При низкой оригинальности работы "Потенціалактивовані калієві струми нейронів спінальних гангліїв та гіпокампу щурів: онтогенез і роль у гальмівній синаптичній передачі", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Институт фізіології ім. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Потенціалактивовані калієві струми нейронів спінальних гангліїв та гіпокампу щурів: онтогенез і роль у гальмівній синаптичній передачі Офіційні опоненти: Доктор медичних наук, керівник Центру докліничного вивчення лікарських засобів Фармакологічного комітету МЗ України Соловйов Анатолій Іванович Захист відбудеться “23“ лютого 1999 р. о 14 годині на засідані спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім.Це визначається важливою роллю каналів калієвого струму в регуляції збудливості нейронів, включаючи спроможність інтегрувати синаптичні сигнали, змінювати рефрактерний період, визначаючи частоту генерації потенціалів дії, а також модулювати тривалість та форму окремого потенціалу дії в нервових терміналях, впливаючи завдяки цьому на викид нейромедіатору (Thompson and Aldrich, 1980; Adams and Galvan, 1986). Ці інтегративні властивості калієвих струмів визначаються їхніми специфічними параметрами: рівнем стаціонарної інактивації калієвих каналів при потенціалі спокою клітини, порогом їхньої активації, швидкістю інактивації, а також щільністю струму. Дослідження потенціалкерованих калієвих струмів центральних нейронів ссавців встановили доволі специфічну послідовність змін щільності калієвих струмів в період ранього онтогенезу (Barish, 1995; Klee et al., 1995). Так, функціональна роль калієвих каналів в нейронах гіпокампу звязується з їхньою спроможністю модулювати пачечну активність нейронів гіпокампу (Nakajima et al., 1986; Segal et al., 1984; Storm, 1987; Wu and Barish, 1992). Використовуючи метод позаклітинної електричної стимуляції в умовах відсутності генерації потенціалу дії (в розчині, що містить тетродотоксін, ТТХ), дослідити вплив блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів на гальмівні постсинаптичні струми окремих синаптичних терміналей нейронів гіпокампу.Так, зовнішня аплікація 2ММ 4-АП призводила до блокування амлітуди А-струму на 80± 7% (n=8), а поволі-інактивуючегося струму на 55 ± 6% (n=8); неінактивуючийся струм був не чутливий до 4-АП. ТЕА в концентрації 10 ММ блокував поволі-інактивуючийся струм на 40 ± 5% (n=12), а К-струм на 70 ± 5% (n=12) і не викликав вагомої модифікації амлітуди А-струму. Для розділення калієвих струмів нейронів гіпокампу були застосовані протоколи стимуляції аналогічні тим, що використовувалися для розподілу калієвих струмів в сенсорних нейронах. Для визначення величини стаціонарної активації калієвих каналів величина провідності визначалася як відношення амлітуди струму під час тестуючего зміщення потенціалу до електрорухаючії сили (Vm - Ek), де Ek - рівноважний потенціал для іонів калію, Vm - амлітуда тестуючего потенціалу. Експериментальні точки для стаціонарного рівня активації А-струму, поволі-інактивуючегося калієвого струму та струму затриманого випрямлення задовільно описувалися рівнянням Больцмана з параметрами V1/2=-22.1 МВ, k=10.Аналіз калієвої провідності соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв і гіпокампу показує наявність принаймні трьох типів потенціалкерованих калієвих струмів в досліджених типах клітин. Калієві струми нейронів спінальних гангліїв по своїм стаціонарним, кінетичним та фармакологічним параметрам не відрізняються суттєвим образом від відповідних типів калієвих струмів нейронів гіпокампу. Щільність калієвих струмів IFK і ISK соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв статистично достовірно збільшується протягом перших двох тижнів постнатального періоду, в той час як щільність IK-струму зменшується на тому ж інтервалі. Блокатори потенціалкерованих калієвих каналів 4-АП і ТЕА викликають збільшення середньої амлітуди ВГПСС GABAA рецепторів синаптичної терміналі нейронів гіпокампу, при цьому 4-АП (5ММ) викликає значно більший ефект (90± 30%) в порівнянні з 20ММ ТЭА (20± 5%). Квантовий аналіз гальмівної синаптичної передачі культивованих нейронів гіпокампу на рівні окремої синаптичної терміналі в даних експериментальних умовах показує адекватність застосування моделі Катца для опису мультивезікулярного викиду медіатору в гальмівних синапсах гіпокампу ссавців.
