Вивчення змін фенотипічної характеристики основних субпопуляцій лімфоцитів в крові за допомогою моноклональних антитіл у хворих на різних етапах реабілітаційного періоду. Процеси активації та апоптозу в лімфоцитах хворих з наслідками ішемічних інсультів.
При низкой оригинальности работы "Порушення неврологічного та цитокіно-імунного статусів у хворих з наслідками ішемічних інсультів в період реабілітації", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИРобота виконана в Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця Науковий керівник: член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор, Цимбалюк Віталій Іванович, кафедра нейрохірургії НМУ імені О.О.Богомольця, завідувач кафедри Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, Зозуля Іван Савович, кафедра медицини невідкладних станів НМАПО імені П.Л.Шупика, МОЗ України, завідувач кафедри доктор медичних наук, професор, Грицай Наталія Миколаївна, кафедра нервових хвороб та нейрохірургії Української медичної стоматологічної академії, МОЗ України, завідувач кафедри Захист відбудеться 28.09.2006 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.01 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика за адресою: 04112, м. З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112, м.Дослідження останніх років значно розширили, а в більшості змінили бачення закономірностей мозкового кровообігу в нормі і патології, розкрили конкретні механізми різних форм судинних уражень головного і спинного мозку (Міщенко Т.С., 2005; Григорова І.А. та співавт., 2004; Зозуля І.С. та співавт., 2005). Незважаючи на суттєві успіхи у вивченні патологічних процесів, що призводять до зрушень функції імунної системи при ішемічному інсульті, послідовність їх виникнення, взаємозвязок та вплив на перебіг реабілітаційного періоду потребують більш глибокого вивчення. Ромоданова АМН України в рамках комплексної НДР “Розробити рекомендації диференційованого хірургічного лікування оклюзійно-стенотичних уражень церебральних артерій у хворих на артеріальну гіпертензію для попередження ішемічних порушень мозкового кровообігу” (№ держреєстрації 0103U000968). Підвищити ефективність діагностики, лікування та реабілітації хворих з наслідками ішемічних інсультів шляхом вивчення змін цитокіно-імунного і неврологічного статусів та їх кореляції. Дослідити процеси активації та апоптозу в лімфоцитах хворих з наслідками ішемічних інсультів в різні реабілітаційні періоди.Для вирішення поставленої мети та завдань дослідження було обстежено 100 хворих віком від 40 до 65 років з наслідками ішемічного інсульту в різні періоди хвороби та під час проведення реабілітаційного лікування. В усіх пацієнтів під час проведення КТ або МРТ дослідження було виявлено ознаки ішемічних уражень різної локалізації та розмірів. Під час збору анамнезу увагу було приділено, в першу чергу, зясуванню скарг хворого та основних симптомів захворювання, обставин та часу початку захворювання, виявленню можливих провокуючих факторів, а також хронології розвитку неврологічного дефіциту після початку захворювання. Найбільш частою скаргою (97%), була наявність астенічних проявів у вигляді загальної слабкості, нездужання, швидкої втоми, зниження апетиту, небажання спілкуватись, емоційної лабільності. У 78% пацієнтів було відзначено підвищення мязового тонусу на боці парезу, зниження тонусу спостерігалося у 2% пацієнтів, у решти пацієнтів (20%) змін тонусу мязів не виявлено.Проведений аналіз показників клітинної ланки імунітету в різні періоди реабілітації у хворих з наслідками ішемічного інсульту виявив, що вміст Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та основних імунорегуляторних субпопуляцій (CD4 та CD лімфоцитів) не має вірогідних відмінностей від значень цих показників у здорових осіб та характеризується збереженням відносного та абсолютного вмісту лімфоцитів (табл. Вміст CD3 лімфоцитів, CD4 лімфоцитів та CD8 лімфоцитів не мав вірогідних відмінностей (р>0,1) від даних контрольної групи та між собою за періодами, що свідчить, на нашу думку, як про відсутність супресивного впливу на Т-ланку імунітету у даної групи хворих, так і про збереженість функціональної активності клітинної ланки імунної системи в усі реабілітаційні періоди інсульту. 2, у хворих в ранній реабілітаційний період спостерігалося підвищення вмісту у сироватці крові прозапальних цитокінів: ФНП-б - 112,9±6,7 пг/мл, ІЛ-1в - 104,7±9,4 пг/мл, що майже в 2,3-2,9 разу перевищувало значення контрольної групи; ІЛ-6-104,5±8,2 пг/мл, рівень якого був майже в 10 разів вищим за такий у здорових осіб при незначно збільшеній кількості протизапального цитокіну; ІЛ-4 - 35,11±2,4 пг/мл. Якщо, як було показано вище, вміст В-клітин у хворих без неврологічних порушень був нижче значень контрольної групи, то у пацієнтів з помірними та вираженими неврологічними розладами спостерігався підвищений відсотковий вміст CD19 лімфоцитів порівняно зі здоровими особами, який становив 13,11±1,25 та 12,36±1,54% відповідно (див. табл. Вміст NK-клітин у хворих без порушень в неврологічному статусі та з легким дефіцитом був статистично нижчим за показники контрольної групи і становив 8,90±0,91 та 10,96±1,14% відповідною В той же час при більш виражених порушеннях в неврологічному статусі вміст CD16 лімфоцитів був вищим і відповідав показнику у здорових осіб.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДОСЛІДЖЕННЯ
Вывод
Проведений аналіз показників клітинної ланки імунітету в різні періоди реабілітації у хворих з наслідками ішемічного інсульту виявив, що вміст Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та основних імунорегуляторних субпопуляцій (CD4 та CD лімфоцитів) не має вірогідних відмінностей від значень цих показників у здорових осіб та характеризується збереженням відносного та абсолютного вмісту лімфоцитів (табл. 1).
