Порівняння морфології та стану хромосомного апарату жіночих гамет (ооцитів, яйцеклітин) та ембріонів великої рогатої худоби і свині, отриманих в умовах організму та поза ним. Можливі аномалії яйцеклітин та зигот корів і свиней при заплідненні in vitro.
При низкой оригинальности работы "Порівняльний аналіз ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, отримані in vivo та in vitro", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ ООЦИТІВ, ЯЙЦЕКЛІТИН ТА ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ І СВИНІ, ЩО БУЛИРобота виконана у відділі біотехнології відтворення і генної інженерії Інституту тваринництва УААН та лабораторії генної інженерії Харківського біотехнологічного центру УААН і Міністерства освіти і науки. Захист дисертації відбудеться ‘’24 ‘’квітня 2001 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.Однак досліджень, спрямованих на вивчення стану хромосомного апарату цих яйцеклітин та ембріонів, дуже мало (Iwasaki S., Nakahara T., 1990; Yadaw B.R. et al., 1991; Iwasaki S. et al., 1992). Метою роботи було порівняння морфології та стану хромосомного апарату жіночих гамет (ооцитів, яйцеклітин) та ембріонів великої рогатої худоби і свині, які були отримані в умовах організму та поза ним. Провести цитогенетичний аналіз ооцитів та яйцеклітин великої рогатої худоби і свині, що дозріли в умовах in vivo та in vitro. Обєкт дослідження: ооцити, яйцеклітини і ембріони великої рогатої худоби та свині, що були отримані в умовах in vivo та in vitro. При виконанні роботи використовували біотехнологічні методи (виділення ооцитів із яєчників тварин, культивування ооцитів та ембріонів поза організмом), морфологічні (оцінка ооцитів, яйцеклітин та ембріонів за морфофізіологічними показниками) та цитогенетичні (для виявлення аномалій хромосомного апарату) методи досліджень.Тому нами була вивчена часова послідовність стадій мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом в оптимізованих нами умовах (табл.1-2). Так, середня кількість ооцитів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників свиней обємом 12-16 мл з жовтим тілом, було достовірно нижче (Р<0,01), ніж кількість таких ооцитів, які були отримані із яєчників обємом 8-12 мл. Також достовірно нижче була доля яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників обємом 8-15 мл, у порівнянні з долею яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників обємом 15-19 мл. При морфологічному аналізі (табл.6) видалених з передовуляторних фолікулів яєчників ооцитів було виявлено, що їх можна розділити на два типи: ооцити з ослизненим кумулюсом (ооцити з повністю експандованим кумулюсом, який представлений желеподібною речовиною, з темними включеннями) та ооцити з розпушеним кумулюсом. Ооцити другого типу за своєю морфологією були подібні до ооцитів, які досягли другої метафази мейозу при культивуванні поза організмом.
Вывод
Кінетика мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом
Відомо, що тривалість мейозу, який складає основну частину процесу дозрівання ооцитів, та його стадій у ссавців видоспецифічна. Крім того, за даними різних авторів, в умовах in vitro, вона дуже коливається як для корів, так і для свиней (Suss U. et al., 1988; Betancourt M. et al., 1993; Yoshida M. et al., 1993). Тому нами була вивчена часова послідовність стадій мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом в оптимізованих нами умовах (табл.1-2).
Таблиця 1
Кінетика мейозу в ооцитах корів, які культивували поза організмом
*- Усі значення вказані в відсотках від кількості досліджених ооцитів у цей проміжок часу. а -Р< 0,05
Таким чином, нами було встановлено, що перше мейотичне ділення в ооцитах свиней займає майже у два рази більше часу ніж цей процес в ооцитах корів. В ооцитах корів він складає 24-26 годин, а в ооцитах свиней 42-44 години. Тому запліднення яйцеклітин поза організмом цих видів тварин необхідно проводити у ці проміжки часу.
Вплив індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом
Першим етапом біотехнології культивування ембріонів поза організмом є дозрівання ооцитів з метою отримання повноцінних яйцеклітин. На цьому етапі ооцити отримують, як правило, із групи яєчників. Тому при низькому рівні дроблення зигот не можливо точно визначити причини, які його визвали тому, що це може бути обумовлено або впливом індивідуальних якостей ооцитів або ж умовами дозрівання. Нами були проведені експерименти по культивуванню ооцитів із окремих яєчників для зясування можливого впливу їх індивідуальних властивостей на дозрівання поза організмом. Для наведення та більшої наочності отриманих результатів ми обєднали яєчники у три групи за їх обємом. У кожній групі ми виділили дві підгрупи: яєчників з жовтим тілом та без нього. В табл. 3-4 наведена середня ефективність дозрівання ооцитів свиней та корів поза організмом із окремих яєчників.