Інтегральний калиєвий струм соматичної мембрани спінальніх гангліїв щурів практично в усіх досліджених клітинах міг бути поділений на три різних компонента, незалежно від віку тварини. Для розділення калієвих струмів були використані протоколи стимуляції, в подробиці описані раніше (Klee et al., 1995; Васильев, Федулова и Веселовский, 1998; Fedulova et al., 1998). Реєстрація проводилася з використанням внутрішньоклітинного розчину KF/Tris-Cl, що не містить ЕГТА, але з достатньою концентрацією іонів фтору (150 ММ) для повного блокування кальційзалежного калієвого струму (Kostyuk et al., 1975).
Постійні часу активації всіх трьох типів калієвих струмів вимірювалися шляхом опису висхідної частини кривої струмів експотенційною функцією в четвертому ступені. Апроксимація інактивації транзиєнтних калієвих струмів проводилася з використанням моноекспотенційної функції для швидко-інактивуючегося струму та двухекспотенційної функції для поволі-інактивуючегося струму.
Дані залежності стаціонарної активації та інактивації від величини мембранного потенціалу для швидко-інактивуючегося, поволі-інактивуючегося та неінактивуючегося калієвого струму затриманого випрямлення. Безперервна лінія представляє апроксимацію даних рівнянням Больцмана з параметрами для активації і інактивації відповідно: V1/2=-20 МВ, k=11.8 МВ; V1/2=-84 МВ, k=-9.8 МВ (рис. 1Б); V1/2=-12.8 МВ, k=13.4 МВ; V1/2=-54.6 МВ, k=-12 МВ (рис. 2Б); V1/2= 15.3 MV, k= 12.5 MV (рис. 3Б).
Дослідження фармакологічної чутливості потенціалкерваних калієвих струмів соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв до блокаторів калієвих каналів 4-АП і ТЕА виявило різний ступінь фармакологічної чутливості згаданих струмів до блокаторів калієвих каналів. Так, зовнішня аплікація 2ММ 4-АП призводила до блокування амлітуди А-струму на 80± 7% (n=8), а поволі-інактивуючегося струму на 55 ± 6% (n=8); неінактивуючийся струм був не чутливий до 4-АП. ТЕА в концентрації 10 ММ блокував поволі-інактивуючийся струм на 40 ± 5% (n=12), а К-струм на 70 ± 5% (n=12) і не викликав вагомої модифікації амлітуди А-струму.
Канали калиєвої провідності у культивованих нейронах гіпокампу
Були досліджені потенціалкеровані канали калієвого струму у тривало культивованих (10-18 днів) нейронах гіпокампу. Для розділення калієвих струмів нейронів гіпокампу були застосовані протоколи стимуляції аналогічні тим, що використовувалися для розподілу калієвих струмів в сенсорних нейронах.
Активація потенціалкерованих калієвих струмів в нейронах гіпокампу задовільно описувалася експотенційною функцією, зведеної у четвертий ступінь. Потенціалакервані калієві струми істотним образом відрізнялися за швидкосттю їхньої активації, хоча ця відмінність декілька зменшувалася при більш позитивних значеннях мембранного потенціалу. Постійні часу активації для швидко-, поволі- та неінактивуючегося калієвих струмів монотонно зменшувалися при збільшенні мембранного потенціалу і складали відповідно 2 мс, 12 мс, 45 мс при Vt=-10 МВ, а також 1.5 мс, 6 мс і 10 мс при Vt= 50 МВ.
