рассчитанные для нормальной беременности.
Санкт-Петербург (1997) Cuckle et al. (1995)
Маркер СО Коэффициент корреляции СО Коэффициент корреляции
АФП 0,1774 0,0589 0,1650 0,1220
ХГЧ 0,2543 0,0589 0,2470 0,1220
Как и следовало ожидать из сдвига распределений уровня маркеров в норме и патологии, при снижении порогового риска чувствительность возрастает (табл. 4), однако, одновременно возрастает и число ложноположительных результатов (ЛПР). Таким образом, с целью повышения чувствительности скрининга до 74% мы заведомо пошли на увеличение числа ЛПР до 6,7%.
Таблица 4. Выявляемость плодов с синдромом Дауна в зависимости от порогового риска при биохимическом скрининге в 15-18 недель беременности (N = 255)
Пороговый риск рождения ребенка с СД Выявляемость (%) (число выявленных плодов с СД / общее число плодов с СД у обследованных женщин)
1/360 (0,28 %) 74,5 (190/255)
1/250 (0,40 %) 63,9 (163/255)
1/200 (0,50%) 57,6 (147/255)
Единственным способом оценки риска в массовом скрининге является автоматизированный расчет риска рождения ребенка с СД, учитывающий все факторы, изменяющие концентрацию маркеров в крови беременных. При создании программного средства применялись стандартные математические методы и полученные на первом этапе массового скрининга экспериментальные данные.
Статистическая обработка результатов показала, что согласно критерию Колмогорова-Смирнова распределение АФП (МОМ) в логарифмическом масштабе соответствует Гауссову закону со средним значением логарифма АФП, равным 0,000 и медианой, равной - 0,0135. Распределение ХГЧ так же соответствует нормальному закону, среднее значение логарифма ХГЧ равно 0,000 и медиана равна 0,001 (рис. 2). На рисунке 4 приведена динамика медиан АФП и ХГЧ при нормальном кариотипе плода по кварталам 2002-2003 годов по результатам нашего исследования для тест-систем производства ООО «Алкор Био» (Санкт-Петербург). Каждая точка соответствует исследованию более 6500 образцов крови в квартал (диапазон - от 6501 до 7706 образцов). Медиана АФП ведет себя достаточно стабильно: ее изменение ограничивается 2 - 5 %. В то же время медиана ХГЧ снизилась в 1 квартале 2003 года до 0,875 МОМ.
Рис. 2. Распределение содержания альфа-фетопротеина (СО = 0,408) (1) и хорионического гонадотропина (СО = 0,585) (2) в крови беременных Санкт-Петербурга при сроке 14-20 недель в зависимости от логарифма относительного уровня маркера в МОМ.
Рис. 3. Динамика медиан АФП и ХГЧ (в МОМ) по кварталам 2002-2003 гг.
Это означает, что часть беременных с нормальным уровнем ХГЧ были идентифицированы как имеющие повышенный уровень ХГЧ и, соответственно, больший риск СД. С другой стороны, во 2-3-ем квартале медиана повысилась на 5-12%, что привело к недооценке уровня ХГЧ. Такой размах колебаний медианы должен корректироваться специалистами экспертной лаборатории, контролирующей проведение биохимического скрининга.
При измерении уровня АФП и ХГЧ в крови жительниц Санкт-Петербурга с помощью пяти типов тест-систем было показано, что при сроке 14 и 19-20 недель медианы являются нестабильными и не могут использоваться для надежного расчета риска (рис. 4). Таким образом, следует сузить диапазон проведения биохимического скрининга сроками 15-18 недель. После установления отсутствия влияния трех циклов замораживания/оттаивания на уровень изучаемых сывороточных маркеров, мы применили для получения медиан следующий подход - определение содержания маркера проводилось как в свежих сыворотках, так и в одно- или двукратно замороженных образцах из собранной коллекции с известными сроками беременности. Такой подход в 3-4 раза сокращает время получения устойчивых нормативных значений (устойчивые медианы требуют набора до 300 образцов для каждой недели беременности). В диагностические сроки беременности (15-18 недель) медианы АФП, полученные на автоматическом анализаторе ARCHITECT I2000SR значительно отличаются от указанных в инструкции величин, что не позволяет использовать последние в расчете риска СД у плода.
