Методи молекулярно-генетичного аналізу на основі полімеразної ланцюгової реакції як ефективний інструмент дослідження генетичного різноманіття рослин. Порівняння та вибір ПЛР-маркерів для оцінки генетичних показників інформативності тирличу жовтого.
При низкой оригинальности работы "Порівняння показників інформативності ПЛР-маркерів для аналізу генетичного різноманіття (на прикладі Gentiana luteaL.)", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Одними з найефективніших інструментів дослідження генетичного різноманіття рослин є методи молекулярно-генетичного аналізу на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), які дозволяють отримати інформацію про генетичну структуру виду, унікальність генофонду окремих популяцій. Зокрема, це показник інформативності PIC (polymorphism information content), який було спершу використано для оцінки інформативності маркерних локусів під час побудови карт генетичного зчеплення у людини [1], а пізніше разом із індексом інформативності маркерів (marker index, MI), що дорівнює добутку PIC на кількість поліморфних локусів, застосовано для оцінки різних типів ПЛР-маркерів [2]. Роздільну здатність (resolving power, Rp) було запропоновано як показник здатності праймерів або систем ПЛР-маркерів розрізняти зразки між собою [3]. Для розширення спектру ділянок геному, що відрізняються за функціональним значенням, в генетичному аналізі було використано ПЛР-маркери кількох типів, а саме: ISSR-маркери, які виявляють міжмікросателітні ділянки, IRAP-, асоційовані з кінцевими послідовностями LTR-ретротранспозонів, а також CDDP-та RGAP-маркери, що можуть бути безпосередньо повязані із кодувальними ділянками функціонально важливих генів стійкості до хвороб та відповіді на стрес. Для ПЛР-За частотами наборів ПЛР-продуктів pi, аналізу використали 10 RAPD-, 9 ISSR-[7, 8], 9 отриманих з використанням окремих праймерів, CDDP-та 7 пар RGAP-праймерів [9, 10], а також визначали розрахункове число пар зразків, які 5 IRAP-праймерів, люб’язно наданих не може розрізнити праймер (ND) у вибірці з nПроведене дослідження показало, що всі використані показники, за винятком показника інформативності PIC, мають звязок середньої та високої сили між собою, а отже певною мірою характеризують інформативність ПЛР-маркерів, призначених для генетичного аналізу. Водночас, найефективнішим є показник розпізнавальна здатність, який найбільш повно враховує особливості розподілу поліморфних ампліконів серед досліджених зразків, а також дозволяє розрахувати кількість пар зразків, що не можуть бути розпізнані праймером або комбінацією праймерів у вибірці певного розміру.
Вывод
Проведене дослідження показало, що всі використані показники, за винятком показника інформативності PIC, мають звязок середньої та високої сили між собою, а отже певною мірою характеризують інформативність ПЛР-маркерів, призначених для генетичного аналізу. Водночас, найефективнішим є показник розпізнавальна здатність, який найбільш повно враховує особливості розподілу поліморфних ампліконів серед досліджених зразків, а також дозволяє розрахувати кількість пар зразків, що не можуть бути розпізнані праймером або комбінацією праймерів у вибірці певного розміру.
Роботу виконано за фінансової підтримки Цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій» в рамках проекту «Порівняльна геноміка у діагностиці генофонду деяких рідкісних видів рослин України».
144
Таблиця 3. Число нерозпізнаних пар (ND) для різних комбінацій праймерів з найбільшим значенням DL, розраховане за умови незалежності утворення наборів ПЛР-продуктів для 500 та 1000 зразків
1. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // Am. J. Hum. Genet. - 1980. - 32. - P. 314-331.
2. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanfey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis // Mol. Breeding. - 1996. - 2. - P. 225-228.
3. Prevost A., Wilkinson M.J. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars // Theor. Appl. Genet. - 1999. - 98. - P. 107-112.
4. Tessier C., David J., This P., Boursiquot J.M., Charrier A. Optimization of the choice of molecular markers for varietal identi?cation in Vitis vinifera L. // Theor. Appl. Genet. - 1999. - 98. - P. 171-177.
5. Червона книга України. Рослинний світ / За ред. Я.П. Дідуха. - К.: Глобалконсалтинг, 2009. - 900 с.
6. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh herbarium and mummified plant tissues // Plant Mol. Biol. - 1985. - 5. - P. 69-76.
7. Твардовська М.О., Страшнюк Н.М., Мельник В.М., Конвалюк І.І., Кунах В.А. RAPD-аналіз геномного поліморфізму деяких видів роду Gentiana L. флори України // Доповіді НАН України. - 2009. - 5. - С. 200- 204.
8. Конвалюк І.І., Мельник В.М., Дробик Н.М., Кравець Н.Б., Твардовська М.О., Кунах В.А. RAPD- і ISSR-аналіз генетичної мінливості у культурі тканин та органів тирличу звичайного (Gentiana pneumonanthe L.) // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. - 2009. - 9. - С. 22-31.
9. Collard B.C.Y., Mackill D.J. Conserved DNA-Derived Polymorphism (CDDP): a simple and novel method for generating DNA markers in plants // Plant Mol. Biol. Rep. - 2009. - 27. - P. 558-562.
10. Dong P., Wei Y.-M., Chen G.-Y., Li W., Nevo E., Zheng Y.-L. Resistance gene analog polymorphisms (RGAPS) in wild emmer wheat (Triticum dicoccoides) and their ecological associations // Genetic Resources and Crop Evolution. - 2009. - 56. - P. 121-136.