Інактивація швидко-інактивуючегося струму апроксимувалась однією експонентою. Постійна часу значно зменшувалася при збільшенні деполярізуючего зміщення потенціалу від 37 мс при -50 МВ до 17 мс при 50 МВ. В той же час інактивація поволі-інактивуючегося калієвого струму найкращим чином описувалася сумою двох експонент. Постійна часу повільної (швидкої) експоненти варіювала від 4500 мс (550 мс) при Vt=-20 МВ до 1800 мс (300 мс) при Vt= 40 МВ.
Для визначення величини стаціонарної активації калієвих каналів величина провідності визначалася як відношення амлітуди струму під час тестуючего зміщення потенціалу до електрорухаючії сили (Vm - Ek), де Ek - рівноважний потенціал для іонів калію, Vm - амлітуда тестуючего потенціалу. Експериментальні точки для стаціонарного рівня активації А-струму, поволі-інактивуючегося калієвого струму та струму затриманого випрямлення задовільно описувалися рівнянням Больцмана з параметрами V1/2=-22.1 МВ, k=10. 8 МВ; V1/2=-4.5 МВ, k=10. 6 МВ; V1/2=18.5 МВ, k=11. 5 МВ, де V1/2 - потенціал половиної активації, k - коефіцієнт крутизни. Відповідні дані залежності рівня стаціонарної інактивації від величини мембраного потенціалу були описані рівнянням Больцмана з параметрами V1/2=-80.1 МВ, k=-7.1 МВ; V1/2=-77.1 МВ, k=-10. 4 МВ.
Потенціалкеровані калієві струми в тривало культивованих нейронах гіпокампу володіли різним ступенем фармакологічної чутливості до блокаторів калієвих каналів 4-АП і ТЕА. На рис. 5 показана дія даних блокаторів калієвих каналів на інтегральні калиєві струми, а також на калієвий струм А-типу.
Швидко-інактивуючийся калієвий струм був не чутливий до позаклітинного прикладання 10 ММ ТЕА. В той же час 4-АП в концентрації 1ММ блокував А-струм на 20%, а в концентрації 5ММ на 75%. Поволі-інактивуючийся калієвий струм блокувався 10 ММ ТЕА на 55%. Позаклітинне прикладання 4-АП в концентрації 1ММ призводило до блокування поволі-інактивуючегося струму на 45%, а в концентрації 5 ММ на 80%. Неінактивуючийся калієвий струм не володів значущою фармакологічною чутливістю до 4-АП, проте блокувався ТЕА. Додання в позаклітинний розчин 10ММ ТЕА призводило до зменшення амлітуда цього струму на 70%.
Отримані експериментальні дані по дослідженню калієвої провідності в нейронах гіпокампу і спінальних гангліїв зазначають, що потенціалкеровані калієві струми в нейронах гіпокампу за своїми стаціонарними, кінетичними та фармакологічними властивостями не відрізняються істотним образом від відповідних калієвих струмів сенсорних нейронів, незважючи на приналежність останніх до периферічної нервової системи.
Зміни калієвої провідності нейронів спінальних гангліїв в ранньому постнатальному онтогенезі
Дослідження специфічних змін в розподілі описаних вище типів калієвих струмів, що відбуваються впродовж двох перших тижнів після народження тварини було зроблене із застосуванням експериментальних підходів докладно описаних раніше (Fedulova et al., 1994). Щільності калієвих струмів були зміряні для трьох вікових груп тварин: 1, 5-6 та 14-15 днів постнатального розвитку. В кожній групі було досліджено по 50 нейронів.
Таблиця 1
Вікова Група Щільність струму, ПА/ПФ Ємність мембрани, ПФ Площа проекції соми, мкм2
Примітки. Дані в таблиці представлені у виді середнє значення ± середнє квадратичне відхилення, в дужках зазначена кількість досліджених нейронів. IFK - швідко-інактивуючийся, ISK - поволі-інактивуючийся, IK - неінактивуючийся калієві струми.
