Поширення, біологічні властивості збудника та удосконалення профілактики пастерельозу кроликів - Автореферат

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУКОфіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України Стегній Борис Тимофійович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, директор. доктор ветеринарних наук, професор Білокінь Віктор Степанович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології; З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центра “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м.Дослідження в зазначеному напрямку в кролівницьких фермах південно-східного регіону України не проводились. Етіологія, патогенез, діагностика та профілактика пневмоентеритів у кроликів, спричинених пастерелами та асоціаціями умовно патогенних бактерій, залишаються недостатньо вивченими. Визначення мікробного ценозу в кролівницьких фермах та зясування ролі пастерел в асоціаціях умовно патогенних бактерій, які спричиняють масові пневмоентерити кроликів, є актуальним і сприятиме підвищенню ефективності лікувально-профілактичних заходів у кролівництві України. Тема дисертації є частиною науково-дослідної роботи кафедри якості та безпеки продукції АПК Луганського національного аграрного університету, яка виконувалась згідно програми УААН “Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці і розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно-східної частини України” (0104U005403, 2003-2007 рр.). Розроблено технологію виготовлення інактивованої вакцини проти пастерельозу кроликів із застосуванням епізоотичних штамів Pasteurella multocida сероварів А і Д та Staphylococcus aureus, Escherichia coli O111 і Bordetella bronchiseptica, що найбільш часто ускладнюють перебіг хвороби та спосіб їх інактивації за допомогою пероксиду водню, теоретичні положення яких підтверджено експериментальними даними в лабораторних і виробничих умовах.При бактеріологічних дослідженнях 226 трупів кроленят було виділено 863 культури 14 видів умовно патогенних бактерій. Частіше за все ізолювали P. multocida (34,1 %), S. aureus (23,6 %), E. coli (13,8 %) та Staphylococcus epidermidis (7,5 %); менш розповсюдженими виявилися B. bronchiseptica (4,2 %), Streptococcus pyogenes (3,8 %), Klebsiella pneumoniae (3,8 %), Streptococcus pneumoniae (2,7 %), Staphylococcus saprophyticus (2,3 %), Pseudomonas aeruginosa (2,1 %) і зовсім рідко виділялися бактерії інших видів: Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis та Micrococcus luteus (2,1 %). В якісному відношенні було виділено 21 варіант асоціацій умовно патогенних бактерій, з яких частіше всього зустрічалися: P. multocida S. aureus (20,9 %), P. multocida S. epidermidis (19,2 %), P. multocida E. coli (11,8 %), E. coli S. aureus (10,5 %), S. aureus S. epidermidis (7,8 %), P. multocida S. pneumoniae (6,9 %) та P. multocida B. bronchiseptica (5,0 %); рідше - P. multocida B. bronchiseptica S. aureus (3,2 %), S. aureus S. pyogenes (2,3 %), P. multocida E. coli S. aureus (2,7 %), E. coli S. pyogenes (1,4 %), P. multocida K. pneumoniae (1,4 %), E. coli S. saprophyticus (0,9 %), S. aureus M. luteus (0,9 %), E. coli B. bronchiseptica (0,9 %), P. multocida S. saprophyticus (0,9 %), P. multocida S. pyogenes (0,9 %), B. bronchiseptica S. aureus (0,9 %), B. bronchiseptica S. epidermidis (0,5 %), K. pneumoniae S. epidermidis (0,5 %) та S. pneumoniae S. saprophyticus (0,5 %). За допомогою РНГА 173 культури (58,8 %) було віднесено до серовару А, 98 (33,4 %) - до серовару D. За патогенними властивостями культури пастерел суттєво відрізнялись між собою: ізоляти із внутрішніх органів хворих кроликів викликали загибель 64,1 % мишей, і навпаки культури з носової порожнини були патогенними тільки для 29,9 % мишей.У дисертації на підставі клініко-епізоотологічного обстеження та аналізу епізоотичного стану кролеферм, бактеріологічних і серологічних досліджень вивчено особливості захворювання пастерельозом кроликів та впливу бактеріальних асоціантів на характер перебігу хвороби, експериментально обґрунтовано режим інактивації виділених збудників з метою виготовлення інактивованих препаратів, розроблено і випробувано з позитивним результатом експериментальні зразки моно-та асоційованої вакцин. В організмі хворих на пастерельоз кроликів формується сталий бактеріальний ценоз, що складається з асоціації P. multocida S. aureus (20,9 %), P. multocida S. epidermidis (19,2 %), P. multocida E. coli (11,8 %), E. coli S. aureus (10,5 %), S. aureus S. epidermidis (7,8 %), P. multocida S. pneumoniae (6,9 %) та P. multocida B. bronchiseptica (5,0 %); рідше - P. multocida B. bronchiseptica S. aureus (3,2 %), S.aureus S.pyogenes (2,3 %), P. multocida E. coli S. aureus (2,7 %), E. coli S. pyogenes (1,4 %), P. multocida K. pneumoniae (1,4 %), E. coli S.