Таблиця 1
Вміст основних та активованих субпопуляцій лімфоцитів у хворих з наслідками ішемічних інсультів залежно від реабілітаційного періоду (М±m)
Показник Хворі, обстежені в 1-й період, n=54 Хворі, обстежені в 2-й період, n=12 Хворі, обстежені в 3-й період, n=34 Контрольна група, n=25
Як видно з даних, наведених у табл. 1, вміст лейкоцитів та лімфоцитів у хворих в різні періоди інсульту не відрізнявся від значень контрольної групи та між собою і становив відповідно 7,24±0,69?109/л та 28,6±2,7% - в першій групі; 8,02±0,65?109/л та 26,32±2,3% - в другій; 6,98±0,81?109/л та 25,61±2,01% - в третій. Дані показники свідчили про те, що навіть у хворих у ранній реабілітаційний період не спостерігалось ознак гострої запальної реакції, які б проявилися лейкоцитозом або лімфопенією та нейрофільозом. Вміст CD3 лімфоцитів, CD4 лімфоцитів та CD8 лімфоцитів не мав вірогідних відмінностей (р>0,1) від даних контрольної групи та між собою за періодами, що свідчить, на нашу думку, як про відсутність супресивного впливу на Т-ланку імунітету у даної групи хворих, так і про збереженість функціональної активності клітинної ланки імунної системи в усі реабілітаційні періоди інсульту. У хворих в різні періоди реабілітації виявлено, що вміст B-лімфоцитів не мав суттєвих відмінностей в динаміці захворювання та не відрізнявся від даних контрольної групи (р>0,1). Вміст активованих лімфоцитів з фенотипом CD25 в усіх групах хворих був вірогідно нижчим (р0,01), ніж в пізній та період резидуальних явищ.
Під час проведення аналізу показників цитокінового статусу було також виявлено певні особливості кожного періоду хвороби (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст інтерлейкінів у сироватці крові хворих з наслідками ішемічних інсультів в різні реабілітаційні періоди (М±m)
Показник, пг/мл Хворі в 1-й період, n=54 Хворі в 2-й період, n=12 Хворі в 3-й період, n=34 Контрольна група, n=25
ФНП-б 112,9±6,7* 53,42±9,3 48,65±6,5 42,31±4,9
ІЛ-1в 104,7±9,4* 35,19±5,8 43,96±6,3 39,42±4,52
ІЛ-6 96,8±8,5* 15,38±2,4 9,91±0,73 10,31±2,3
ІЛ-4 35,11±2,4* 29,23±7,5 21,21±5,4 25,42±3,3
Як видно з даних, наведених в табл. 2, у хворих в ранній реабілітаційний період спостерігалося підвищення вмісту у сироватці крові прозапальних цитокінів: ФНП-б - 112,9±6,7 пг/мл, ІЛ-1в - 104,7±9,4 пг/мл, що майже в 2,3-2,9 разу перевищувало значення контрольної групи; ІЛ-6 -104,5±8,2 пг/мл, рівень якого був майже в 10 разів вищим за такий у здорових осіб при незначно збільшеній кількості протизапального цитокіну; ІЛ-4 - 35,11±2,4 пг/мл. У пізній реабілітаційний період та період резидуальних явищ вміст прозапальних інтерлейкінів суттєво зменшувався: вдвічі для ФНП-б (до 53,42±9,3 та 48,65±6,5 пг/мл відповідно періоду) та для ІЛ-1в (до 104,7±9,4 та 43,96±6,3 пг/мл), а вміст ІЛ-6 зменшився майже в десять разів - до 15,38±2,4 та 9,91±0,73 пг/мл. Концентрація ІЛ-4 в сироватці протягом всього періоду реабілітації залишалась стабільною та не відрізнялась від значень даного показника у здорових осіб.