Всі три типу струмів були виявлені практично в кожному досліджуваному нейроні, але амлітуда струмів варіювала в значному ступені. Щільність всіх струмів вимірювалася при зміщенні мембранного потенціалу до 40 МВ - в області потенціалів, де стаціонарний рівень активації всіх струмів досягав максимальної величини (рис. 1-3Б). Результат компютерного аналізу з використанням Т-теста, що до статистичної різниці щільностей по кожному з трьох типів калієвих струмів для двох послідовних вікових груп, наведений в Таблиці 1 (p>0. 95 *; p>0. 99 **).
Добре відомо, що форма потенціалу дії змінюється в процесі клітинного зросту і диференціювання як в сомі, так і в нейрітах клітини (Spitzer and Lamborghini, 1976; Kullberg et al., 1977; Willard, 1980; Костюк, Кришталь, 1981). Здається цілком правомірним припущення, що модифікації калієвої провідності в процесі клітинного зросту не лимітовані областю соми клітини. Таким чином, подальшим завданням дослідження було зясування механізму впливу можливих модифікацій калієвої провідності пресинаптичної мембрани на ефективність синаптичної передачі в нейронах гіпокампу щурів.
Спонтанні та викликанні гальмівні постсинаптичні струми (ГПСС)
В зовнішньому розчині, що містіть ТТХ в нейронах, що знаходяться в режимі фіксації потенціалу, спостерігалися спонтанні ГПСС (СГПСС). Середня амлітуда СГПСС мала лінійну залежність від підтримуємого потенціалу із потенціалом реверсії -18..-20 МВ при даних поза/внутрішньоклітинної концентрації іонів хлору. Зовнішня аплікація біккукуліна в концентрації 5 ММ призводила до повного та зворотнього блокування СГПСС. Ці струми були ідентифіковані як GABA-індуковані гальмівні постсинаптичні Cl- - струми.
ГПСС могли бути також викликані шляхом позаклітинної електричної стимуляції зони пресинаптичного закінчення короткими (3-5 мс) деполярізуючими імпульсами струму, що пропускався крізь скляний мікроелектрод, заповнений позаклітинним розчином (рис. 6А). Викликані ГПСС (ВГПСС) були аналогічні СГПСС за кінетикою активації і інактивації. Амлітуда усереднених ВГПСС мала лінійну залежність від величини підтрімуваного потенціалу із потенціалом реверсії приблизно -20 МВ (рис. 6Б), що відповідає потенціалу Нернста для даних концентрацій іонів хлору. Таким чином, ВГПСС були визначені як GABA-індуковані Cl- струми.
Розподіл амплітуд ВГПСС
При стимуляції окремого синаптичного закінчення ВГПСС значно варіювали по амлітуді від 7-8 ПА до більш ніж 150 ПА при підтримуваному потенціалі -75 МВ. Варіація амлітуди ВГПСС в 10 з 12 нейронів мала добре виражений дискретний характер. Апроксимація амплітудного розподілу ВГПСС сукупністю незалежних кривих Гауса показує, що розподіл амлітуд ВГПСС має дискретний характер з величиною кванта 20 ПА. Величина кванта варіювала у межах 19-22 ПА (середня величина=20 ПА, n=10) і не залежила від амлітуди позаклітинного стимулу. Величина підтримуємого потенціалу постсинаптичної клітини в усіх випадках складала -75 МВ.
Таким чином, отримані дані вказують на те, що викид медіатору в окремому синаптичному закінченні нейронів гіпокампу має ймовірнісний характер. Механізм викиду медіатору є квантовим.
Квантовий аналіз амплітудного розподілу ВГПСС в рамках моделі Пуассона
Вперше закон Пуассона був застосований при дослідженні механізму синаптичної передачі у нервово-мускульному сполученні жаби (Katz, 1969 - Liverpool University press). На сьогодняшній момент засоби ймовірнісного опису процесів спонтанного та викликаного вивільнення нейромедіатору є загальноприйнятими.