Так, середня кількість ооцитів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників свиней обємом 12-16 мл з жовтим тілом, було достовірно нижче (Р<0,01), ніж кількість таких ооцитів, які були отримані із яєчників обємом 8-12 мл. Також достовірно нижче (Р< 0,001) була доля повноцінних яйцеклітин, отриманих при дозріванні ооцитів із яєчників обємом 8-12 мл без жовтого тіла, у порівнянні з долею яйцеклітин, отриманих із яєчників свині обємом 12-16 мл з жовтим тілом.
Таблиця 3
Середня ефективність дозрівання ооцитів свині поза організмом із окремих яєчників
Обєм яєчника, Тип яєчника Кіл-ть яєчників Середня кількість, шт Доля повноцінних мл шт ооцитів яйцеклітин на МІІ яйцеклітин на МІІ, %
А середня кількість ооцит-кумулюсних комплексів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників корів обємом 8-12 мл була достовірно нижча ніж середня кількість таких ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників обємом 15-19 мл без жовтого тіла.
Таблиця 4
Середня ефективність дозрівання ооцитів корів поза організмом із окремих яєчників
Обєм яєчника, Тип яєчника Кіл-ть яєчників Середня кіл-ть, шт Доля повноцінних мл шт ооцитів яйцекле- тин на МІІ яйцеклітин на МІІ, %
Також достовірно нижче була доля яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників обємом 8-15 мл, у порівнянні з долею яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників обємом 15-19 мл.
Таким чином, можливо зробити висновок, що ооцити корів, отриманні із яєчників корів обємом 15-19 мл без жовтого тіла, та ооцити свиней, отримані із яєчників обємом 12-16 мл, але які мають жовте тіло, володіють більш високою ефективністю дозрівання.
Порівняльний аналіз ооцитів корів та свиней, які були отримані в різних умовах культивування
Багато спадкових захворювань обумовлено хромосомними та геномними мутаціями, які виникають в статевих клітинах у процесі гаметогенезу навіть в природних умовах організму. У неадекватних умовах культивування частота зявлення цих аномалій, можливо, зростає. Тому нами було проведено аналіз ооцитів, які дозрівали в яєчниках (in vivo) та тих, які дозрівали поза організмом.
Ооцити свиней та корів, що дозріли в природних фізіологічних умовах, ми отримували методом аспірації із передовуляторних фолікулів яєчників. Нами було отримано 52 яйцеклітини корів і 60 яйцеклітин свиней (табл.5). Серед них з метафазними пластинками (МІІ) без аномалій було 46,2% та 81,7% яйцеклітин корів та свиней, відповідно.
Таблиця 5
Порівняльний аналіз яйцеклітин корів та свиней, отриманих в умовах in vivo та in vitro
Умови отримання Вид тварин Загальна кількість Відібрано для куль Метафаза ІІ мейоза жіночих гамет тивувания, шт (%) без аномалій, шт (%)а з аномалією, шт (%)а in vivo Велика рогата худоба 52 - 24 (46,2) 28 (53,8)
Свиня 60 - 49 (81,7) 11 (18,3) in vitro Велика рогата худоба 255 120 (47,1) 87 (34,2) 33 (12,9)
Свиня 265 130 (19,1) 91 (34,4) 39 (14,7) а - доля від загальної кількості жіночих гамет
Із яєчників забитих тварин було отримано 255 ооцитів корів та 265 ооцитів свині на різних стадіях розвитку. Потім нами було відібрано 120 ооцитів корів та 130 ооцитів свиней, придатних до наступного культивування. Після їх дозрівання у культурі до метафази ІІ було проведено цитогенетичний аналіз. Було встановлено, що тільки 34,2% яйцеклітин корів та 34,4% яйцеклітин свиней від початково видалених з яєчників ооцитів мали нормальний набір хромосом на МІІ мейозу.
При морфологічному аналізі (табл.6) видалених з передовуляторних фолікулів яєчників ооцитів було виявлено, що їх можна розділити на два типи: ооцити з ослизненим кумулюсом (ооцити з повністю експандованим кумулюсом, який представлений желеподібною речовиною, з темними включеннями) та ооцити з розпушеним кумулюсом. Ооцити другого типу за своєю морфологією були подібні до ооцитів, які досягли другої метафази мейозу при культивуванні поза організмом.