Роль P. multocida в етіології пневмоентеритів кроликів у господарствах південно-східної частини України. Вивчення ролі P. multocida в етіології респіраторних та шлунково-кишкових захворювань кроликів проведено в фермерських господарствах Луганської (10), Донецької (2) та Запорізької (2) областей.

Епізоотологічними обстеженнями встановлено, що в усіх фермах кролівники-аматори заради отримання максимальної економічної вигоди не завжди проводять необхідні ветеринарно-санітарні заходи щодо профілактики пневмоентеритів. Майже в усіх АКФ для утримання кроликів використовують пристосовані приміщення, в яких раніше утримували тварин інших видів. Приміщення не відповідають зоогігієнічним нормативам щодо утримання кроликів (недостатня площа на одну голову, невідповідне сумісне утримання різних статево-вікових груп, недостатня вентиляція). В усіх крільчатниках відсутні санпропускники, приміщення для карантинування та лікування хворих тварин. У деяких АКФ до крільчатників мають доступ кури, качки, кішки та сторонні особи. Більшість господарств не мають елементарного ветеринарного обслуговування: профілактичні заходи несистемні або взагалі не проводяться, не зясовуються причини інфекційних захворювань, застосовуються антибактеріальні засоби без визначення чутливості збудників і в занижених дозах.

Вищезазначене свідчить про те, що в господарствах відсутні умови для забезпечення розриву ланок епізоотичного ланцюга, внаслідок чого відбувається накопичення та підвищення вірулентності умовно патогенних бактерій, спроможних викликати різноманітні патології у кроликів.

При бактеріологічних дослідженнях 226 трупів кроленят було виділено 863 культури 14 видів умовно патогенних бактерій. Частіше за все ізолювали P. multocida (34,1 %), S. aureus (23,6 %), E. coli (13,8 %) та Staphylococcus epidermidis (7,5 %); менш розповсюдженими виявилися B. bronchiseptica (4,2 %), Streptococcus pyogenes (3,8 %), Klebsiella pneumoniae (3,8 %), Streptococcus pneumoniae (2,7 %), Staphylococcus saprophyticus (2,3 %), Pseudomonas aeruginosa (2,1 %) і зовсім рідко виділялися бактерії інших видів: Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis та Micrococcus luteus (2,1 %).

В обстежених господарствах кількість патогенів коливалась від 3 до 9. Найбільш широке розповсюдження в господарствах мали P. multocida та E. coli (в 12-ти), S. aureus (в 11-ти), менше - P. aeruginosa, S. pyogenes (в 6-ти), K. pneumoniae, S. epidermidis, S. saprophyticus (в 5-ти), P. vulgaris, B. bronchiseptica, S. pneumoniae (в 4-ох), і рідко P. mirabilis, S. faecalis (в 2-ох) та M. luteus (в 1-ому з 14 АКФ).

При серологічній ідентифікації 119 ізолятів кишкової палички було визначено, що в кролівницьких господарствах південно-східної частини України частіше циркулюють серогрупи О111 (52,9 %), О78 (24,4 %) і О8 (16,0 %), а також О126 (6,7 %).

