Методы определения активности, изучение кинетических параметров ферментативных реакций. Методы выделения и очистки ферментов. Изучение субклеточной локализации. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов. Определение активности трипсина.
Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками. Титрометрическое определение активности каталазы Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь). Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных): опыт контроль 20 мл вытяжки фермента 20 мл вытяжки фермента - Нагревание 10 мин на кипящей водяной бане 25 мл 0,1 н перекиси водорода 25 мл 0,1 н перекиси водорода Инкубация 30 минут при комнатной температуре 5 мл 10 % H2SO4 5 мл 10 % H2SO4 Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Фотометрическое определение активности трипсина Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, паранитроанилин, 100 мкМ раствор бензоил-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА) в фосфатном буфере *, раствор трипсина (10 мкг/мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl, ацетон. Рабочий раствор готовят путем стократного разведения маточного раствора дистиллированной водой (500 мкл маточного раствора трипсина помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят дистиллированной водой до метки). 1. Для этого в 11 пробирках готовят растворы п-НА разных концентраций путем смешивания 100 мкМ раствора п-НА и дистиллированной воды по следующей схеме. Флюориметрическое определение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ*, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR)**, 1 н HCl, хлороформ, печень животного, реактив Фолина, реактивы А и В для метода Лоури. * Приготовление раствора ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ растворяют в 5 мл дважды перегнанного этилового спирта. Гомогенат хранят на льду. Опыт ( - ) Контроль ( ) 150 мкл буфера 140 мкл буфера 50 мкл гомогената 50 мкл гомогената - 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) Преинкубация 8 минут при 37 °С 50 мкл раствора DNS-FLR 50 мкл раствора DNS-FLR Инкубация 30 мин при 37 °С 50 мкл 1 н HCl 50 мкл 1 н HCl После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течении 60 сек.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