Ранній реабілітаційний період характеризувався вірогідною активацією прозапальних цитокінів. При цьому спостерігалися як активація синтезу ФНП-б, яка призводила до посиленого апоптозу лімфоцитів та збільшення експресії FAS-рецептора, так і збільшення кількості ІЛ-1в. Останній, за даними літератури, стимулює експресію лейкоцитарно-адгезивних молекул на поверхні ендотелію, що призводить до виходу із крові лейкоцитів та їх міграції в судинну стінку, що складає сприятливі умови до коагуляції та тромбозу. В більш пізні терміни реабілітаційного періоду спостерігається нормалізація вмісту прозапальних цитокінів, що свідчить про завершення локальних запальних явищ та зменшення проапоптотичного впливу на лімфоцити, при відносно стабільній концентрації ІЛ-4 в сироватці крові.
Також в ході роботи було проведено оцінку імунологічних показників залежно від ступеня вираженості неврологічного дефіциту (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст популяцій та субпопуляцій лімфоцитів у хворих залежно від ступеня вираженості неврологічного дефіциту (М±m)
Показник Хворі в групі F1, n=4 Хворі в групі F2, n=40 Хворі в групі F3, n=24 Хворі в групі F4, n=32 Контрольна група, n=25
Вивчаючи кореляцію цитокіно-імунних порушень з неврологічним статусом, було виявлено певні закономірності. У хворих без неврологічних порушень виявлено вірогідно більший відносний вміст CD3 лімфоцитів, ніж в контрольній групі (р<0,01) та в інших групах хворих (р<0,01). При цьому вміст В-лімфоцитів у цієї групи хворих був вірогідно нижчим (р<0,01) за значення контрольної групи і становив 3,20±0,29%. Цей факт, на наш погляд, свідчить про активацію Т-ланки імунітету у хворих, які перенесли ішемічний інсульт та не мають в реабілітаційний період неврологічного дефіциту. Також була виявлена тенденція (р=0,05) до підвищення вмісту Т-хелперів (відсоток CD4 лімфоцитів становив 37,95±2,9%; при значенні в контрольній групі - 32,33±3,81%). В той же час в інших хворих з наявними ознаками неврологічного дефіциту вміст даної субпопуляції не мав вірогідних відмінностей від значень у здорових осіб. Як видно з даних, наведених в табл. 3, імунорегуляторний індекс у хворих з помірними неврологічними порушеннями (F3) був вірогідно нижчим (р<0,01) за даний показник в контрольній групі, а у хворих з вираженими порушеннями мав тенденцію до зниження (р=0,05) і становив 1,26±0,12.
Якщо, як було показано вище, вміст В-клітин у хворих без неврологічних порушень був нижче значень контрольної групи, то у пацієнтів з помірними та вираженими неврологічними розладами спостерігався підвищений відсотковий вміст CD19 лімфоцитів порівняно зі здоровими особами, який становив 13,11±1,25 та 12,36±1,54% відповідно (див. табл. 3). Вміст NK-клітин у хворих без порушень в неврологічному статусі та з легким дефіцитом був статистично нижчим за показники контрольної групи і становив 8,90±0,91 та 10,96±1,14% відповідною В той же час при більш виражених порушеннях в неврологічному статусі вміст CD16 лімфоцитів був вищим і відповідав показнику у здорових осіб.
Аналогічну тенденцію відзначено також і для активованих CD25 лімфоцитів: найнижчі показники - 3,25±0,34% - у хворих без неврологічного дефіциту; помірно знижений рівень - 9,23±0,87% - при легкому неврологічному дефіциті; значення, які відповідають показникам здорових осіб - при помірному і важкому неврологічному дефіциті (див. табл. 3). Відсоткова кількість активованих лімфоцитів, які експресують FAS-R була підвищеною при більш важких неврологічних порушеннях і становила 7,72±0,67% у хворих з помірним неврологічним дефіцитом та 7,56±0,71% у хворих з вираженим неврологічним дефіцитом (при значенні контрольної групи - 3,32±0,34%). У пацієнтів без неврологічних порушень відсоток CD95 лімфоцитів не мав статистично значущих відмінностей (р>0,01) від показників у здорових осіб.