Рис. 4. Медианы АФП (МЕ/мл) для различных типов тест-систем при сроке 14 - 20 недель беременности.
Производитель также не предоставляет результатов исследования медиан ХГЧ для пренатального скрининга, говоря о необходимости их самостоятельного изучения. Методами корреляционного анализа показано, что существует высокая корреляция между уровнем АФП и ХГЧ, измеренным с использованием ручных тест-систем ИФА («Алкор Био») и полученным с помощью реагентов для автоматического анализатора ARCHITECT I2000SR (r = 0,8981, r2 = 0,8066; p < 0,0001 для АФП и r = 0,8910, r2 = 0,7047; p < 0,0001 для ХГЧ) (рис. 5).
Рис. 5. Корреляция уровня материнского сывороточного АФП (МЕ/мл), определенного с помощью тест-систем ИФА-АФП-1 ООО «Алкор Био» и реагентов для автоматического анализатора ARCHITECT I2000SR при сроке 15-18 недель беременности (n =645).
2. Распределение содержания АФП и ХГЧ в крови беременных при синдроме Дауна у плода. За 1997-2007 годы уровни АФП и ХГЧ были определены в 255 образцах сыворотки крови пациенток с синдромом Дауна у плода. Патологический кариотип был в 172 случаях установлен пренатально по результатам инвазивной диагностики в лаборатории ПД НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН и в 38 случаях - в цитогенетической лаборатории СПБДЦ(МГ). В 98 случаях исследование крови матери проводилось в скрининговые сроки, но по разным причинам (отказ беременной от дальнейшего обследования, несвоевременная явка к специалистам по пренатальной диагностике и др.) патологический кариотип (трисомия 21) был выявлен постнатально. Медиана АФП в крови матери для 255 случаев трисомии 21 у плода составила 0,7 МОМ, ХГЧ - 2,19 МОМ. Распределение значений АФП и ХГЧ при СД в нашем исследовании не удовлетворяет критериям Гауссова распределения, поэтому для его нормализации применяют логарифмическую трансформацию данных. В таблице 5 приведены параметры распределения логарифма АФП и ХГЧ в единицах МОМ при СД у плода, показано, что в крови беременных Северо-Западного региона оно является Гауссовым (тест на нормальность положительный, критерий Колмогорова-Смирнова - более 0,05).
Таблица 5. Параметры распределения логарифма АФП (МОМ) и логарифма ХГЧ (МОМ) при СД у плода с 14 по 20 неделю беременности (n=255).
Мы не выявили зависимости между возрастом матери и отклонениями в уровне АФП и ХГЧ при СД у плода в 14-20 недель беременности. Анализ результатов показал, что во всех возрастных группах различия в отклонениях медиан АФП и ХГЧ при СД у плода во 2-м триместре беременности (табл.6) не являются достоверными (р > 0,5). Различия в отклонениях от нормы уровня АФП и ХГЧ (в МОМ) при сроках беременности от 14 до 20 недель в крови пациенток с СД у плода не являются достоверными (р > 0,1). Таким образом, все результаты исследования уровня АФП и ХГЧ в крови матерей детей с СД могут быть объединены в единый массив.
Таблица 6. Содержание АФП и ХГЧ во 2-м триместре в крови беременных различных возрастных групп при синдроме Дауна у плода.
Возраст (лет) Число беременных АФП (МОМ) Диапазон колебаний АФП ХГЧ (МОМ) Диапазон колебаний ХГЧ
Исследование 255 образцов крови беременных с синдромом Дауна у плода позволило определить параметры и расстояние между вершинами распределений уровня маркеров для жительниц России в норме и при синдроме Дауна, которое используется в расчете индивидуального риска беременных.