При визначенні кількісного складу бактеріального паразитоценозу в кроликів, хворих на респіраторні, кишкові захворювання та пневмоентерити, встановлено, що асоціації умовно патогенних бактерій складаються з 2 - 3 співчленів. В якісному відношенні було виділено 21 варіант асоціацій умовно патогенних бактерій, з яких частіше всього зустрічалися: P. multocida S. aureus (20,9 %), P. multocida S. epidermidis (19,2 %), P. multocida E. coli (11,8 %), E. coli S. aureus (10,5 %), S. aureus S. epidermidis (7,8 %), P. multocida S. pneumoniae (6,9 %) та P. multocida B. bronchiseptica (5,0 %); рідше - P. multocida B. bronchiseptica S. aureus (3,2 %), S. aureus S. pyogenes (2,3 %), P. multocida E. coli S. aureus (2,7 %), E. coli S. pyogenes (1,4 %), P. multocida K. pneumoniae (1,4 %), E. coli S. saprophyticus (0,9 %), S. aureus M. luteus (0,9 %), E. coli B. bronchiseptica (0,9 %), P. multocida S. saprophyticus (0,9 %), P. multocida S. pyogenes (0,9 %), B. bronchiseptica S. aureus (0,9 %), B. bronchiseptica S. epidermidis (0,5 %), K. pneumoniae S. epidermidis (0,5 %) та S. pneumoniae S. saprophyticus (0,5 %).

Біологічні властивості культур P. multocida, ізольованих від хворих і загиблих кроликів. Усі ізоляти P. multocida за культуральними та морфологічними властивостями не відрізнялись між собою. При мікроскопії бактерії розташовувались ізольовано, рідше парами та короткими ланцюжками. У мазках із патологічного матеріалу та свіжовиділених агарових культур, фарбованих за Міхиним, пастерели завжди мали біполярність. При фарбуванні тушшю за методом Буррі-Гінса більшість свіжовиділених ізолятів (79,6 %) мали капсулу.

У МПБ всі культури пастерел протягом першої доби викликали рівномірне помутніння середовища та незначний слизовий осад на дні пробірки. На МПА через 18-24 годин спостерігали ріст дрібних напівпрозорих, росинчастих, злегка блакитнуватих округлих колоній, із рівними краями та гладенькою блискучою опуклою поверхнею. При боковому освітленні такі колонії мали своєрідне світіння - „флуоресценцію”. Усі культури пастерел у мясо-пептонному напіврідкому агарі росли чітко за уколом голки. В сироватковому та кровяному агарі епізоотичні культури пастерел давали більш пишний та соковитий ріст, ніж на простому МПА. Ні один з отриманих ізолятів не викликав гемолізу в 5 %-му кровяному агарі.

За характером росту на твердих поживних середовищах виявили 3 типи колоній культур P. multocida, а саме: S- 129 (43,9 %), M- 141 (47,9 %) та R-форми 24 (8,2 %). В окремих АКФ кількість пастерел S-форм коливалась від 0,0 до 10,9 %; M-форм - від 0,0 до 18,7 % та R-форм - від 0,0 до 2,0 %.

За біохімічними властивостями виділені культури пастерел також варіювали. Усі культури володіли каталазною властивістю та ферментували сорбіт, часто ферментували глюкозу (96,3 %), сахарозу (93,5 %), манозу (88,4 %), утворювали сірководень (99,7 %), індол (94,9 %) орнітиндекарбоксилазу (92,2 %); рідше розщеплювали мальтозу (54,1 %); рідко маніт (23,8 %); дуже рідко лактозу (2,4 %), дульцит (0,3 %); зовсім не утворювали лізиндекарбоксилазу, ?-галактозидазу, ацетилметилкарбінол; не утилізували цитрат та малонат натрію.

За допомогою РНГА 173 культури (58,8 %) було віднесено до серовару А, 98 (33,4 %) - до серовару D. У 23 ізолятів (7,8 %) не встановлено сероваріантної належності. У 10 господарствах (83,3 %) ізольовано культури пастерел сероварів А та D і не виявлено жодного ізоляту P. multocida серовару В. При несерологічному типуванні пастерел 173 культури (58,8 %) були позитивними в стафілококовому тесті, а 121 (41,2 %) - утворювали флокулят у трипафлавіновій пробі.

За патогенними властивостями культури пастерел суттєво відрізнялись між собою: ізоляти із внутрішніх органів хворих кроликів викликали загибель 64,1 % мишей, і навпаки культури з носової порожнини були патогенними тільки для 29,9 % мишей.