Показники клітинного імунітету у хворих з помірними та вираженими неврологічними порушеннями у відновлювальному періоді не мали між собою вірогідних відмінностей. Для обох цих груп хворих була характерною збережена кількість Т- та NK-клітин та наявний В-лімфоцитоз. До того ж спостерігалося вірогідне зниження імунорегуляторного показника (CD4/CD8 лімфоцити), що оцінюється як один з несприятливих прогностичних критеріїв поновлення втрачених функцій.
Виявлені нами порушення в клітинній ланці імунітету у хворих з різним ступенем неврологічних порушень спонукали нас до вивчення питання про функцію імунокомпетентних клітин на основі синтезу про- та протизапальних цитокінів (табл. 4).
Таблиця 4
Вміст у сироватці крові хворих про- та протизапальних цитокінів залежно від ступеня вираженості неврологічних порушень (M±m)
Показник, пг/мл Хворі з F1-ступенем, n=4 Хворі з F2-ступенем, n=40 Хворі з F3-ступенем, n=24 Хворі з F4-ступенем, n=32 Контрольна група, n=25
Як видно з даних, наведених в табл. 4, у хворих без неврологічного дефіциту спостерігається відсутність підвищення вмісту в сироватці крові прозапальних цитокінів (вміст ФНП-б становить 52,02±4,7 пг/мл; ІЛ-1в - 45,02±4,6 пг/мл; ІЛ-6 - 7,0±0,96 пг/мл). В той же час у даної групи хворих виявлено високий вміст ІЛ-4 - 137,02±9,1 пг/мл, який має виражені протизапальні властивості.
У хворих з легким ступенем неврологічних порушень виявлено помірне, проте вірогідно більше (р0,1), проте вірогідно меншим був показник ІЛ-4 - 65,26±6,3 пг/мл.
І нарешті, при вираженому ступені неврологічних порушень в сироватці крові хворих відзначається велика кількість прозапальних цитокінів: ФНП-б -95,04±9,3 пг/мл; ІЛ-1в - 108,12±10,5 пг/мл; ІЛ-6 - 19,03±2,1 пг/мл. Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що у хворих, які перенесли ішемічний інсульт і не мають неврологічних порушень, спостерігається вміст прозапальних цитокінів, який відповідає показникам у здорових осіб. Це, на наш погляд, можна розглядати як прогностично сприятливу ознаку перебігу відновлювального періоду ішемічного інсульту. Нормальний вміст прозапальних цитокінів поєднується з високою кількістю у сироватці крові протизапального цитокіну ІЛ-4, який дозволяє “загасити” локальне вогнище запалення. На нашу думку, підвищений вміст ІЛ-4 в сироватці крові цих хворих повязаний з високим вмістом Т-лімфоцитів та Т-хелперів (див. табл. 4), продуктом яких він є.
В той же час виражені порушення в неврологічному статусі у хворих супроводжуються вираженими ознаками запалення - підвищеним вмістом у сироватці ІЛ-1в, ФНП-б, ІЛ-6. Посилений синтез ІЛ-6 в цій групі хворих може свідчити про максимальну активність запальних реакцій. Вказані ознаки можуть бути віднесені до несприятливих критеріїв перебігу відновлювального періоду в цій групі хворих. Посилений синтез прозапальних цитокінів, а саме ФНП-б, веде до збільшеної готовності лімфоцитів вступити в апоптоз, внаслідок чого в периферичній крові хворих з помірним та вираженим неврологічним дефіцитом спостерігається підвищений вміст СД95 лімфоцитів.
Після виявлення змін у клітинній ланці імунітету та цитокінового статусу у хворих з різним ступенем неврологічного дефіциту в різні періоди реабілітаційного лікування, ми вирішили за доцільне оцінити наведені вище показники у пацієнтів з різною локалізацією процесу (табл. 5).
Таблиця 5
Субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові у хворих в період реабілітації залежно від локалізації вогнища (М±m)
Показник Хворі з ураженням лівої півкулі, n=44 Хворі з ураженням правої півкулі, n=40 Хворі з ураженням стовбура мозку та мозочку, n=16 Контрольна група, n=25
Отже, найбільш глибокі імунологічні зміни виявлені при ураженні лівої півкулі. Вони полягають у вираженому В-лімфоцитозі, найнижчій серед усіх груп кількості активованих CD25 лімфоцитів та високому вмісті активованих клітин, які експресують FAS-рецептор. При ураженні правої півкулі спостерігаються мінімальні зрушення з боку клітинної ланки імунітету, але для даної групи властивий найвищий сироватковий рівень прозапальних цитокінів ФНП-б та ІЛ-1в.