Таблиця 6
Аналіз ооцитів, отриманих із передовуляторних фолікулів яєчників корів та свиней
Вид тварин Тип ооцитів Кіл-ть ооцитів, (%) ТІ- МІІ, (%) Клампінг, (%) Фрагментація, (%)
Велика рогата з ослизненим кумулюсом 30* (57,7) 2 (6,6) 8 (26,7) 20 (66,7) худоба з розпушеним кумулюсом 22 (42,3) 22 (100) 0 0
При порівнянні ооцитів, нами було виявлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Усі аспіровані нами ооцити з розпушеним кумулюсом знаходились на стадії телофази І - метафази ІІ мейозу і ніяких аномалій у них не знайдено. При проведені цитологічного аналізу ооцитів з ослизненим кумулюсом було встановлено, що їх хромосоми в більшості випадків були повністю або частково дегенеровані, хоча зустрічалися ооцити з нормальною ТІ- МІІ.
Аналізуючи ооцити корів та свиней, які дозріли в культурі in vitro (табл.7), нами були виявлені такі аномалії, як: диплоїдна метофаза ІІ, анеуплоїдія, клампінг та фрагментація хромосом. В яйцеклітинах корів, що культивували поза організмом, було знайдено 27,5% , а в яйцеклітинах свиней 30% аномалій хромосомного апарату.
Таблиця 7
Результати цитогенетичного аналізу яйцеклітин, що дозріли поза організмом*
Вид тварин Анеуплоїдія,(%) Поліплоідія,(%) Фрагментація хромосом,(%) Клампінг хромосом, (%) Всього аномалій, (%)
* - У вигляді дробу показано відношення кількості ооцитів з зазначеною аномалією до загальної кількості проаналізованих ооцитів
Таким чином, нами було встановлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Виявлено, що доля усіх аномалій в яйцеклітинах корів та свиней, культивованих поза організмом, знаходиться на однаково високому рівні і складає 27,5% та 30%, відповідно.
Запліднення яйцеклітин сільськогосподарських тварин поза організмом
Пізнання механізмів запліднення та розробка ефективних методів управління цим процесом є важливим для регулювання розмноження ссавців. Процес запліднення може супроводжуватись деякими порушеннями, наприклад, поліспермією або партеногенезом, а частота порушень складає 31% та залежить від типу овуляції, місця запліднення, виду тварин та віку донора (Понд У.Дж., Хаупт К.А., 1983; Дыбан А.П., 1988; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989; Левин К.Л., 1990). У наших дослідженнях по заплідненню яйцеклітин корів та свиней поза організмом також було виявлено поліспермне запліднення (табл.8).
Таблиця 8
Поліспермне запліднення яйцеклітин корів та свиней поза організмом
Вид Кількість яйцеклітин та ембріонів, шт тварин проаналізовано із них поліспермних, (%)
Велика рогата худоба 88 15 (17,0) *
Свиня 101 33 (32,7) *
* - Р < 0,01
При цьому рівень поліспермного запліднення у великої рогатої худоби був вірогідно нижче (Р< 0,01) у порівнянні з свинею.
Спонтанний партеногенез у наших дослідах не був виявлений (табл.9). Хоча не можна заперечувати, що отримані ембріони можуть розвиватися за типами гіногенезу або ж андрогенезу.
Таблиця 9
Результати запліднення поза організмом та спонтанного партеногенезу у яйцеклітинах сільськогосподарських тварин
Вид тварин Ооцитів у досліді Яйцеклітин, шт Рівень дроблення яйцеклітин, що осіменяли не осіменяли осіменяли, (%) не осіменяли
Велика рогата худоба 100 50 50 20 (40)а 0а Свиня 70 35 35 17(48,5)в 0в а- Р < 0,001 ; в - Р < 0,001
Аналіз ранніх ембріонів великої рогатої худоби та свині, що були отримані поза організмом
Запліднення яйцеклітин та культивування ембріонів поза організмом повязано з деякими труднощами, наприклад, “блоком розвитку”. У ембріонів великої рогатої худоби він спостерігається на стадії 8-16 клітин, а у ембріонів свині на стадії 4-8 клітин.
Оцінюють та відбирають ембріони за їхньою відповідністю стадії розвитку фактичному віку ембріонів, за відношенням до тест-фарбників, інтенсивностю обміну речовин, за здібністю досягати відповідної стадії розвитку в культурі in vitro, але як правило їх оцінюють та відбирають за морфологічними ознаками.
При морфологічному аналізі отриманих ембріонів корів, культивованих 56 годин, були виявлені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до стадії ранньої морули (рис.1)
А при морфологічному аналізі, отриманих нами ембріонів свиней (рис.2), що культивували 48 годин, нами були знайдені ембріони від 2-х клітинної стадії розвитку до 8-16 клітинної стадії.