11. Мосула М.З., Конвалюк І.І., Мельник В.М., Бублик О.М., Андрєєв І.О., Дробик Н.М., Кунах В.А. Аналіз генетичної різноманітності популяцій Gentiana lutea L. методом маркування міжретротранспозонних послідовностей (IRAP-ПЛР) // Фізіологія рослин і генетика. - 2014. - 46, № 1. - С. 45-55.
12. Мосула М.З., Конвалюк І.І., Мельник В.М., Андрєєв І.О., Бублик О.М., Дробик Н.М., Кунах В.А. Генетичне різноманіття популяцій Gentiana lutea L. з хребта Свидівець Українських Карпат // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. - 2013. - 11, № 2. - С. 250-259.
1 Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, Ukraine, 03680, Kyiv, Akad. Zabolotnogo str., 150, e-mail: i.o.andreev@imbg.org.ua 2 Ternopil National Volodymyr Hnatiuk Pedagogical University, Ukraine, 46027, Ternopil, M. Kryvonis str., 2, е-mail: maryanamosula@gmail.com
COMPARISON OF INFORMATIVENESS INDICES OF PCR-BASED MARKERS FOR GENETIC DIVERSITY ANALYSIS AS EXEMPLIFIED BY GENTIANA LUTEA L.
The aim of the work was to compare informativeness indices of PCR-based markers for genetic diversity assessment and select the most efficient from them. Methods. The study involved 30 plants from two G. lutea populations (Svydivets ridge, Ukrainian Carpathians) which were subjected to RAPD, ISSR, CDDP, RGAP, and IRAP analyses. To evaluate the efficiency of the primers, the total number of generated bands, 145 the proportion of polymorphic bands, the resolving power (Rp), the discrimination power (D), the discriminating power (DL), the polymorphism information content (PIC), the marker index (MI) and the number of non-differentiated pairs (ND) were calculated. Results. The informativeness indices were calculated for each primer based on the frequency of individual bands and banding patterns. This was followed by correlation analysis of the indices. A very strong relationship was found between DL and ND, and between MI and proportion of polymorphic amplicons (p < 0.001). There were also high or moderate significant correlations between other parameters, with the exception of PIC. The estimated number of non-differentiated pairs and that determined experimentally were very close for all primers. Conclusions. All of the informativeness indices, except PIC, describe the efficiency of PCR-based markers in some way. The comparison of different markers showed that the most informative was the discriminating power. It can be used successfully to select the primers for genetic diversity assessment, while the confusion probability (C) can be used to determine the minimal set of primers necessary to discriminate between the genotypes in a sample of N accessions.
Key words: discriminating power (DL), informativeness indices of markers, PCR-based markers.
1 Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, Україна, 01014, м. Київ, вул. Тимірязєвська, 1
2 Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2А, е-mail: galinabayer@mail.ru
ДОСЛІДЖЕННЯ СЕЛЕКЦІЙНОГО МАТЕРІАЛУ РИЖІЮ ПОСІВНОГО (CAMELINA SATIVA (L.) CRANTZ) ЗА ДОПОМОГОЮ ISSR-АНАЛІЗУ
Інтерес до біопалива спонукав дослідників критично оцінити альтернативні джерела сировини для виробництва біодизелю. Один із способів подолати попит на олії - використання нетрадиційних олійних рослин. До таких рослин, що не використовуються широко в харчовій промисловості, належить Camelina sativa (L.) CRANTZ (рижій посівний) родини Brassicaceae, який є найбільш перспективною в цьому відношенні культурою. Ще на початку XX століття рижій вирощувався на невеликих площах в Україні, Росії, Європі, головним чином з метою отримання олії для освітлення та фарбування. Однак протягом тривалого часу ця культура вважалася буряном, що засмічує посіви льону. Поновлення інтересу до C. sativa в якості сировини для отримання біопалива повязане з його посухостійкістю і невибагливістю до родючості ґрунтів. Рижій, як скоростигла культура, вирізняється коротким вегетаційним періодом, високою адаптаційною здатністю до абіотичних стресових факторів, стійкістю до хвороб та шкідників [1, 2]. У відділі нових культур НБС ім. М.М. Гришка НАН України створено цінний генофонд рижію [3]. До того ж важливість C. sativa для виробництва біодизеля вже добре доведено [4]. Олія та біодизель з рижію були використані в якості палива у випробуваннях двигуна з багатообіцяючими результатами [4, 5]. Незважаючи на свій потенціал щодо отримання олії, на цей час інформація про стан генофонду цього виду, особливо новостворених сортозразків, залишається досить обмеженою.
Зі збільшенням кількості нових подібних або тісно повязаних сортів рижію все актуальнішим стає процес реєстрації створеного сорту, його сертифікації та захисту авторських прав селекціонерів. Молекулярні маркери відрізняються високим рівнем поліморфізму між сортами і можуть ефективно використуватися для оцінки загальних генетичних характеристик рослин [6]. Тому метою нашої роботи було за допомогою ISSR-аналізу вивчити генетичну мінливість і диференціацію деяких форм та сортів C. sativa, зробити їх генетичне профілювання.
Матеріали і методи
Для ISSR-аналізу використовували 8 форм та 4 сорти рижію посівного (Camelina sativa) з колекції Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка, насіння яких висівали в грунт в умовах культуральної кімнати. ДНК екстрагували з 10-денних проростків за допомо-
146
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
