Порівняльне вивчення просторової структури ТРНКser і ТРНКleu із thermus thermophilus і ділянок їхнього контакту з гомологічними аміноацил - ТРНК синтетазами - Автореферат

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ Роботу виконано у відділі ензимології білкового синтезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Тукало Михайло Арсентійович, Інститут молекулярної біології і генетикиАле разом з тим було виявлено, що просторова структура ТРНК не лише відіграє роль каркасу для належної репрезентації нуклеотидів - елементів впізнаваня. Для впізнавання TPHKSER і TPHKTYR важливе значення мають довжина і правильна орієнтація варіабельної гілки, для TPHKLEU - особливості будови корової частини (tertiary core) макромолекули, тоді як роль довгої варіабельної гілки не зясовано. На сьогодні отримано кристали та вивчено будову лише двох комплексів ТРНК ІІ класу з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами, а саме TPHKSER - серил-ТРНК синтетаза і TPHKTYR - тирозил-ТРНК синтетаза із Thermus thermophilus (Biou, 1994; Yaremchuk, 2002). Її виконано в рамках бюджетної теми “Вивчення молекулярних механізмів специфічного впізнавання i аміноацилювання ТРНК аміноацил-ТРНК синтетазами другого класу”, (номер державної реєстрації - 0100U000793), а також за підтримки гранта № 75195-4801 “Структурні основи специфічного впізнавання аміноацил-ТРНК синтетазами гомологічних амінокислот і ТРНК” Медичного інституту ім. Метою наших досліджень було встановити спільні та відмінні риси у просторовій організації TPHKSER і TPHKLEU із T.thermophilus, а також визначити ділянки контакту цих ТРНК з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами.Визначення ділянок контакту TPHKSER і TPHKLEU з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами здійснювали методом захисту фосфатів ТРНК аміноацил-ТРНК синтетазами від модифікації етилнітрозосечовиною відповідно до (Vlassov, 1981). Аналіз послідовностей D-петель і варіабельних гілок TPHKSER і TPHKLEU виявив , що D - петля TPHKSER має структуру ? =1, ?=3, між варіабельним стеблом і нуклеотидом у положенні 48 немає неспарених нуклеотидних залишків; у TPHKLEU D-петля має структуру ? =2, ?=2 і присутній один неспарений залишок між варіабельним стеблом і нуклеотидом 48, що є характерними особливостями послідовностей TPHKSER і TPHKLEU із клітин прокаріотів. Оскільки атом N3 цитозину бере участь в утворенні Вотсон-Криківських пар нуклеотидів, а реакції модифікації залишків гуанозину і аденозину чутливі до стекінг-взаємодій, що виникають на двоспіральних ділянках ТРНК, визначити участь у просторових взаємодіях можливо лише для тих залишків, які розташовані на одноланцюгових ділянках. 4) видно, що в умовах, які стабілізують просторову структуру, в TPHKLEU T.thermophilus низький рівень модифікації мають фосфати D-гілки (Р11, Р12, Р21, Р22), фосфати, які розташовані у кутах між антикодоновим і варіабельним стеблами (Р45) та між варіабельним і Т-стеблами (Р48), а також у Т-петлі (Р58-60).У дисертаційній роботі досліджено просторову структуру прокаріотичних TPHKSER і TPHKLEU у розчині, а також ділянки контакту цих ТРНК з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування ТРНК ІІ класу. Визначено рівень модифікації залишків фосфорної кислоти етилнітрозосечовиною, залишків гуанозину і цитидину - диметилсульфатом, аденозину - діетилпірокарбонатом у TPHKSER(GCU) і TPHKSER(GGA) і виявлено нуклеотиди, які беруть участь у підтриманні просторової структури цих ТРНК. Визначено рівень модифікації специфічними хімічними реагентами залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у TPHKLEU із T.thermophilus та проведено порівняння з відповідними узагальненими даними, одержаними для TPHKSER T.thermophilus, що дозволило встановити відмінності в реакційній здатності фосфатів нуклеотидів, розташованих в основі варіабельного стебла в TPHKSER і TPHKLEU, а також виявити відмінності в реакційній здатності основ нуклеотидів - учасників корових триплетних взаємодій. Методом хімічних модифікацій виявлено залишки фосфорної кислоти TPHKSER, реакційна здатність яких знижена у присутності серил-ТРНК синтетази із T.thermophilus, і встановлено, що основною ділянкою взаємодії з ферментом є варіабельне стебло. Показано, що фермент взаємодіє з TPHKLEU з боку D-петлі та утворює контакти з фосфатами нуклеотидів-учасників корових триплетних взаємодій, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей в побудові корових частин TPHKSER і TPHKLEU із T.thermophilus для впізнавання лейцил-ТРНК синтетазою.