Для застосування закону Пуассона до опису отриманих експериментальних даних вимагається перевести безперервний амплітудний розподіл ВГПСС в дискретний. При побудові дискретного розподілу за один квант приймалися ВГПСС c амлітудою в межах -8..-28 ПА, за два кванта від -28 ПА до-48 ПА. Розподіл Пуассона для вірогідності викиду х квантов медіатору записується в виді P (x)=e-mmx/x!, де m - математичне очикування кількості квантов (квантовий вміст). Квантовий вміст визначається як відношення сумарної кількості викинутих квантів в серії з N випробувань до кількості цих випробувань.
Кореляція між квантовим вмістом, обчисленним по методу “пропусків” m=ln (N/n0), n0 - кількість пропусків, N - кількість випробувань, а також зазначенного як відношення середньої амплітуди постсинаптичного струму до амлітуди одного кванта струму m=MEANIPSC/mini зазначає достовірність гіпотези про Пуассоновський характер процесу.
Вплив позаклітинної концентрації іонів кальцію на ВГПСС
Був досліджений вплив зовнішньої концентрації іонів кальцію на гальмівну синаптичну передачу в окремому синаптичному закінченні культивованих нейронів гіпокампу. Добре відомо, що процес екзоцитоза в пресинаптичній мембрані опосередкован входом іонів кальцію крізь мембрану терміналі (Katz, 1969 - Liverpool University press). Також добре відомо, що збільшення позаклітинної концентрації іонів кальцію в межах 0.. 5 ММ призводить до збільшення амлітуди кальцієвого струму як крізь низькопороговий так і високопороговий компонент кальцієвих каналів. Отже, слідує очікувати, що зміна концентрації позаклітинного кальцію буде змінювати ймовірність викиду медіатору. Дійсно, в серії з 10 дослідів було установлено, що збільшення позаклітинної концентрації кальцію при фіксованих параметрах позаклітинної стимуляції призводить до збільшення середньої амлітуди ВГПСС. Збільшення концентрації кальцію призводило до збільшення квантового вмісту викиду медіатору і не впливало на середню величину одного кванта ВГПСС. Залежність амлітуди ВГПСС від позаклітинної концентрації іонів кальцію мала сигмоідальний характер (рис. 8Б).
Збільшення квантового вмісту викиду нейромедіатору в гальмівній синаптичній передачі під вплівом блокаторів калієвих каналів
Був вивчений вплив мілімолярних концентрацій блокаторів калієвих каналів на синаптичну передачу в окремому синаптичному закінченні в умовах відсутності генерації потенціалу дії (в розчині, що містить ТТХ). Зовнішня аплікація 4-АП в концентрації 5ММ призводила до зворотного збільшення середньої амлітуди ВГПСС на 90± 30. Збільшення середньої амлітуди ВГПСС було повязане з збільшенням квантового вмісту викиду медіатору і не змінювало величини одного кванта. Кінетика спаду ВГПСС в контролі та присутності 4-АП не змінювалася. Аплікація 20ММ ТЕА призводила до значно меньшого ефекту, амлітуда ВГПСС зростала на 20± 5%.
Таким чином, блокування потенціалкерованих калієвих каналів пресинаптчної мембрани призводить до збільшення квантового вмісту викиду медіатору в окремому синаптичному закінченні.