Отримані ізоляти пастерел були найбільш чутливими до цефтриаксону, амікацину, ципрофлоксацину, цефазоліну та пефлоксацину. Середню антибактеріальну активність відносно пастерел показали оксацилін, ампіцилін, левоміцетин та енрофлоксацин, найменшу - стрептоміцин, доксициклін, гентаміцин та бензилпеніцилін.

Удосконалення діагностики P.multocida-інфекції кроликів. Для виявлення джерел P.multocida-інфекції кроликів нами було поставлено завдання удосконалити методику індикації та вивчити перебіг прихованої інфекції у кроликів-пастерелоносіїв.

У досліді використано 11 кроликів-пастерелоносіїв. У 5 голів провокацію захворювання проводили за методом Н. И. Розанова (перша група), у 6 голів - за цим методом у нашій модифікації (друга група). Чотири здорових тварини було взято в якості контролю (третя група).

Установлено, що у тварин-бактеріоносіїв у порівнянні з контрольними відбуваються зміни в загально-клінічному стані, які маніфестуються помірною тахікардією, тахіпное та субфебрильним підвищенням ректальної температури тіла. У дослідній групі тварин, клінічний прояв пастерельозу в яких спровоковано за методом Н. И. Розанова, частота дихальних рухів (ЧДР), частота серцевих скорочень (ЧСС) та ректальна температура тіла до кінця терміну спостереження знизились до нормальних значень і в 3-х кроликів (60,0 %) зникли ознаки риніту та конюнктивіту. Проте, необхідно відмітити, що у тварин дослідної групи, провокацію в яких здійснювали за методом Н.И. Розанова в нашій модифікації, протягом усього періоду спостереження у всіх кроликів були виражені стійкі клінічні ознаки риніту. Через 24 години після введення дексаметазону в кроликів-пастерелоносіїв відзначено незначне підвищення ЧДР, ЧСС та достовірне підвищення температури тіла. На 48 годину досліду було встановлено подальше погіршення загального стану оброблених гормоном кроликів, що проявлялось більше вираженою тахікардією, тахіпное, лихоманкою. Після закінчення досліду (через 72 годин) 2 тварини (33,3 %) цієї групи загинули, а в кроликів, які вижили, показники ЧДР та ЧСС ще незначно збільшились, проте ректальна температура різко знизилась на 3,0 ?С.

Після закінчення досліду легені кроликів, які загинули під час проведення експерименту, а також еутаназованих під наркозом, піддали бактеріологічному дослідженню для ізоляції культур. Найбільш ефективним виявився метод виявлення кроликів-пастерелоносіїв за нашою модифікацією. Частота виділення пастерел у цих тварин у 5,0 разів перевищувала показник ізоляції аналогічних культур від кроликів, у яких інфекція була спровокована за класичним методом Н.И. Розанова.

Для прискорення постановки діагнозу проведено пошукові дослідження щодо вивчення ефективності в якості біостимуляторів дефібринованої крові великої рогатої худоби, аутолізату дріжджів, нормальної сироватки крові коней та запропонованого нами дріжджованого аутолізату крові.

Установлено, що досліджувані інгредієнти поживного середовища помітно впливають на ріст пастерел. Середнє число живих мікробних клітин P. multocida збільшується у відповідності з підвищенням концентрації стимулюючих біодобавок до МПБ. Максимальне накопичення пастерел відбувається відповідно при 15 %-ній концентрації аутолізату дріжджів, 10 %-ній дефібринованої крові, 15 %-ній сироватки крові та 15 %-ній ДАК. При подальшому збільшенні концентрації дріжджового аутолізату, дефібринованої крові та нормальної сироватки крові в МПБ кількість бактеріальних клітин, навпаки, зменшується. Використання 20 %-го ДАК у МПБ забезпечує накопичення бактеріальної маси P. multocida на тому ж рівні, що і при 15 %-ній концентрації цієї добавки.

Найбільш інтенсивно стимулювала ріст пастерел дефібринована кров. Кількість пастерел, які виросли в середовищі з цією добавкою, була в 8,4-11,6 рази більше, ніж у простому МПБ. Дещо менше поліпшували ріст мікробів сироватка крові (в 3,2-5,8 рази) і ДАК (в 3,8-5,4 рази) та найбільше слабко (в 1,3-2,2 рази) - аутолізат дріжджів.