3. Содержание АФП и ХГЧ при других хромосомных аномалиях плода. В рамках биохимического скрининга 2-го триместра было определено содержание АФП и ХГЧ у 25 пациенток с синдромом Эдвардса (трисомия 18). Медиана уровня АФП при СЭ у плода составила 0,7 МОМ, а медиана ХГЧ - 0,3 МОМ. Поскольку СЭ у плода практически всегда сопровождается выраженной внутриутробной задержкой развития и МВПР, то беременным с пониженным в два и более раза содержанием обоих маркеров рекомендовали УЗИ 2-го уровня (в специализированном пренатальном центре). При выявлении хотя бы одного ультразвукового маркера хромосомной патологии или пороков развития плода пациентки направлялись на кариотипирование клеток плода для исключения СЭ.
Наибольшие отклонения уровня биохимических маркеров наблюдались при триплоидии. Триплоидия - хромосомное нарушение, при котором аномальный кариотип содержит дополнительный гаплоидный набор чаще - отцовских, реже - материнских хромосом. Во 2-м триместре беременности такой кариотип ассоциирован с задержкой внутриутробного развития, маловодием, пороками развития мозга, конечностей и др. При гистологическом исследовании обнаруживаются патологические изменения формы и структуры ворсин хориона и плаценты, характерные для частичного пузырного заноса. Следствием этого является и характерный патологический уровень ХГЧ, одного из основных продуктов плаценты. Медиана относительного содержания АФП и ХГЧ в крови беременных с триплоидией у плода составляет 1,39 МОМ и 0,18 МОМ, соответственно. Было установлено, что при триплоидии существует два варианта отклонений. Наблюдается, с одной стороны, повышенный уровень АФП и резко повышенный уровень ХГЧ, и с другой - крайне низкие значения ХГЧ при нормальном или сниженном уровне АФП. Было высказано предположение о том, что подобные различия можно объяснить материнским или отцовским происхождением добавочного гаплоидного набора [Spencer K. et al., 2003]. Проверка данного предположения осложняется малой выборкой результатов исследования маркеров при выявлении триплоидии во 2-м триместре - всего 15 случаев за 20 лет.
Наши исследования показали, что далеко не все хромосомные аномалии плода связаны с патологическими изменениями уровня сывороточных маркеров. Биохимический скрининг 2-го триместра эффективно формирует группу риска по СД, СЭ и триплоидии. Другие хромосомные аномалии выявляются с чувствительностью не более 30-40%. Наибольшее число отклонений биохимических маркеров встречается у беременных с так называемым ограниченным плацентарным мозаицизмом (ОПМ). По результатам инвазивной пренатальной диагностики с 2001 по 2006 год из 74 случаев выявления мозаичного кариотипа в плаценте был подтвержден мозаичный кариотип в крови плода (истинный мозаицизм) только в 2-х случаях (2,7%) [Кузнецова Т.В. и др., 2006]. Беременные с ОПМ вносят свой вклад в ложноположительные результаты биохимического скрининга.
4. Содержание неконъюгированного эстриола и ингибина А в крови беременных в норме. Повышение эффективности биохимического скрининга может достигаться за счет повышения точности методов исследования. Например, можно снижать амплитуду колебаний медиан, связанных с технологическим колебанием параметров тест-систем, использовать более точные современные технологии определения концентрации маркерных белков. Можно также ввести в исследования дополнительные маркеры сыворотки крови, учет которых приведет, с одной стороны, к повышению чувствительности скрининга, а с другой стороны - к снижению числа ложноположительных результатов. При этом необходимо учитывать и экономическую составляющую биохимического скрининга - введение каждого маркера в систему массового скрининга существенно удорожает проведение профилактических мероприятий. В 1997 году ввиду отсутствия доступных коммерческих тест-систем для определения неконъюгированного эстриола (НЭ) биохимический скрининг в Санкт-Петербурге был организован как двойной тест. По результатам проведения тройного теста в зарубежных странах оценка роли НЭ в выявлении плодов с СД неоднозначна. Сильная корреляция между АФП и НЭ, выявленная в ходе обследования, не позволяет рассчитывать на резкое увеличение чувствительности. Максимальное увеличение чувствительности скрининга при учете уровня НЭ достигало 4-5 %. Однако позднее, с появлением работ, демонстрирующих снижение ЛПР до 0,5-1% в биохимическом скрининге с использованием квадро-теста, интерес к исследованию НЭ вернулся вновь. Уровень НЭ и ИНГА для расчета медиан исследовали в сыворотке крови 348 беременных, наблюдавшихся в НИИАГ им. Д.О.Отта в сроке 14-18 недель в 2005-2007 годах. Из результатов, полученных в нашей работе, следует, что содержание ИНГА в крови пациенток с 15 по 18 неделю беременности практически не зависит от срока. Данные, таким образом, подтверждают выводы предыдущих исследователей о том, что учет уровня ИНГА в качестве дополнительного биохимического маркера не приводит к повышению числа ложноположительных результатов, связанных с неточным определением срока беременности. Корреляционный анализ (табл. 7) уровня сывороточных маркеров крови беременных при сроке 15-18 недель показал их слабую зависимость друг от друга. Полученные в нашей работе предварительные медианы НЭ и ИНГА и корреляции позволяют начать пилотные исследования для оценки эффективности квадро-теста в формировании группы беременных высокого риска по развитию преэклампсии.