ОБГОВОРЕННЯ
Порівняння властивостей відповідних типів потенціалкерованих калієвих струмів в нейронах гіпокампу та сенсорних нейронах не виявило статистично достовірних відмінностей більшості їх стаціонарних і кінетичних параметрів. Ймовірно, відповідні типи досліджених калієвих струмів сенсорних та центральних нейронів визначаються аналогічними (принаймні в значному ступені гомологічними) типами каналів. Така аналогія поширена в нервовій системі. Так, кінетичні і фармакологічні властивості описаного в цій роботі швидкого калієвого струму А-типу в значному ступені погодяться з експериментальними даними для аналогічних А-калієвих струмів, отриманими на багатьох інших препаратах центральної нервової системи - нейронах таламуса (Budde et al. 1992), неокортикальних нейронах (Andreasen and Hablitz 1992) та неонатальних сенсорних нейронах (MACFARLANE and Cooper 1991, Fedulova et al. 1998). Сюди можна віднести швидку активацію і інактивацію з постійною часу інактивації у межах 15-30 мс, потенціал половиної інактивації -85..-70 МВ та підвищену чутливість до позаклітинного прикладання 4-АП. Деякі відмінності у роботах різних авторів виявляються в характері залежності постійної часу інактивації калієвого струму А-типу, що може бути повязане із особливостями функціональних властивостей калієвих каналів А-струму в тканинах різних ділянок нервової системи. В мозку ссавців були ідентифіковані три типу калієвих каналів, що відповідають за калієвий струм А-типу: Kv1. 4 (RCK4), Kv3. 4 (Raw3) та Kv4. 2 (RK5, rat shall: Baldwin et al., 1991; Rettig et al., 1992; Stuhmer et al., 1989). Очевидно, що Kv3. 4 канал не може визначати досліджений тип струму, бо Kv3. 4 канал, отриманий засобом експресії в Xenopus oocytes, володіє підвищеною чутливістю до ТЕА (ID50=0.3 MM: Rettig et al., 1992). З іншого боку, Kv1. 4 та Kv4. 2 канали відповідні за калієві струми, в значному ступені схожі з швидким калієвим струмом по своїй чутливості до 4-АП та відносної резистивності до ТЕА. Імуноцитохімічні дослідження, проведені в різних ділянках головного мозку, показали, що канал Kv4. 2 знаходиться в основному в області соми і дендритного дерева нейрона, в той час як Kv1. 4 зосереджений в аксоні та нервових терміналях (Tsaur et al., 1992; Cooper et al., 1998; однак Martunez-Padryn and Ferrus, 1997). Крім того, швидкість виходу з інактивації дослідженого А-типу калієвого струму (постійна часу 45 мс) більш відповідає швидкості виходу з інактивації Kv4. 2 каналу, в той час як Kv1. 4 канал має істотно меньшу швидкість виходу з інактивації. Тому, найбільш вирогідно, що дослідженний тип калієвої провідності відповідає Kv4. 2 типу калієвого каналу.
Поволі-інактивуючийся калієвий струм активується в декілька раз повільніше А-струму. Інактивація описувалася двухекспотенційною функцією з постійними часу декілька сотен та тисяч мілісекунд відповідно. Можна було б припустити, що поволі-інактивуючийся калієвий струм визначається двома типами калієвих каналів. Однак, статистично достовірних відмінностей у кінетичних і фармакологічних параметрах двох вищезазначених компонентів струму виявлене не було. Крім того було показано, що поволі-інактивуючийся калієвий струм (RBK1), по своїм параметрам аналогічний описаному вище калієвому струму, також характеризується двухекспотенційним ходом інактивації з постійними часу порядку 50-100 мс та 5-10 с відповідно (Christie et al., 1989).
Поріг активації калієвого струму К-типу лежить в межах -20 МВ, потенціал половиної активації складає 15 МВ. К-струм активується поволі з постійної часу десятки мілісекунд і не інактивується принаймні впродовж 10-15 с при постійному рівні деполяризації мембрани. Неінактивуючийся калієвий струм не був чутливий до 4-АП, однак блокувався 10ММ ТЕА на 70-80%. Дослідження в області молекулярної біології (Stuhmer et al., 1989) виявили три типу генів, що відповідають за калієві канали затриманого випрямлення з властивостями, близькими до властивостей дослідженного струму: Kv1. 2 (RCK2), Kv1. 1 (RCK1) та Kv1. 5 (RCK5). Ці канали володіють схожими кінетичними параметрами, але відрізняються за фармакологічною чутливості до ТЕА. IC50 для RCK1, RCK2 і RCK5 каналів складає відповідно 0.6, 7 та 129 ММ. Тому, дослідженній калієвий струм затриманого випрямлення, найбільш певно, визначається Kv1. 2 типом калієвого каналу.