Розраховану нами функціональну залежність числа бактеріальних клітин пастерел (y) від концентрації (x) аутолізату дріжджів (у1), дефібринованої крові (у2), сироватки крові (у3) і ДАК (у4) можна відповідно представити наступними рівняннями регресій: у1 = - 0,012.x2 0,264.x 1,056; у2 = - 0,064.х2 1,747.х 1,483; у3 = -0,016.х2 0,575.х 1,083 та у4 = - 0,026.х2 0,776.х 1,375.

На моделі 14 видів культур умовно патогенних бактерій, які були виділені при шлунково-респіраторних захворюваннях кроликів в АКФ південно-східної частини України, вивчено інгібуючі властивості анілінових барвників на ріст бактерій у МПБ.

Найбільш чутливими до випробуваних барвників виявилися стрептококи (S. pneumoniae, S. faecalis та S. pyogenes), мікрококи (M. luteus) і стафілококи (S. aureus, S. epidermidis та S. saprophyticus). Ріст цих мікроорганізмів відбувався переважно при додаванні до живильного середовища фуксину основного (1,0-5,1?10-4), бриліантгрюну (1,0-9,2?10-5), кристалвіолету (5,1?10-4-1,2Ч10-6), метилвіолету (6,4?10-4-1,2Ч10-6). P. multocida мала практично однакову чутливість до барвників з іншими грамнегативними бактеріями.

Удосконалення специфічної профілактики асоційованого перебігу пастерельозу кроликів. Для встановлення ролі P. multocida в етіології пневмоентеритів кроликів нами також було використано імунобіологічний метод. Для цього виготовили і в порівняльному експерименті випробували одну дослідну серію вакцини з асоціації мікробів, а другу - з P. multocida, які були виділені у хворих на пневмоентерити кроликів.

При виготовленні антигенів для експериментальних серій вакцин було відібрано 5 культур мікроорганізмів: P. multocida сероварів A та D, S. aureus, E. coli О111 та B. bronchiseptica. Усі ізоляти були типовими для відповідного виду мікроорганізмів, із S-формою росту і мали досить високу вірулентність для білих мишей. Показники LD50 відібраних для досліду культур суттєво відрізнялись між собою: найвищу вірулентність мала культура P. multocida 127 серовару А (25,3 м. к.), нижчу - ізоляти P. multocida 99 серовару D (7,3.105 м. к.), E. coli 88 серогрупи О111 (2,4.106 м. к.), B. bronchiseptica 129 (3,6.106 м. к.), штам 115 S. aureus (4,6.107 м. к.).

Суттєвим у розробці інактивованих біопрепаратів є інактивація мікроорганізмів при збереженні їх імуногенних властивостей. Метою даного етапу досліджень було вивчення впливу різних концентрацій (0,06-1,00 %) пероксиду водню (ПВ), дімеру етиленіміну (ДЕІ) та формальдегіду (ФА) на життєздатність пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел.

Установлено, що інактивація мікробів за допомогою ФА протікає швидше, ніж при використанні ПВ та ДЕІ. Інактивація досліджуваних мікроорганізмів відбувалась у концентрації ПВ не нижче, ніж 0,5 %, а при вмісті його в концентрації 0,06 % в жодній із проб знешкодження бактерій не було відмічено. ДЕІ інактивував культури пастерел і стафілококів за 24 години в концентрації 0,25 %. Повна стерилізація цим інактиватором ешерихій та бордетел відбувалась у концентрації 1,0 % при експозиції 12 годин. ФА викликав загибель пастерел та бордетел у концентрації 0,125 % за 24 години. Для стафілококів та ешерихій цей інактиватор виявився ефективним лише в концентрації 0,25 % і при експозиції 24 години.

Ураховуючи біологічну неоднорідність збудників пневмоентеритів кроликів, наступним етапом наших досліджень було вивчення динаміки інактивації пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел за допомогою 0,5 % ПВ, 1,0 % ДЕІ та 0,25 % ФА.