Таблица 7. Коэффициенты корреляции содержания сывороточных маркеров в крови беременных при сроке 14-20 недель (n = 348).
Маркеры АФП ХГЧ НЭ ИНГА
АФП 1 0,058 0,128 0,165
ХГЧ 0,058 1 - 0,027 0,51
НЭ 0,128 - 0,027 1 0,027
ИНГА 0,165 0,51 0,027 1
4. Содержание биохимических маркеров в крови пациенток в 9-13 недель беременности в норме и при синдроме Дауна у плода. Измерение концентрации связанного с беременностью белка сыворотки крови А (РАРР-А) проводилось у 5855 беременных женщин при сроках беременности 8 недель 3 дня - 13 недель 6 дней. Была исследована зависимость концентрации РАРР-А от срока беременности. Распределение концентрации РАРР-А и своб. ?-ХГЧ в 1-м триместре беременности в норме и при синдроме Дауна у плода представлены на рисунках 7 и 8.
Рис. 6. Распределение уровня РАРР-А в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МОМ) (n = 5855 и n = 55).
Согласно критерию Колмогорова-Смирнова распределение абсолютных значений уровня РАРР-А не является нормальным. Критериям нормального распределения полностью соответствует распределение относительных величин маркера после логарифмической транформации.
Рис. 7. Распределение уровня своб. ?-ХГЧ в крови беременных с 9-й по 13-ю недели при нормальном кариотипе и при СД у плода в зависимости от логарифма относительного уровня (МОМ) (n = 5855 и n = 55).
Ниже (рис. 8) приведены медианы РАРР-А в крови жительниц Петербурга в норме (1) и медианы производителя (2) (Wallac/Perkin Elmer).
Рис. 8. Динамика содержания РАРР-А в крови беременных в норме (1) при сроке 8 -13 недель и медианы производителя (2).
Всем беременным, обследованным в нашей работе, проводилось количественное измерение ТВП плода для оценки нормативных значений этого показателя у жительниц Санкт-Петербурга и его корреляции со сроком беременности. Для исключения дополнительных погрешностей, вносимых аппаратными сдвигами и связанных с индивидуальными особенностями оператора, все морфометрические исследования осуществлялись одним специалистом на одном оборудовании. На рисунке 10 представлены результаты анализа измерений ТВП у 1672 пациенток.
Рис. 9. Распределение величины ТВП плодов с нормальным кариотипом и с СД, измеренной у беременных Санкт-Петербурга в зависимости от логарифма относительного уровня (МОМ) (n = 1672 и n = 55).