Дослідження модифікацій калієвої провідності соматичної мембрани сенсорних нейронів показали, що середня щільність швидко- і поволі-інактивуючихся струмів збільшуюється впродовж перших пятих днів постнатального розвитку і не змінюється в наступні десять днів. Середня щільність неінактивуючегося калієвого струму зменшується в перший і не змінюється в другий досліджений період раннього поснатального розвитку. При цьому, кількість нейронів, що мають щільність швидко-інактивуючегося калієвого струму більш 20 РА/РФ, збільшується в процесі онтогенезу. Це означає, що значення швидко-інактивуючегося калієвого струму в регуляції збудливості нейрона зростає з збільшенням віку тварини. В той же час, кількість нейронів, що мають щільність неінактивуючегося калієвого струму більше 25 РА/РФ, зменшується впродовж раннього онтогенезу. Дослідження ряду авторів по калієвій провідності центральних нейронів, в тому числі і нейронів гіпокампу (Bader et al., 1985; Aguayo, 1989; Surmier et al., 1991; Wu and Barish, 1994; Klee et. al, 1995) на ранніх етапах онтогенетичного розвитку вказують на деяку аналогію в процесах змін щільності калієвих струмів в нейронах спінальних гангліїв та нейронах гіпокампу. Так, щільність поволі-інактивуючегося калієвого струму в нейронах СА1 і CA3 області гіпокампу щурів збільшується протягом перших двох тижнів постнатального розвитку. Аналогічні модифікації спостерігалися і в наших дослідженнях калієвих струмів нейронів спінальних гангліїв. Можливо, це явище є частиною фізіологічного механізму, що є спільним для багатьох типів нейрональних клітин. Очевидно, що зміна щільності калієвих каналів призводить до модифікації форми та тривалості потенціалу дії, що в свою чергу тягне за собою варіацію в кількості кальцію, що проникає всередину клітини під час проходження потенціалу дії. Особливу роль в цьому відіграють калієві канали, розташовані безпосередньо в області пресинаптичного закінчення нейрона. Зміна форми потенціалу дії в цій області і відповідна зміна кількості проникаючего всередину кальцію можуть безпосередньо впливати на пресинаптичний механізм викиду медіатору.
Дослідження ряду авторів вказують, що калієві канали пресинаптичного закінчення нейрона можуть бути в значній мірі гомологічні калієвим каналам соматичної мембрани (Martunez-Padryn and Ferrus, 1997; Cooper et al., 1998). Здається правомірним припущення про те, що зміни калієвої провідності соми нейрона можуть в якому-то ступені (принаймні якісно) відбивати відповідні зміни провідності всієї нейрональної мембрани. Дослідження дії блокаторів потенціалкерованих калієвих каналів (ТЕА, 20ММ і 4-АП, 5 ММ) на синаптичну передачу нейронів гіпокампу показали, що блокування калієвих каналів пресинаптичної мембрани призводить до збільшення імовірності викиду медіатору в окремому синаптичному закінченні. Ефект може бути пояснений слідуючим чином. Блокування калієвих каналів призводить до збільшення величини та тривалості деполярізації пресинаптичної мембрани, що збільшує величину кальцієвого струму крізь потенціалкеровані кальцієві канали. В свою чергу, збільшення кількості кальцію, що проникає всередину пресинаптичної терміналі змінює імовірність викиду медіатору. Раніш було показано, що калієвї струми IFK, ISK та IK - типів сенсорних і центральних нейронів володіють різним ступенем чутливості до ТЕА і 4-АП (MCFARLANE and Cooper, 1991; Klee et al., 1995; Fedulova et al., 1998). Струм IFK найбільш чутливий до 4-АП і не чутливий до ТЕА, в той час як калієві струми ISK і IK в значному ступені блокуються мілімолярними концентраціями ТЕА. В наших експериментах аплікація 5 ММ 4-АП призводила до збільшення амлітуди ВГПСС в середньому на 90%, в той час як ТЕА 20ММ викликав збільшення величини ВГПСС в середньому на 20%. Цей факт може вказувати на домінуючу роль калієвого струму IFK (А-типу) в формуванні калієвої провідності пресинаптичної мембрани досліджуваного типу нейронів.1. Аналіз калієвої провідності соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв і гіпокампу показує наявність принаймні трьох типів потенціалкерованих калієвих струмів в досліджених типах клітин. Сюди можна віднести швидко-інактивуючийся, поволі-інактивуючийся та неінактивуючийся калієвї струми. Калієві струми нейронів спінальних гангліїв по своїм стаціонарним, кінетичним та фармакологічним параметрам не відрізняються суттєвим образом від відповідних типів калієвих струмів нейронів гіпокампу.