Рис. 1 Морфологічний аналіз ембріонів великої рогатої худоби після 56 годин культивування поза організмом
Рис. 2 Морфологічний аналіз ембріонів свині після 48 годин культивування поза організмом
При цитогенетичному аналізі отриманих у культурі ембріонів як свиней, так і корів було виявлено, що вони не подолали “блоку розвитку”. Так, ембріони корів, морфологічно оцінені нами як 16-ти клітинні ембріони - морули, виявились фрагментованими 8-10-ти клітинними ембріонами, або навіть дегенерованими яйцеклітинами. Така сама картина спостерігалась і при аналізі ембріонів свиней. Ембріони, морфологічно оцінені як 8-16-ти клітинні, виявилися 4-6-ти клітинними ембріонами або ж фрагментованими яйцеклітинами. Це ще раз вказує на неадекватність оцінки ембріонів за морфологічними ознаками та на необхідність застосування цитогенетичного аналізу як додаткового методу визначення повноцінності зародків.
Під час вивчення метафазних пластинок бластомерів у ембріонах як свиней, так і корів були виявлені аномалії типу: поліплоїдія, гаплоїдія та порушення цитотомії.
Так, під час цитогенетичного аналізу в 2-3-х клітинних ембріонах великої рогатої худоби було виявлено 18,5% аномалій, в 4-5-ти клітинних - 20%, а в 6-8-ми клітинних - 25% (табл.10).
Таким чином, спостерігається тенденція збільшення частки геномних аномалій з ускладненням стадії розвитку ранніх ембріонів корів.
Таблица 10
Цитогенетичний аналіз ембріонів корів, що культивували поза організмом
Стадія (доля від Кількістьзагальної ембріонів, кількості шт., (%) розвитку проаналі- що мають аномалії ембріону зовано поліплоїдія гаплоїдія порушення цитотомії всього
2-3-х клітин. 27 3(11,1) 1(3,7) 1(3,7) 5(18,5)
4-5-ти клітин. 15 1(6,7) 2(13,3) 3(20)
6-8-миклітин. 8 1(12,5) 1(12,5) 2(25)
Всього 50 5(10,0) 4(8,0) 1(2,0) 10(20)
У наших дослідженнях при цитогенетичному аналізі ембріонів свиней (табл. 11) було знайдено 20,1% аномалій в 2-3-х клітинних ембріонах, 3,1% - в 4-5-ти клітинних та 28,6% - в 6-8-ми клітинних ембріонах.
Таке зниження долі геномних аномалій у 4-5-ти клітинних ембріонах випадає із загальної картини збільшення аномалій з просуванням стадії розвитку, як це спостерігалось у ембріонів великої рогатої худоби. Однак, це може бути повязано з різним механізмом та часом усунення дегенерованих або аномальних ембріонів. Можливо, у великої рогатої худоби усунення аномальних ембріонів проходить на більш пізніх стадіях, а у свиней - на 2-х клітинній стадії.
Таким чином, причиною невдач запліднення та культивування поза організмом ооцитів та ембріонів може бути як неповноцінне цитоплазматичне та ядерне дозрівання ооцитів, так і хромосомні аномалії в ооцитах та ембріонах. Час, а, можливо, і механізм загибелі ембріонів з аномаліями є видоспецифічним.
Таблиця 11
Цитогенетичний аналіз ембріонів свині, що культивували поза організмом
Стадія (доля від Кількістьзагальної ембріонів, кількість, шт%) розвитку проаналі- що мають аномалії ембріона зовано поліплоїдія гаплоїдія порушення цитотомії всього
2-3-х клітин 15 1(6,7) 1(6,7) 1(6,7) 3(20,1)
4-5-ти клітин 32 1(3,1) 1(3,1)
6-8-миклітин 7 1(14,3) 1(14,3) 2(28,6)
Всього 54 3(5,6) 2(3,7) 1(1,8) 6(11,1)
Аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що були отримані в умовах in vivo та in vitro
За літературними джерелами в ембріонах, які були отримані з організму самиць, приктично всі бластомери мають ядра. У дослідженнях по аналізу дегенерованих ембріонів (табл.12), що отримані нехірургічним шляхом із рогів матки на 7-9 добу, нами було виявлено, що доля бластомерів без ядер у них складає 2,5% (7/281).
Таблиця 12
Порівняльній аналіз ембріонів великої рогатої худоби, що отримані в умовах in vivo та in vitro
Умови культивування Кіл-ть ембріонів, Кіл-ть бластомерів, шт (доля від проаналізованних, %) шт проаналізовано з них з ядрами без ядер in vivo 17 281 274 (97,5) 7 (2,5)* in vitro 78 596 292 (49) 304 (51)*
* - Р < 0,001
А в ембріонах, що отримані при культивуванні поза організмом, тільки 49% (292/596) бластомерів мали ядра.
