Попередження нефро- та гепатотоксичної дії парацетамолу модуляторами метаболізму ксенобіотиків та антиоксидантами - Автореферат

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИОфіційні опоненти: доктор медичних наук, Літвінова Надія Володимирівна, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України доктор медичних наук, професор Посохова Катерина Андріївна, завідувач кафедри фармакології Тернопільської медичної академії МОЗ України Захист дисертації відбудеться 20 червня 2001 року о 13 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, Київ, вул. З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України. Показано, что дефицит ретинола и токоферола повышает токсическое действие парацетамола, а дополнительное назначение этих витаминов, и, особенно, триметазидина и селенита натрия уменьшает гепато-и нефротоксичность парацетамола. Изучено влияние этих препаратов на экскрецию метаболитов парацетамола с мочой и показано, что протекторый эффект исследованных препаратов в значительной степени определяется их способностью тормозить образование токсических метаболитов парацетамола и стимулювать образование и экскрецию нетоксических глюкуронидных и сульфатных коньюгатов.Безпечність фармакотерапії парацетамолом залишається актуальною проблемою сучасної фармакології, оскільки парацетамол належить до найбільш вживаних лікарських засобів, а реклама та необмежений продаж препарату сприяють надзвичайно широкому його застосуванню населенням [J.A.Roach, B.Stacey, 1997; E.V.Hersh et al., 2000]. Ураження печінки парацетамолом часто набуває форми фульмінантної печінкової недостатності та нерідко завершується смертю хворих [K.E.Artnak, S.S.Wilkinson, 1998]. Не розроблено методів прогнозування виникнення токсичних ефектів парацетамолу в залежності від стану пацієнтів та при його комбінованому застосуванні з іншими лікарськими засобами. У окремих пацієнтів токсичні прояви можуть виникати навіть при застосуванні терапевтичних доз парацетамолу [V.Andreu et al., 1999]. Вивчити залежність токсичної дії парацетамолу від активності мікросомальних монооксигеназ та конюгуючих ферментів і оцінити можливість використання маркерних активностей окремих ізоформ цитохрому Р450 в ролі предикторів токсичності парацетамолу.

За темою дисертації опубліковано 9 робіт, в тому числі 5 статей у фахових журналах.

Структура та обсяг дисертації

Дисертація викладена на 201 сторінці машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, 3-х розділів власних експериментальних та клінічних досліджень, обговорення, висновків, практичних рекомендацій та покажчика цитованої літератури, який містить 329 джерел вітчизняних та зарубіжних публікацій. Дисертація ілюстрована 52 таблицями, 3 рисунками та 12 мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 382 білих щурах-самцях популяції Вістар. В клінічній частині роботи обстежено 62 післяопераційних хворих, яким з метою знеболення призначали парацетамол. Серед них було 30 дітей та 32 дорослих пацієнти, у яких оцінено вплив триметазидину та триовіту на фармакокінетику, гепато- і нефротоксичні ефекти парацетамолу.

Під час дослідів тварини перебували на напівсинтетичному раціоні, що забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів і дає можливість контролювати надходження всіх нутрієнтів в організм щурів.

Дефіцит вітаміну Е створювали утримуванням щурів на раціоні, позбавленому вітаміну Е, протягом 14 тижнів. Для створення надлишку токоферолу щурам внутрішньошлунково вводили альфа-токоферолу ацетат в дозі 20 мг/кг протягом 10 днів. Дефіцит вітаміну А викликали утриманням щурів на раціоні, позбавленому вітаміну А, протягом 9 тижнів. Надлишок вітаміну А створювали пероральним введенням ретинолу ацетату в дозі 3000 МО/кг протягом 10 днів. Селеніт натрію вводили в дозі 30 мкг/кг (в перерахунку на селен) внутрішньоочеревинно протягом 10 днів. Триметазидин - перорально протягом 10 днів в дозі 10 мг/кг. Ацетилцистеїн вводили в дозі 50 мг/кг внутрішньоочеревинно двічі за 3 та 24 години до введення парацетамолу.