«Сила» маркера определяется величиной сдвига вершины распределения в норме и при СД у плода, а число ложноположительных результатов - степенью перекрывания нормального и патологического распределений. Стандартное отклонение логарифма ультразвукового маркера - 0,515 (95% ДИ: 0,487-0,543) значительно ниже, чем у биохимических маркеров - 0,717 (95% ДИ: 0,569-0,864) и 0,663 (95% ДИ: 0,638-0,689). Эти результаты демонстрируют, почему при добавлении в расчет риска ТВП в качестве дополнительного маркера резко снижается число ЛПР (с 13,9% до 6,7%). Мы провели сравнение медиан ТВП, полученных при селективном комбинированном скрининге жительниц Санкт-Петербурга в НИИАГ им. Д.О.Отта и СПБДЦ(МГ), анализируя базы данных каждого центра за последние два года. Поквартальные колебания медиан ТВП (МОМ) в обоих случаях не превышали 3%, что говорит о высоком качестве ультразвукового скрининга в системе медико-генетической службы. В группе пациенток, обследованных в 9-13 недель беременности в рамках комбинированного ультразвукового и биохимического скрининга 1 триместра беременности, было выявлено 55 случаев СД у плода. При анализе отклонений содержания биохимических маркеров от нормы при трисомии 21 у плода в отличие от второго триместра была выявлена корреляция со сроком беременности. Наши исследования показали (табл. 8), что при СД отклонения содержания РАРР-А в крови матери в ранние сроки беременности выражены значительнее, чем в 13 недель беременности. Мы можем говорить только о тенденции, поскольку ввиду малого числа образцов различия не являются достоверными (р = 0,2732). Исследования в данном направлении необходимо продолжать для получения статистически достоверных результатов. Медиана
Таблица 8. Содержание РАРР-А и своб. ?-ХГЧ в крови матери при СД у плода в зависимости от срока беременности (n = 55).
Срок беременности (нед.) РАРР-А (МОМ) Своб. ?-ХГЧ (МОМ) Число образцов
9-10 0,29 2,02 8
11 0,29 1,70 14
12 0,29 1,79 22
13 0,56 2,18 11 уровня РАРР-А при СД у плода составила 0,33 МОМ, своб. ?-ХГ - 1,81 МОМ, а ТВП - 1,79 МОМ. Толщина воротникового пространства осталась неизвестной у восьми пациенток с СД у плода, в этих случаях указанная величина отсутствовала в протоколе УЗИ, либо УЗИ проводилось в неинформативные для измерения ТВП сроки. ТВП плода с СД увеличивается в 1,79 раза по сравнению с нормой, однако в 12 из 48 случаев (25%) нормальные значения ТВП снижали риск, рассчитанный по изменению уровня сывороточных маркеров. В трех из них комбинированный риск (0,36%; 0,189%; 0,154%) оказался ниже порогового (0,4%). Риск рождения ребенка с СД не был повышен при учете изменения только уровня биохимических маркеров в пяти случаях. Он составил 0,066; 0,253; 0,096; 0,306 и 0,123%.
Высокий риск по биохимическому скринингу (то есть только по результатам исследования сывороточных маркеров без учета ТВП) - более 1/250, наблюдался у 629 беременных. В обследуемой группе женщин при кариотипировании плода было выявлено 55 случаев трисомии 21. Анализ четырехпольных таблиц результатов биохимического скрининга в 1-м триместре показал, что чувствительность скрининга составила 90,9% (95% ДИ 80,07 - 96,98). Специфичность составила 89,8% (95% ДИ 88,95 - 90,54), выявлен 1 случай СД на 12-13 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина - 99,9%. Группа ложноположительных результатов составила 11%. Высокий риск по комбинированному (биохимическому и ультразвуковому) скринингу с учетом ТВП наблюдался только у 378 беременных. В работе проанализированы результаты обследования 5720 беременных с помощью двух биохимических и одного ультразвукового маркера. Чувствительность комбинированного скрининга составила 94,55% (95% ДИ 84,88 - 98,86), специфичность составила 94,25% (95% ДИ 93,62 - 94,84), выявлен 1 случай СД на 7-8 беременных из группы высокого риска, отрицательная предсказательная величина - 99,94%. Группа ложноположительных результатов составила 6,6 %. Важным моментом является значительно более высокая чувствительность скрининга СД в 1-м триместре среди беременных моложе 35 лет. Полученные нормативные значения в норме и при синдроме Дауна у плода, стандартные отклонения и коэффициенты корреляции легли в основу автоматизированной программы расчета риска по результатам комбинированного скрининга в 1-м триместре.