Дослідженнями останніх років (Larose E., Ganz P., 2004; Gotto A.M., 2005) доведено, що препарати групи статинів, крім впливу на ліпідний обмін, можуть послаблювати запальні цитокінові реакції, що супроводжують церебральну ішемію, зменшують ймовірність ішемічного інсульту за рахунок стабілізуючого впливу на атеросклеротичні механізми, мають також антиоксидантні та потенційно нейропротекторні властивості. В схему базисної терапії за рекомендаціями Європейської асоціації неврологів нами було включено препарати для нормалізації артеріального тиску (переважно комбінація інгібіторів АПФ з антагоністами Са каналів в індивідуальних дозах), антиагрегантна терапія - аспекард в дозі 100 мг 1 раз на добу, статинова терапія - симвастатин в дозі 10 мг на добу, з метою покращання метаболічних процесів - актовегін в дозі 2,0 мг в/м 1 раз на добу, як антиоксидантна та антигіпоксична терапія використовувався препарат мілдронат в дозі 5,0 мг в/в 1 раз на добу, комплекс вітамінів групи В - мільгама 2,0 мг в/м через день. До комплексу реабілітаційних заходів було включено також фізіотерапевтичні процедури, масаж, лікувальну фізкультуру, заняття з логопедом та психологом за показаннями.
З метою вивчення впливу реабілітаційного лікування на цитокіновий та імунний статус хворих було проведено додаткове обстеження групи з 50 пацієнтів в динаміці, на початку терапії та через 14 днів прийому базової терапії. В ході динамічного обстеження було доведено, що застосування запропонованої схеми медикаментозної терапії в комплексі реабілітаційних заходів призводить до: - зменшення кількості активованих лімфоцитів з фенотипом CD95 , що характерно для зниження апоптоційних процесів в імунокомпетентних клітинах;
- вірогідного зменшення активованих лімфоцитів з фенотипом CD54 , що свідчить про зменшення експресії молекули адгезії ІСАМ-1, уповільнення міграції та адгезії клітин до атеросклеротичних бляшок;
- вірогідного зменшення кількості Т-цитотоксичних лімфоцитів супресорів та збільшення імунорегуляторного індексу, що є сприятливими прогностичними критеріями відновлення втрачених функцій у хворих з наслідками ішемічних інсультів;
- зменшення рівня прозапальних цитокінів до значень здорових осіб, що обумовлене, на нашу думку, здатністю симвастатину до посилення продукції NO, зменшенню запальних явищ та міграції клітин.
В ході роботи було запатентовано спосіб прогнозування відновлення втрачених функцій у хворих з наслідками ішемічного інсульту. В основу цього способу покладено вивчення цитокінового та імунного статусу пацієнтів з наслідками ішемічного інсульту та оцінка його кореляції з довготривалим (4-річним) катамнезом.
З цією метою було досліджено чотирьохрічний катамнез 50 пацієнтів. В результаті обстеження виявлено, що у 18 хворих неврологічний статус лишився без змін, у 10 - стан погіршився, 6 - померло, у 12 - стан покращився, у 4 хворих не виявлено порушень в неврологічному статусі внаслідок повного поновлення втрачених функцій.
Отримані результати співставили з цитокіно-імунним статусом. Під час вивчення кореляції даних показників було відзначено певні закономірності.
Показниками несприятливого прогнозу у хворих з наслідками ішемічного інсульту є: - вірогідне зниження (р<0,01) імунорегуляторного показника (CD4/CD8 лімфоцити) 1,18±0,13 і нижче;
- високий вміст CD95 лімфоцитів, що свідчить про підвищену готовність до апоптозу імунокомпетентних клітин, а саме 7,64±0,68 і вище;
- підвищений вміст інтерлейкіну-6 (18,25±2,2 і вище) свідчить про максимальну активність запальних реакцій.
Показниками сприятливого прогнозу у хворих з наслідками ішемічного інсульту є: - нормальний вміст прозапальних цитокінів - фактору некрозу пухлин (52,02±4,7), інтерлейкіну-1 (45,02±4,6), інтерлейкіну-6 (7,0±0,96);
- підвищений вміст протизапального інтерлейкіну-4 (до 137,02±9,1 і вище), який дозволяє “загасити” локальне вогнище запалення.
Таким чином, у пацієнтів, що перенесли ішемічне ураження головного мозку різної локалізації, в різні реабілітаційні періоди та з різним ступенем вираженості неврологічного дефіциту спостерігаються порушення в ланках імунної системи: від диференціювання лімфоцитів до перебігу в них процесів активації, апоптозу та синтезу імунокомпетентними клітинами про- та протизапальних цитокінів.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