2. Щільність калієвих струмів IFK і ISK соматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв статистично достовірно збільшується протягом перших двох тижнів постнатального періоду, в той час як щільність IK -струму зменшується на тому ж інтервалі.
3. Блокатори потенціалкерованих калієвих каналів 4-АП і ТЕА викликають збільшення середньої амлітуди ВГПСС GABAA рецепторів синаптичної терміналі нейронів гіпокампу, при цьому 4-АП (5ММ) викликає значно більший ефект (90± 30%) в порівнянні з 20ММ ТЭА (20± 5%). Збільшення амлітуди ВГПСС також могло бути отримане шляхом збільшення позаклітинної концентрації іонів кальцію.
4. Квантовий аналіз гальмівної синаптичної передачі культивованих нейронів гіпокампу на рівні окремої синаптичної терміналі в даних експериментальних умовах показує адекватність застосування моделі Катца для опису мультивезікулярного викиду медіатору в гальмівних синапсах гіпокампу ссавців.
5. Збільшення середньої амлітуди ВГПСС окремої синаптичної терміналі під впливом блокаторів калієвих каналів пояснюється за рахунок збільшення квантового вмісту викиду медіатору при незміній амплітуді кванта ВГПСС.
По отриманим даним було опубліковано такі праці: 1. Д.В. Васильев, Н.С. Веселовский и С. А. Федулова. Потенциалактивируемые калиевые токи соматической мембраны сенсорных нейронов крыс в раннем постнатальном периоде. Нейрофизиология, 1998. - т. 30. - стр. 25-35.
2. S.A. Fedulova, D.V. Vasilyev and N.S. Veselovsky Voltage-operated potassium currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons: ontogenetic aspects. Neuroscience, 1998. -v.85. - p.497-508.
Тези доповідей: 1. S.A. Fedulova, D. Owen, D.V. Vasilyev and N.S. Veselovsky. Developmental study of the expression of potassium channels in the somatic membrane of sensory neurons. Society for Neuroscience 27th Annual Meeting, 1997. Abstract Book, 681.4
2. D.V. Vasilyev, S.A. Fedulova, E.V. Isaeva and N. S. Veselovsky. Fast-Inactivating potassium current in cultured rat hippocampal neurons. International Workshop “Intracellular signalling” in association with XXXIII International Congress of Physiological Sciences, 1997, June 26-28, Kiev. Neurophysiology, 1997.-v.29.- p.376.
3. D.V. Vasilyev, S.A. Fedulova, E.V. Isaeva and N.S. Veselovsky. Three distinct types of potassium current in cultured rat hippocampal neurons. Biophysical Society 1998 Annual Meeting. Abstract Book, 05C-05D.
4. S.A. Fedulova, D.V. Vasilyev, E.V. Isaeva, M.E. Barish and N. S. Veselovsky. Multiple potassium channels regulate neurotransmitter release from single boutons of inhibitory hippocampal synapses in culture. Society for Neuroscience 28th Annual Meeting, 1998.
5. D.V. Vasilyev, S.A. Fedulova, E.V. Isaeva, D.S. Faber and N.S. Veselovsky. Effect of different concentration of extracellular Ca2 on IPSC evoked at single synapse of cultured hippocampal neurons. Society for Neuroscience 28th Annual Meeting, 1998. калієвий гіпокамп нейрон спінальний
Наведена дисертація викладена на 98 сторінках, включаючи список літератури (149 джерел), включає в себе вступ, огляд літератури, методику, результати досліджень, обговорення та висновки. У роботі використано 12 ілюстрацій.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