В группе обследованных в 1 триместре беременных в 11 случаях результатом пренатального кариотипирования материала плода явилось установление второго по частоте хромосомного нарушения - трисомии по 18 хромосоме (синдром Эдвардса). Медианы РАРР-А и своб. ?-ХГЧ при СЭ у плода снижены и равны 0,2 МОМ. Уровень обоих маркеров был снижен до 0,5 МОМ и более всего у 89 пациенток (3,42 %). Согласно выбранному критерию (относительное снижение обоих маркеров до 0,5 МОМ) СЭ выявляется в 72,7% случаев.
6. Связь отклонений сывороточных маркеров и неблагоприятных исходов беременности. Патофизиологические механизмы изменения уровня материнского сывороточного АФП и ХГЧ при СД у плода находятся в стадии изучения. Необъяснимое повышение уровня АФП наблюдается у 1-3 % обследованных при скрининге пациенток. Повышенный уровень одного или обоих маркеров в ряде работ связывают с возникшими позднее осложнениями беременности. В крови 129 женщин с нормальным кариотипом плода после биохимического скрининга в 15-18 недель измеряли уровни АФП и ХГЧ каждые 4 недели. Группы были сформированы по уровню отклонений АФП или ХГЧ в скрининговые сроки. Следует отметить, что у 88,2% беременных, имевших повышенные уровни АФП в 15-18 недель, к 24-й неделе уровень АФП оставался повышенным, но затем сравнялся с остальными группами. Анализ динамики уровня АФП, в связи с ростом его содержания в группе сравнения и стабильностью среднего содержания АФП в крови беременных 2-й группы, показал, что достоверных различий в уровне АФП при сроке после 24 недель не наблюдалось. При сопоставлении исходов беременности обследуемых женщин было показано, что повышенное содержание АФП или ХГЧ в крови беременных в 15-18 недель является маркером раннего развития плацентарной недостаточности и последующей гипотрофии плода [Гагарина А.В. и др., 2002] . Корреляционный анализ показал прямую зависимость между уровнем ХГЧ у пациенток в 20 и 28 недель беременности и наличием у них в дальнейшем гипотрофии новорожденного (r=0,972; p<0,006 и r=0,836; p=0,038, соответственно). Опыт массового биохимического скрининга во 2-м триместре позволил нам предложить следующий алгоритм ведения беременных с измененными МСБ (рис. 10).
Рис. 10. Алгоритм ведения беременных с нормальным кариотипом плода и измененными значениями МСБ во 2-м триместре.
При изолированном повышении АФП или ХГЧ более 2-х МОМ во 2-м триместре беременности рекомендуется проведение допплерометрии при сроке 24 недели [Гагарина А.В. и др., 2002]. В 8-13 недель беременности также существует выраженная корреляция между низкими уровнями РАРР-А в крови матери и неблагоприятным исходом беременности. Содержание свободной ?-субъединицы ХГЧ меньше связано с неблагоприятным прогнозом течения беременности. Низкие значения своб. ?-ХГЧ, главным образом, ассоциированы с хромосомной патологией плода и составляют всего 0,24 МОМ при СЭ у плода и еще более снижены при триплоидии, но встречаются достаточно редко - всего в 1,9% (112 случаев).
7. Биохимический скрининг при многоплодной беременности и после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий. При проведении массового биохимического скрининга во 2-м триместре в Санкт-Петербурге было исследовано 399 образцов крови беременных с двойней. Средний уровень АФП при двойне с нормальным кариотипом плода составил 2,15 МОМ (СО 0,5221; 95% ДИ: 1,669-2,635), а ХГЧ - 2,54 МОМ (СО 0,4251; 95% ДИ: 2,15 - 2,94). За 15 лет во 2-м триместре сывороточные маркеры были исследованы только в трех случаях СД у одного плода из двойни. В последние годы увеличилось число многоплодных беременностей после применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В группе беременных после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) выявлено снижение содержания маркеров, оно не достигает достоверного, но наблюдается тенденция к снижению уровня АФП и ХГЧ при беременности двойней после ЭКО. Содержание НЭ в крови матери при двойне не зависит от применения ВРТ.