Таким чином, можна припустити, що дегенерація ембріонів великої рогатої худоби, які отримані у природних фізіологічних умовах та в культурі in vitro, проходить різними шляхами. Для ембріонів, що отримані заплідненням поза організмом, - це фрагментація цитоплазми або “хибне” (“несправжнє”) ділення, а для ембріонів, що отримані в природних фізіологічних умовах організму, - це вплив генетичних мутацій, порушень процесу митозу і т.д.
висновки
Дозрівання ооцитів корів у середовищі ТСМ-199 з 10% фетальної сироватки теляти і гормонами при 5% СО2 в повітрі та температурі 38,50С продовжується 24-26 годин, а ооцитів свиней за таких самих умов, але з додаванням 5-10% фолікулярної свинячої рідини в середовище триває 42-44 години.
Ооцити корів, що отримані із яєчників обємом 15-19 мл без жовтого тіла та ооцити свиней, що отримані із яєчників обємом 12-16 мл, але мають жовте тіло, володіють більш високою ефективністю дозрівання у порівнянні з іншими типами яєчників.
Кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, що отримані із яєчників великої рогатої худоби, була вірогідно (Р< 0,05) вища, ніж кількість таких самих ооцитів, що отримані із яєчників свиней.
Культивування поза організмом яйцеклітинах корів та свиней призводить до однаково високого рівня аномалій, доля яких складає 27,5% і 30%, відповідно.
Рівень поліспермії у свиней при заплідненні поза організмом спостерігається вірогідно вищий (Р< 0.01), ніж у великої рогатої худоби та складає 32,7% і 17%, відповідно.
Ранні ембріони великої рогатої худоби та свині, які отримані заплідненням поза організмом, в середньому мають, відповідно, 20% и 11,1% аномалій хромосомного апарату.
Аномалії хромосомного апарату в ембріонах корів накопичуються (на рівні тенденції) з просуванням стадії розвитку ембріона, а в ембріонах свиней така тенденція не спостерігається.
Дегенерація ембріонів великої рогатої худоби та свині, що розвивалися поза організмом, проходить шляхом несправжнього ділення або фрагментації цитоплазми, що призводить до появи бластомерів без ядер.
Ембріони великої рогатої худоби, що розвиваються в умовах організму, налічують у багато разів меншу кількість бластомерів без ядер в порівнянні з ембріонами, що отримані поза організмом.
пропозиції виробництву
Запліднення яйцеклітин корів та свиней, які дозрівали поза організмом, необхідно проводити через 24-26 годин та 42-44 години, відповідно.
Для визначення ефективності нових середовищ для культивування дозрівання ооцитів необхідно проводити із кожного окремо взятого яєчника.
Отримані дисертантом дані можуть бути використані у курсі лекцій з біотехнології, генетики та біології розвитку сільськогосподарських тварин.
список опублікованих праць
Щегельская Е.А., Щербак Е.В. Динамика событий первого мейотического деления в ооцитах коров и свиней при культивировании вне организма// Научно-технический бюллетень ИЖ УААН. -1996.- №72. - С.26-30.
Дисертантом була виконана частина серій експерименту по встановленню хронології подій першого поділу мейозу в ооцитах корів та свиней, результати яких потім були узагальнені з результатами серій експерименту, що були виконані співавтором.
2. Щербак Е.В. Порівняльний аналіз ембріонів великої рогатої худоби, одержаних в умовах in vivo та in vitro// Научно-технический бюллетень ИЖ УААН. -1998.- №73. - С.81-84.
3. Щербак Е.В., Безуглый Н.Д. Частота геномных аномалий в эмбрионах крупного рогатого скота и свиней при культивировании in vitro //Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - 1998. - №75. - С.205-209.
Дисертант виконав експериментальну частину, провів аналіз та узагальнення отриманих результатів.
Щербак Е.В. Анализ ооцитов коров и свиней, полученных в условиях in vivo и in vitro// Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - 1998. - №75. - С.210.
Щербак Е.В. Цитогенетичний анализ эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo и in vitro // Матеріали Міжнародної науково-виробничої конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин” (жовтень, 1997, Асканія-Нова). - 1997. - С.97.
Щербак Е.В. Сравнительный анализ частоты геномных аномалий в эмбрионах коупного рогатого скота и свиней, полученных вне организма. // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (м.Одеса) - 1998, Київ. - С.135-137.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