Установлено, що в процесі інактивації культур мікроорганізмів щогодини відбувається зменшення числа живих мікробних клітин (ж. м. к.). При застосуванні 0,5 % розчину ПВ повна інактивація ізолятів P. multocida, E. coli та B. bronchiseptica здійснювалася через 6 годин, а культури S. aureus лише через 8 годин дії інактиватора. Повна інактивація культур пастерел, стафілококів 1,0 % розчином ДЕІ відбувалася за 8 годин, в той час як бактеріальна суспензія ешерихій та бордетел при зазначеній експозиції мала ще незначну кількість ж. м. к. При стерилізації досліджуваних культур за допомогою 0,25 %-ного розчину ФА повна інактивація культур відбувалася впродовж 6 годин. У той же час регламент стерилізації стафілококів, ешерихій та бордетел становив 8 годин.

У великих обємах бактеріальної суспензії, яка піддається інактивації, завжди існує ймовірність виживання деякої кількості бактеріальних клітин, виявити які загальноприйнятими методами неможливо. Виходячи з цього, потрібна теоретична оцінка процесу інактивації, яка б дозволила прогнозувати зниження числа життєздатних бактерій до допустимого рівня. При виробництві невеликих серій біопрепаратів часто інактивацію мікробів здійснюють у реакторах ємкістю 10 л, а рівень інактивації оцінюють за числом ж. м. к. в 1 см3. У цьому випадку рівень залишкової вірулентності матеріалу повинний бути менше 10-4 ж. м. к./см3, тобто логарифм життєздатних клітин становитиме ?-4. Отримані цифрові значення дали нам можливість за допомогою регресійного аналізу виявити залежність логарифму життєздатності досліджуваних бактерій від тривалості інактивації. Установлено, що регресійний звязок близький до прямолінійного і його можна виразити рівнянням прямої лінії yx =a - b.x, де yx - lg ж. м. к.; x - тривалість інактивації, годин; a і b - коефіцієнти регресії (b - константа інактивації, год-1). Рівняння регресії виражають функціональний звязок між стерилізуючою активністю інактиваторів у вигляді динаміки НВЧ мікробів у часовій перспективі.

Необхідно відзначити, що функціональна залежність НВЧ клітин бактерій (y) від часу інактивації (x) P. multocida серовару А (у1), P. multocida серовару D (у2), S. aureus (у3), E. coli (у4) і B. bronchiseptica (у5) за допомогою 0,5 % ПВ можна відповідно представити наступними рівняннями регресій: у1 = - 1,8.х 9,9; у2 = - 1,7.х 9,2; у3 = - 1,1.х 7,7; у4 = - 1,7.х 8,4 та у5 = -1,6.х 8,4. Кінетика інактивації пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел при використанні 1 %-го ДЕІ може бути описана відповідними рівняннями, а саме: у1 = - 1,3.х 8,8; у2 = - 1,2.х 8,4; у3 = - 1,2.х 8,4; у4 = - 1,3.х 8,9 та у5 = - 1,2.х 8,2. При стерилізації вказаних бактерій 0,25 %-ним ФА рівняння регресії відповідно мають вигляд: у1 = - 1,6.х 8,0; у2 = - 1,6.х 7,9; у3 = - 1,2.х 7,9; у4 = - 1,2.х 8,1 та у5 = - 1,3.х 9,1.

Величина достовірності апроксимації (R2) кінетики інактивації досліджуваних бактерій відповідно дорівнювала 0,98; 0,92; 0,81; 0,82 та 0,86 при використанні в якості інактиванту 0,5 %-го ПВ, 0,91; 0,89; 0,88; 0,92; 0,86 при інактивації культур 1 %-ним ДЕІ і 0,81; 0,78; 0,83; 0,85 при стерилізації 0,25 %-ним ФА, що вказує на близькість значень теоретично розрахованих ліній регресій до фактичних експериментальних даних.

На підставі проведеного регресійного аналізу зроблено висновок, що безпечний поріг інактивації P. multocida серовару А, P. multocida серовару D, S. aureus, E. coli та B. bronchiseptica при застосуванні ПВ наступить відповідно через 7,7; 7,8; 10,6; 7,3 та 7,8 годин, а при використанні ДЕІ і ФА - через 9,9; 10,3; 10,3; 9,9; 10,2 та 7,5; 7,4; 9,9; 8,4; 10,3 годин.