Індукцію ферментів метаболізму ксенобіотиків викликали введенням ряду ізоензимспецифічних та неселективних індукторів - бензпірену, фенобарбіталу, ріфампіцину, етанолу та ацетону. Бензпірен (25 мг/кг) вводили внутрішньоочеревинно один раз на добу, протягом 4-х днів. Фенобарбітал (70 мг/кг) вводили внутрішньоочеревинно один раз на добу, протягом 5 днів. Ріфампіцин (100 мг/кг) вводили внутрішньошлунково один раз на день, протягом 5 днів. Ацетон (2 мл/кг) вводили в шлунок один раз на добу, протягом 3-х днів. Етанол (3 г/кг) вводили в шлунок протягом 10 днів. Для інгібування мікросомальних ферментів тваринам вводили циметидин внутрішньошлунково в дозі 100 мг/кг, один раз на добу, протягом 5 днів. Хлорамфенікол (100 мг/кг) вводили перорально один раз на день, протягом 5 днів. Кетоконазол (150 мг/кг) вводили один раз на добу, протягом 4 днів, в шлунок. Діетилдитіокарбамат (200 мг/кг) вводили внутрішньошлунково, один раз на добу, протягом 2 днів. Тварин в дослід брали через 2-3 години після останнього введення інгібіторів.

УДФ-глюкозу вводили в дозі 300 мг/кг внутрішньоочеревинно за 3 і 6 год до введення щурам парацетамолу. Сульфат натрію (300 мг/кг) вводили внутрішньоочеревинно за 3 і 6 год до введення щурам парацетамолу. Дилтіазем в дозі 25 мг/кг вводили в шлунок двічі за 1 і 6 годин до введення парацетамолу. Гадоліній хлорид вводили внутрішньоочеревинно в дозі 7 мг/кг тричі. Останнє введення - за 12 год до введення парацетамолу.

Ацетанілід, як тест-препарат, вводили щурам внутрішньоочеревинно в дозі 100 мг/кг (74 мкмоль на 100 г маси). Звязані метаболіти ацетаніліду визначали після кислотного гідролізу сечі. Загальну кількість всіх метаболітів (анілідних та амінофенольних) оцінювали за реакцією діазосполучення, частку амінофенольних метаболітів - за специфічною для цього класу сполук реакцією утворення індофенолового барвника [И.М.Коренман, 1975; С.Сиггиа, Д.Г.Ханна 1983; А.А.Пентюк и соавт., 1990]. Вміст глюкуронідів визначали методом H.Yuki, N.H.Fischman (1963). Вміст вільних та звязаних сульфатів визначали турбідиметричним методом [И.А.Цевелева, 1971]. Меркаптурові кислоти оцінювали після лужного гідролізу сечі по реакції з реактивом Елмана [V.R.Doorn et al., 1981].

Амідопірин вводили щурам внутрішньоочеревинно в дозі 30 мг/кг. Метаболіти амідопірину (вільний та ацетильований 4-аміноантипірин) визначали за реакцією утворення індофенолового барвника з фенолом [Т.А.Попов, О.Б.Леоненко, 1977].

Концентрацію парацетамолу в плазмі крові визначали за реакцією утворення індофенолового барвника. Параметри фармакокінетики парацетамолу розраховували на підставі двочастинної моделі без урахування всмоктування [В.Н.Соловьев и соавт., 1980; Л.Е.Холодов, В.П.Яковлев, 1985; В.К.Пиотровский, М.Вайс, 1988].

