Поверхневі компоненти вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів - Автореферат

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені О.О. Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О. Науковий керівник доктор медичних наук, професор, академік НАН України, член-кореспондент АМН України Широбоков Володимир Павлович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології. Захист відбудеться 18.05.2006 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.003.01 при Національному медичному університеті імені О.О.Не зважаючи на вагомі успіхи щодо ерадикації поліомієліту, інші ентеровірусні інфекції, у тому числі й спричинені вірусами Коксакі В, продовжують відігравати значну роль в патології людини (Лидский П.В., Агол В.И., 2006). В даному аспекті особливо важливе значення має питання дисоціації вірусів за біологічними властивостями. Насьогодні існує чимало наукових праць, присвячених дослідженню феномену дисоціації вірусів Коксакі на бентонітові варіанти (Абент та Абент-). Предмет дослідження: віруси Коксакі В (1-6 серотипи), бентонітові варіанти вірусів, фактори, які впливають на ефективність ліофілізації вірусів Коксакі В, оптимізація методів електронної мікроскопії для вивчення вірусної поверхні. Вперше показано диференціацію бентонітових варіантів вірусів Коксакі В за здатністю до агрегації та встановлено залежність даних властивостей вірусів від РН середовища: варіант Абент у більшості агрегує при кислих значеннях РН, на відміну від варіанту Абент-, який здатен до агрегації як при кислих, нейтральних, так і при слаболужних РН.З метою отримання максимально можливого обємного зображення вірусів, підвищення роздільної здатності електронного мікроскопу та вивчення деталей вірусних поверхонь застосовували метод косого напилення (відтінення) вірусів у вакуумному універсальному посту (ВУП-5). Для вирішення цієї проблеми було розроблено спосіб їх виявлення у матеріалі з низьким титром шляхом використання на поверхні плівок-підложок бентоніту - природного алюмосилікату з групи глинистих мінералів монтморилонітів, який має високі сорбційні властивості щодо цих вірусів (рис. В результаті аналізу 100 вірусних часточок із кожної групи вірусів та проведення статистичної обробки встановлено, що після концентрування розміри у бентонітових варіантів вірусів Коксакі В є однаковими і становлять: Коксакі В-6 (Абент ) - 27,9±0,05, Коксакі В-6 (Абент-) - 27,89±0,1; Коксакі В-2 (Абент ) - 28,4±0,1, Коксакі В-2 (Абент-) - 28,1±0,1. Компютерний аналіз електронограм підтвердив, що розміри дисоціантів вірусів Коксакі В-6 залишаються однаковими: Коксакі В-6 (Абент ) - 29,17±0,1, Коксакі В-6 (Абент-) - 29,12±0,1. В результаті цих досліджень було встановлено, що компоненти клітин приєднувалися до поверхні вірусів Коксакі В (варіант Абент ), і, у останніх при електронно-мікроскопічному дослідженні виявлялись структури, абсолютно ідентичні тим, що були встановлені у вірусів безпосередньо після репродукції (неконцентрованих та неочищених).В дисертаційній роботі розвязано актуальну наукову задачу - встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В, після їх репродукції залишаються клітинні компоненти ліпідної природи, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні капсиду вірусів Коксакі В знаходяться надкапсидні компоненти, представлені ліпідвмісними залишками мембран хазяйських клітин. Показано, що надкапсидні компоненти контрастуються 1% осмієвою кислотою, а віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що підтверджує їх ліпідну природу. Доведено, що клітинні компоненти на поверхні вірусів Коксакі В підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів. Це підтверджується тим, що віруси значно довше не втрачають інфекційності при зберіганні в різних температурних режимах та після ліофілізації, зменшується ефективність їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В дисертаційній роботі розвязано актуальну наукову задачу - встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В, після їх репродукції залишаються клітинні компоненти ліпідної природи, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Вдосконалена методика електронно-мікроскопічного дослідження вірусів та розроблений спосіб ліофілізації з метою довготривалого збереження вірусів Коксакі В.

1. Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні капсиду вірусів Коксакі В знаходяться надкапсидні компоненти, представлені ліпідвмісними залишками мембран хазяйських клітин. Виявлені компоненти не входять до структури капсиду, їх звязок з білковою оболонкою може бути перерваний при центрифугуванні.

Показано, що надкапсидні компоненти контрастуються 1% осмієвою кислотою, а віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що підтверджує їх ліпідну природу. Здатність до асоціації з залишками клітинних мембран характерна лише для ентеровірусів з високим афінітетом до бентоніту (варіант Абент ).

2. Доведено, що клітинні компоненти на поверхні вірусів Коксакі В підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів. Це підтверджується тим, що віруси значно довше не втрачають інфекційності при зберіганні в різних температурних режимах та після ліофілізації, зменшується ефективність їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками. Після обробки органічними розчинниками, навпаки, зменшується термін збереження їх інфекційності та підвищується ефективність нейтралізації антитілами (на 36-79%), що свідчить про захисний характер поверхневих надкапсидних структур.