Інактивовані антигени пастерел сероварів А і D, стафілококів, ешерихій та бордетел детально були перевірені на імуногенність (IMD50) та токсичність (LD50).

За тестом активного захисту мишей, установлено, що всі інактивовані антигени зберігали імуногенність. Проте, необхідно відмітити, що антигени з культур P. multocida серовару А, P. multocida серовару D, S. aureus, E. coli та B. bronchiseptica, які були інактивовані з використанням ДЕІ, мали найвищу імуногенну активність. Показники IMD50 відповідно становили 4,07?107; 6,17Ч107; 1,07Ч108; 6,18Ч107 та 3,56?107 м.к. Інактивовані за допомогою ПВ біопрепарати, що були виготовлені з асоціації цих мікроорганізмів, мали середню імуногенну активність, проте, вона була більш вираженою в порівнянні з аналогічними за складом антигенами, інактивованими за допомогою ФА. Так, для захисту 50 % мишей від зараження (4 LD50) вихідними культурами пастерел сероварів А і D, стафілококів та бордетел була відповідно необхідна в 6,9; 3,0; 2,3 та 1,3 рази менша доза інактивованих ПВ антигенів, ніж ФА. Що стосується імуногенності антигенів E. coli, виготовлених у різний спосіб, то треба відзначити, що інактивовані ФА антигени в 1,7, а інактивовані ДЕІ в 6,8 рази були більш активними порівняно з інактивованими ПВ.

Токсичність антигенів оцінювали за тестом летальності для мишей. Результати досліджень свідчать про істотно нижчу токсичність інактивованих ПВ антигенів у порівнянні з інактивованими за допомогою ДЕІ та ФА. Так, 50 % летальні дози для білих мишей антигенів, виготовлених шляхом стерилізації бактеріальної суспензії 0,5 %-ним розчином ПВ, були у 15,7 (B. bronchiseptica), 12,1 (P. multocida серовару D), 5,2 (P. multocida серовару А), 5,2 (E. coli) та 4,2 (S. aureus) рази вищими, ніж в аналогічних біопрепаратів, виготовлених за допомогою інактивації 1,0 %-ним розчином ДЕІ. Інактивовані ПВ антигени мали у 6,9 (B. bronchiseptica), 4,0 (P. multocida серовару D), 2,4 (S. aureus), 1,7 (P. multocida серовару А) та 1,6 (E. coli) рази меншу токсичність, ніж у відповідних біологічних препаратів, виготовлених шляхом інактивації 0,25 %-ним розчином ФА.

В аматорській кролівницькій фермі в порівняльному досліді нами випробувано дві серії інактивованих вакцин: перша - протипастерельозна, виготовлена тільки з P. multocida сероварів A та D; друга - асоційована, виготовлена з мікроорганізмів (P. multocida сероварів A та D, S. aureus, E. coli, B. bronchiseptica), що були ізольовані в цьому господарстві від кроликів 3-5-місячного віку, хворих на шлунково-респіраторні захворювання.

Для виготовлення дослідних зразків інактивованих вакцин використовували суспензії бактерій, які інактивували 0,5 %-ним розчином ПВ. Конструювання вакцин проводили з таким розрахунком, щоб в 1,0 см3 імунологічного біопрепарату містилося 5?109 м. к. Для вакцини першої серії використовували антигени пастерел сероварів А і D у співвідношенні 1:1. При виготовленні асоційованого препарату (серія 2) застосовували співвідношення бактеріальних антигенів, в якому вони ізолювались в АКФ (пастерели - 40 %, стафілококи - 30 %, ешерихії - 20 % та бордетели - 10 %). Після додавання адюванту, в якості якого використовували 10 %-ний аеросил (6 %) в 0,9 %-му розчині натрію хлориду, розфасовки готових вакцин, етикетування та проведення контролю на стерильність і нешкідливість для кроликів, виготовлені біопрепарати були випробувані в господарстві (табл. 1).

Установлено, що інактивована вакцина, яка була виготовлена з асоціації культур мікроорганізмів (серія 2), мала вищі превентивні властивості. Декілька нижчою захисною ефективністю володів вакцинний препарат, виготовлений тільки з культур пастерел (серія 1).