В 1-м триместре при беременности двойней с нормальным кариотипом (n = 59) средний уровень РАРР-А составил 2,45 МОМ, а своб. ?-ХГЧ - 2,32 МОМ, соответственно. За время исследований в 1-м триместре нами были получены данные о содержании СМ 1-го триместра в крови 18 беременных после ЭКО. Все случаи относятся к одноплодной беременности с нормальным кариотипом плода. Средний уровень РАРР-А составил 1,37 МОМ, а своб.?-ХГ - 1,53 МОМ. Ввиду малости выборки отклонения маркеров не являются достоверными. Группа обследованных пациенток является крайне неоднородной. Применявшиеся методы включали в себя метод ВРТ с применением донорской яйцеклетки, искусственной инсеминации и ИКСИ (внутриплазматический перенос сперматозоидов). Результаты исследования сывороточных маркеров у жительниц Санкт-Петербурга и данные литературы свидетельствуют о значительно меньшем влиянии применения ЭКО на уровень маркеров в 1-м триместре беременности по сравнению с отклонениями маркеров 2-го триместра. Требуется значительное увеличение выборки для получения статистически достоверных результатов. Применение в расчетах риска рождения ребенка с СД поправочных коэффициентов на число плодов без учета снижения медиан у беременных с использованием ВРТ не является корректным. Многообразие методов ВРТ не позволяет использовать в программах расчетов универсальную коррекцию медиан сывороточных маркеров. Таким образом, для профилактики СД у плода беременным после ЭКО рекомендуется проведение комбинированного скрининга в 1-м триместре.
3. Обсуждение результатов исследования
Эффективность пренатального скрининга оценивается по практическим результатам. При биохимическом скрининге хромосомной патологии основным критерием эффективности являются результаты кариотипирования плода. Непременным условием оценки эффективности является совпадение характеристик обследованных пациентов и характеристик популяции, в которой планируется дальнейшее проведение массового скрининга. При большой разнице в возрасте беременных исследуемых групп, оценки эффективности пренатального скрининга хромосомных аномалий у плода будут существенно различаться. Кроме того, эффективный скрининговый тест должен легко воспроизводиться в разных диагностических центрах и регионах.
Разработанные нами параметры для проведения комбинированного биохимического и ультразвукового скрининга при сроке 9-13 недель позволили достичь на практике 94% выявления плодов с СД при величине ложноположительных результатов 6,6%. Среди беременных старше 35 лет в группу высокого риска было отобрано 89% пациенток - положительные результаты получены у 40 из 45 беременных старше 35 лет с трисомией 21 у плода (истинноположительные результаты комбинированного скрининга). Среди молодых беременных (до 35 лет) у двух пациенток с трисомией 21 у плода не был выявлен повышенный риск по биохимическому скринингу в 9-13 недель. Их «биохимический» риск составил 1/395 = 0,253% и 1/1505 = 0,066%, но в связи с увеличением ТВП (до 1,84 МОМ и 4,77 МОМ, соответственно) риск по результатам комбинированного скрининга оказался выше порогового - 0,4%. В целом, в молодой группе было выявлено 12 из 12 возможных случаев СД (100%). Несмотря на небольшую выборку, наблюдается значительное повышение эффективности комбинированного скрининга в 1-м триместре среди молодых женщин (рис. 11). Резервы увеличения эффективности массового комбинированного скрининга состоят в стандартизации протоколов УЗИ в учреждениях первичного звена и измерении ТВП у всех беременных. В 2008 году у 15% пациенток, направленных на комбинированный скрининг 1-го триместра, величина ТВП отсутствовала в направлении и/или протоколе УЗИ в 10-13 недель беременности.
Рис. 11. Чувствительность комбинированного скрининга (1) в 1 триместре и биохимического скрининга (2) во 2-м триместре в разных возрастных группах.