3. Вдосконалено методику електронно-мікроскопічного дослідження поверхневих структур вірусів Коксакі В. Досліджено ефективність використання різних типів контрастерів та їх комбінацій. Розроблено спосіб підготовки зразків для електронної мікроскопії з використанням формварових плівок-підложок, оброблених бентонітом, що дозволило вивчати морфологію вірусів в неконцентрованому стані, безпосередньо після завершення їх репродукції.

4. Встановлено, що бентонітові дисоціанти (Абент та Абент-) вірусів Коксакі В-6 відрізняються за здатністю до агрегації. Показано, що варіант Абент- агрегує лише при кислих значеннях РН, на відміну від варіанту Абент , у якого дані властивості виражені при кислих, нейтральних та 18 слаболужних РН. Виражена здатність до агрегації у варіанта Абент можливо повязана з його властивістю приєднувати клітинні компоненти. 5. Вдосконалено методику сублімаційного висушування вірусів Коксакі В шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті. Показано, що після ліофілізації в не звільненому від клітинних компонентів стані, варіант Абент вірусів Коксакі В-3 та Коксакі В-6 є більш стійким до сублімації вологи та до інших агресивних факторів, які супроводжують процес ліофілізації і значно довший час зберігає свою інфекційність. Запропоновано спосіб ліофільного висушування, який може бути використаний для більш тривалого збереження музейних штамів ентеровірусів.

У періодичних виданнях, затверджених ВАК України: 1. Бобир В.В. Сучасні уявлення про хімічний склад та фізико-хімічні властивості ентеровірусів // Актуальні проблеми медицини та біології. - Київ, 2003. Т.1. - С. 283-292.

2. Бобир В.В. Вплив органічних розчинників на ефективність нейтралізації вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Збірник наукових праць співробітників КМАПО імені П.Л. Шупика. Київ, 2005. - С. 301-305.

3. Бобир В.В., Олексієнко І.П. Сучасні підходи до стабілізації ентеровірусів шляхом ліофільного висушування // Актуальні проблеми медицини та біології. Київ, 2005. Т.1. - С. 381-390. (Здобувач виконав експериментальну роботу - провів дослідження виживання ентеровірусів після ліофілізації та провів статистичну обробку одержаних результатів). 4. Широбоков В.П., Бобир В.В. Ліофілізація ентеровірусів та їх бентонітових варіантів // Журн. АМН України. - 2005. Т.11. - №2. - С. 377-381. (Здобувач удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів, отримав електронно-мікроскопічні знімки препаратів, підготував матеріали для публікації ).

Патенти: 1. Пат. 9405 Україна, МКИ В01J37/32. Спосіб ліофілізації ентеровірусів: Пат. 9405 Україна, МКИ 01N33/569. Широбоков В.П., Бобир В.В. (Україна); Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - №03222; Заявл. 07.04.2005. Опубл. 15.09.2005. Бюл. №9. (Здобувач здійснив патентно-інформаційний пошук відносно даної проблеми, удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті, провів експериментальне

19 випробування цього методу з використанням вірусів Коксакі В-3 в якості модельних).

2. Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Спосіб підвищення сорбційної здатності плівок-підкладок в електронній мікроскопії ентеровірусів: Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Бобир В.В., Широбоков В.П., Войцеховський В.Г., Олексієнко І.П. (Україна); Національний медичний університет імені. О.О. Богомольця. - №03751; Заявл. 20.04.05; Опубл. 17.10.2005. Бюл. №10. (Здобувач провів аналіз патентно-інформаційний пошук, виконав експериментальну частину досліджень та приймав участь у підготовці матеріалів для публікації).

Інші видання: 1. Бобир В.В., Широбоков В.П. Поверхневі структури вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Науковий вісник Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. - 2005. - №1-2. - С. 9-12. (Здобувач виконав частину експериментальних досліджень, провів аналіз одержаних результатів, підготував матеріали для публікації).

2. Широбоков В.П., Бобир В.В. Нові уявлення про морфологічні особливості вірусів Коксакі В та їхселекціонованих варіантів // Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній та ветеринарній медицині: матеріали міжнародної наукової конференції, присвяченої 160-літтю з дня народження лауреата Нобелівської премії І.І. Мечнікова (27-29 листопада 2005 р.). -Харків.: Інститут мікробіології і імунології імені І.І. Мечнікова. Електронна адреса: www. hniimi.da.ru. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури відносно даного питання, виконав експериментальну частину роботи, що включала вірусологічні та електронно-мікроскопічні методи дослідження і підготував матеріали для доповіді).

3. Бобир В.В., Широбоков В.П. Гетерогенність популяції вірусів Коксакі В з позиції їх асоціації із компонентами клітинних мембран // Наука і освіта 2005: матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції (17-21 лютого 2005 р.). - Дніпропетровськ: 2005, Т.10. - С. 11-13. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури щодо даного питання, виконав частину експериментальних досліджень, підготував матеріали для публікації).

4. Бобир В.В. Ефективність ліофільного висушування вірусів Коксакі В та їх генетичних селекціонованих варіантів // Актуальні проблеми сучасної медицини: матеріали 59 міжнародної науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (6-8 квітня 2005 р.). - Київ: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, 2005. - С. 58.

20