Основний зміст

У дисертаційній роботі досліджено просторову структуру прокаріотичних TPHKSER і TPHKLEU у розчині, а також ділянки контакту цих ТРНК з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами, що важливо для вивчення структурних основ функціонування ТРНК ІІ класу.

Методом швидкого гель-секвенування встановлено нуклеотидні послідовності двох ізоакцепторних TPHKSER і однієї TPHKLEU із екстремального термофілу Thermus thermophilus. Виявлено характерну для прокаріотичних TPHKSER і TPHKLEU будову D-петлі і варіабельного стебла, які важливі для формування особливої просторової структури цих ТРНК.

Визначено рівень модифікації залишків фосфорної кислоти етилнітрозосечовиною, залишків гуанозину і цитидину - диметилсульфатом, аденозину - діетилпірокарбонатом у TPHKSER(GCU) і TPHKSER(GGA) і виявлено нуклеотиди, які беруть участь у підтриманні просторової структури цих ТРНК. Показано відповідність внутрішньомолекулярних взаємодій в ізоакцепторних TPHKSER, що свідчить про значну подібність їхніх просторових структур.

Показано загальну відповідність просторової структури TPHKSER(GGA) у розчині та у кристалі комплексу TPHKSER(GGA) - серил-ТРНК синтетаза.

Визначено рівень модифікації специфічними хімічними реагентами залишків фосфорної кислоти і азотистих основ у TPHKLEU із T.thermophilus та проведено порівняння з відповідними узагальненими даними, одержаними для TPHKSER T.thermophilus, що дозволило встановити відмінності в реакційній здатності фосфатів нуклеотидів, розташованих в основі варіабельного стебла в TPHKSER і TPHKLEU, а також виявити відмінності в реакційній здатності основ нуклеотидів - учасників корових триплетних взаємодій.

Методом хімічних модифікацій виявлено залишки фосфорної кислоти TPHKSER, реакційна здатність яких знижена у присутності серил-ТРНК синтетази із T.thermophilus, і встановлено, що основною ділянкою взаємодії з ферментом є варіабельне стебло. Показано відповідність ділянок контакту TPHKSER із серил-ТРНК синтетазою в розчині та у кристалі.

Визначено залишки фосфорної кислоти TPHKLEU, реакційна здатність яких зменшується при утворенні комплексу з лейцил-ТРНК синтетазою із T.thermophilus. Показано, що фермент взаємодіє з TPHKLEU з боку D-петлі та утворює контакти з фосфатами нуклеотидів-учасників корових триплетних взаємодій, що дозволило висунути припущення про важливу роль знайдених відмінностей в побудові корових частин TPHKSER і TPHKLEU із T.thermophilus для впізнавання лейцил-ТРНК синтетазою.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Петрушенко З.М., Коваленко О.П., Мальченко Н.Н., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Первичная структура TPHKSER из Thermus thermophilus //Биополимеры и клетка.- 1997.- Т. 13, № 3.- С.202-208.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидних послідовностей TPHKSER(GCU) і TPHKSER(GGA) із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування.