При проведении биохимического скрининга необходим четкий контроль клинико-диагностических критериев. Любые изменения в реагентах или компонентах тест-систем, некорректное использование программных средств, различия в коэффициентах уравнений, выбранных для аппроксимации зависимости медиан от срока беременности, отражаются на относительном уровне маркеров, а, следовательно, на оценке индивидуального риска. Рассчитанные с помощью разных программ значения риска не должны совпадать с точностью до третьего знака после запятой, но хорошим критерием эффективности скрининга служит размер группы ложноположительных результатов. В снижение эффективности скрининга вносят свой немалый вклад временные колебания медиан маркера в МОМ, зависящие от стабильности производства реагентов и правильности установленных в программе нормальных значений и поправочных коэффициентов. При большой выборке на общей чувствительности скрининга в течение года поквартальные колебания медиан не сказываются. При использовании нескольких маркеров ошибка в расчете риска будет зависеть от комплекса погрешностей измерения каждого параметра и точности установления его медианы. При колебаниях медианы в пределах 10 % в одном направлении индивидуальный риск беременной меняется в 4 раза [Nix B. et al., 2007]. Если пределом колебаний медианы установить величину 5%, то риск может измениться в 1,8 раза. Процесс контроля качества лабораторных исследований обычно ограничивается стандартными методами мониторинга самого исследования. Программы внешнего контроля качества сегодня позволяют только оценить правильность исследования содержания гормональных и биохимических маркеров и не распространяются на параметры расчета, используемые в программах, с помощью которых оценивается риск рождения ребенка с СД. В итоге достоверные лабораторные результаты, полученные опытным врачом клинической лабораторной диагностики, могут оказаться совершенно непригодными при их неправильной интерпретации или неверно использованной программе оценки этих данных. Динамика медиан использованных маркеров была проанализирована вместе со специалистами лабораторной диагностики диагностического центра и специалистами отдела контроля качества производителя. Мониторинг текущих медиан позволяет не только вовремя заметить дрейф средних значений, обнаружить, оценить и исключить наличие систематических лабораторных погрешностей, но и выявляет особенности поставляемых партий реагентов. Таким образом, анализ результатов массового скрининга за длительный период позволяет осуществить обратную связь лаборатории с производителем и поднять уровень качества технологического процесса производства реагентов.
На эффективность профилактики ВПР влияет взаимодействие специалистов УЗД и медико-генетической службы при проведении биохимического скрининга. Как показано ранее, основным фактором, влияющим на уровень сывороточных маркеров, является определение срока беременности на момент взятия образца крови для пренатального биохимического скрининга. Ошибка даже в 2-3 дня может сыграть серьезную роль в случае получения риска, лежащего близко к пороговому значению. Определенные расхождения в сроках существуют всегда. Объясняется это несколькими причинами. Во-первых, разные типы ультразвуковых аппаратов имеют разную разрешающую способность и разную погрешность измерения. Во-вторых, даже на одном оборудовании разные специалисты будут получать разные результаты. Это объективная реальность - существует определенный индивидуальный разброс в измерениях (в установке курсора, в угле установки датчика плоскости измерения и т.д.). Результаты будут хорошо воспроизводиться в одних и тех же руках, а по отношению к некоему «эталону» может быть минимальный, но отчетливый сдвиг. В-третьих, стандарты соответствия сроков беременности определенным размерам плода различны в оценках разных авторов. Наиболее ярко это выражается в 1 триместре беременности. В программе расчета индивидуального риска «Life Cycle» при внесении даты УЗИ и копчико-теменного размера плода автоматически выбирается определенный срок беременности. В процессе эксплуатации программного обеспечения мы встретились с несоответствием срока беременности, который устанавливает специалист УЗИ по величине КТР, сроку, который устанавливается в программе. Необходима стандартизация и согласование всех параметров УЗИ при проведении массового скрининга в регионе.
На эффективность скрининга влияет выбор сроков исследования биохимических маркеров. Анализ полученных баз данных методом дискриминантного анализа показал, что оптимальным сроком проведения скрининга в 1-м триместре является 11 недель. Эффективность комбинированного скрининга достигает также высокого уровня при его двухэтапном проведении: производится определение уровня РАРР-А и своб. ?-ХГ при сроке 9-10 недель, а окончательный расчет индиви
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