Таблиця 1 Результати клінічних випробувань виготовлених вакцин у кролівницькому господарстві

Група тварин, щеплених вакцинами Кількість тварин у групі З них: захворіло вимушено забито загинуло голів % голів % голів %

1 93 26 28,0 9 9,7 1 1,0

2 102 19 18,6 5 4,9 0 0,0

Контроль 51 34 66,7 29 56,9 5 9,8

Вивчення біологічних властивостей інактивованих вакцин. Реактогенність виготовлених вакцин визначали через 12, 24 та 48 годин після інєкції. Враховували температурну реакцію, загальний стан та місцеву реакцію у піддослідних тварин.

Реакції на щеплення звичайно реєструвалися через 12 годин після інєкції вакцин, найбільш вираженими вони були через 24 години, а через 48 годин дещо зменшувались. Загальна реакція на вакцинацію через 12 годин після інєкції проявлялась незначним пригніченням, зниженням апетиту та підвищенням ректальної температури тіла. Післявакцинальні реакції у тварин, які були щеплені проти пастерельозу як моно- (23,7 %), так і асоційованою (24,5 %) вакциною, були майже однаковими. Проте, при застосуванні першого біопрепарату тільки в одного кроленяти через 24 години була відмічена сильна загальна реакція, яка зникла через добу. Реакції місцевого характеру були найбільш вираженими через 24 години після інєкції як протипастерельозної, так і асоційованої вакцин у 38,7 та 40,2 % кроликів, відповідно. В однієї тварини, щепленої вакциною першої серії, була відмічена більш сильна місцева реакція, яка проявлялася збільшенням підколінного лімфовузла. Віддалених реакцій на препарати не було виявлено.

При визначенні антигенних властивостей експериментальних серій вакцин установлено, що протипастерельозна і асоційована вакцини спричиняли підвищення титрів аглютинуючих антитіл до бактерій, з яких були виготовлені біопрепарати, відповідно до 6,52±0,49 та 7,12±0,37 log2 у порівнянні з аналогічними показниками тварин цієї ж групи до щеплення, які становили відповідно 3,72±0,25 та 3,32±0,0 log2, що свідчить про індукцію вакцинами специфічних аглютинінів.

Аналіз гематологічних показників показав, що в імунізованих тварин у порівнянні з контрольною групою збільшилась кількість не тільки еритроцитів і гемоглобіну, але і лейкоцитів, зокрема паличкоядерних та сегментоядерних субпопуляцій (відповідно у 1,1; 1,1; 1,6; 4,4; 1,5 рази), що також свідчить про активізацію клітинної ланки імунітету.

При вивченні імунобіологічних властивостей виготовлених препаратів установлено, що в крові щеплених тварин вірогідно в порівнянні з аналогічними показниками цієї ж групи до щеплення підвищились показники Е-РУК, ЕАС-РУК (відповідно у 1,3-1,6; 1,1-1,4 рази), що свідчить про стимуляцію вакцинами механізмів клітинного імунітету. Зниження кількості О-клітин лімфоцитів у щеплених тварин можна пояснити більш швидкою диференціацією лімфоцитів, тобто активізацією імунної відповіді у вакцинованих кроликів у порівнянні з тваринами контрольної групи. Імунорегуляторні індекси у тварин, щеплених протипастерельозною і асоційованою вакцинами, також підвищились відповідно до значень 2,5 та 3,1. Це свідчить про те, що в організмі імунізованих тварин кількість Т-хелперів у 2,5 та 3,1 рази перевищує рівень Т-супресорів і що у тварин відбувається активна імунна відповідь на введення досліджуваних вакцин. У сироватках крові щеплених вакцинами кроликів вірогідно збільшувався рівень імуноглобулінів класів G, A і M (відповідно у 1,4; 1,2-1,8; 1,3-1,6 рази) у порівняні з такими показниками до щеплення та контрольної групи, що переконливо свідчить про активізацію не тільки клітинної, але і гуморальної ланок імунітету. Особливо важливим є підвищення рівня Ig А, що свідчить про утворення локального імунітету слизових оболонок.