Коваленко О.П., Петрушенко З.М., Мальченко Н.Н., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Изучение участков взаимодействия ТРНК2Ser из Thermus thermophilus с серил-ТРНК синтетазой методом химической модификации // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 4. - С. 298 - 302.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп TPHKSER(GGA) в присутності серил-ТРНК синтетази із T.thermophilus.

Коваленко О.П., Петрушенко З.М., Крикливый И.А., Яремчук А.Д., Тукало М.А. Сравнительное изучение реакционной способности остатков фосфорной кислоты, входящих в состав TPHKSER и TPHKLEU из Thermus thermophilus // Биоорг. химия. - 1999. - Т. 25, № 10. - С.768-773.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп в TPHKSER(GCU) і TPHKLEU(CAG) із T.thermophilus.

Коваленко О.П., Крикливий І.А., Тукало М.А. Вивчення елементів просторової структури TPHKSER Thermus thermophilus у розчині // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 2. - С. 115-123.

Особстий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних груп і азотистих основ, що входять до складу TPHKSER(GCU).

Коваленко О. П., Крикливий І. А., Тукало М.А. Участь азотистих основ у формуванні просторової структури TPHKLEU із Thermus thermophilus // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 2. - С. 151-156.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності азотистих основ, що входять до складу TPHKLEU(CAG) із T.thermophilus.

Tukalo M., Yaremchuk A., Krikliviy I., Egorova S., Gudzera O., Petrushenko Z., Malchenko N., Kovalenko O., Cusack S. The structural basis for the specific recognition of Thermus thermophilus aminoacyl-TRNA synthetases for their TRNA // Meeting of International Research Scholars from the Baltics, Central Europe, and Former Soviet Union . - Prague (Czech Republic). - 1996. - P. 32.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності двох ізоакцепторних TPHKSER із T.thermophilus методом швидкого гель-секвенування; визначення ділянок контакту TPHKSER з серил-ТРНК синтетазою із T.thermophilus.

Tukalo M., Kovalenko O., Yaremchuk А., Egorova S., Krikliviy І., Cusack S.. Comparative studies on the structural basis for the specific recognition of Thermus thermophilus TRNALEU and TRNASER by cognate aminoacyl-TRNA synthetases // Meeting of International Research Scholars from Belarus, Czech Republic, Estonia, Hungary, Latvia, Lithuania, Polland, Russia, Slovak Republic, and Ukraine. - Moscow (Russia). - 1999. - P. 45.

Особистий внесок дисертанта - визначення нуклеотидної послідовності TPHKLEU із T.thermophilus; визначення реакційної здатності фосфатних залишків в TPHKLEU і TPHKSER із T.thermophilus; визначення ділянок контакту TPHKLEU і TPHKSER з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами.

Kovalenko O., Krikliviy I., Yaremchuk A., Tukalo M. Comparative studies of the tertiary structure of T.thermophilus TRNASER and TRNALEU and the sites of interaction with cognate aminoacyl-TRNA synthtases by chemical modification methods // 18-th TRNA Workshop "TRNA 2000". - Cambridge (United Kingdom). - P. 20.

Особистий внесок дисертанта - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в TPHKLEU і TPHKSER із T.thermophilus; визначення ділянок контакту TPHKLEU і TPHKSER з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами.

Коваленко О.П., Крикливий І.А., Яремчук Г.Д. Порівняльне вивчення просторової структури і ділянок контакту TPHKSER і TPHKLEU із Thermus thermophilus з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами / Матеріали VIII Українського біохімічного зїзду // Український біохімічний журнал. - 2002. - Т. 74, № 4б (додаток 2). - Чернівці (Україна). - С. 36-37.

Особистий внесок здобувача - визначення реакційної здатності фосфатних залишків і азотистих основ в TPHKLEU і TPHKSER із T.thermophilus; визначення ділянок контакту TPHKLEU і TPHKSER з гомологічними аміноацил-ТРНК синтетазами.