Мікросоми печінки щурів отримували з постмітохондріальної фракції, використовуючи їх здатність осаджуватись двовалентними катіонами [Kamath et al., 1971]. Чистоту мікросомної фракції тестували за маркерними ферментами мітохондрій, лізосом, плазматичних мембран та мікросом. [А.А.Покровский, А.И.Арчаков, 1968]. В мікросомах визначали ацетанілід- і анілінгідроксилазну активності за утворенням пара-амінофенолу, пара-нітрофенолгідроксилазну активність - за утворенням пара-нітрокатехолу, амідопірин-N-, еритроміцин-N- і метопролол-О-деметилазні активності - за утворенням формальдегіду, активність NADH і NADPH-редуктаз (КФ 1.6.2.2 і 1.6.2.4) оцінювали за швидкістю відновлення дихлорфеноліндофенолу [И.И.Карузина, А.И.Арчаков, 1977; Koop, 1986]. Ариламідазну активність карбоксилестерази (КФ 3.1.1.1) оцінювали за швидкістю гідролізу ацетаніліду [E.Heymann et al., 1981], активність УДФ-глюкуронілтрансферази (КФ 2.4.1.17) - за швидкістю конюгації пара-нітрофенолу [B.Burchell, P.Weatheril, 1981]. В постмітохондріальній фракції печінки оцінювали активність фенолсульфотрансферази (КФ 2.8.2.1) за утворенням сульфоефіру бета-нафтолу [G.M.Kempen, G.S.Jansen, 1971], глутатіон-S-трансферази (КФ 2.5.1.18) - за утворенням конюгатів з 1-хлор-2,4-динітробензолом [Habig W.H., Jacobi W.B., 1981]. В постядерному гомогенаті визначали активність N-ацетилтрансферази (КФ 2.3.1.5) за швидкістю конюгації пара-амінобензойної кислоти [W.W.Weber, C.M.King, 1981]. Активність гама-глутамілтрансферази (КФ 2.3.2.2) оцінювали за швидкістю вивільнення 4-нітроаніліну з гамаглутамілнітроаніліду [G.Ceriotti, De A.Nadai-Frank, 1972, 1973].

Гепатоцити отримували колагеназним методом Сеглена [Л.А.Осипова та співавт., 1986]. Життєздатність клітин оцінювали за їх профарбовуванням трипановим синім, виходом лактатдегідрогенази та зниженням вмісту відновленого глутатіону. Активність лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27) оцінювали по зниженню поглинання NADH [Г.А.Кочетов, 1980].

Вміст малонового діальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972], а концентрацію фосфоліпідів - за утворенням гідрофобного комплексу з феротіоціанатом амонію [А.А.Пентюк и соавт., 1987]. Білок визначали мікробіуретовим методом [Г.А.Кочетов, 1980]. Вміст вільного токоферолу - за реакцією Еммері-Енгеля, а рівень ретинолу в печінці визначали флуориметричним методом [Ю.М.Островский, 1979]. Вміст відновленого глутатіону та його окисленої форми визначали за глутатіонтрансферазною реакцією [K.Asaoka, K.Takahashi, 1981], цистеїн - за реакцією з нінгідрином [M.K.Gaitonde , 1967]. Активність аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), альдолази (КФ 4.1.2.13), рівень білірубіну, креатиніну, сечовини оцінювали уніфікованими методами [В.В.Меньшиков, 1987]. Гістологічні дослідження печінки проводили після фіксації в формаліні, з подальшим фарбуванням гематоксилін-еозином.

Статистичну обробку результатів дослідження виконували методами біометрії [Е.В.Гублер, 1978, В.Н.Носков, 1990].

В роботі використані фармакопейні препарати - альфа-токоферолу ацетату, ретинолу ацетату, інших вітамінів та нутрієнтів, дилтіазему та ацетилцистеїну. Селеніт натрію готували нейтралізацією селенистої кислоти ("Біохімреактив"). Цистеїн, GSH, GS-SG, NAD, NADP, NADH, NADPH, ксантин, солі тетразолію, фірми "Reanal "(Угорщина), бета-глюкуронідаза та арилсульфатаза фірми "Sigma" (США), глутамілнітроанілід, сілікагель фірм "Chemapol" та "Lachema". Інші реактиви були виробництва країн СНД.

Експериментальні дослідження. На першому етапі роботи нами зясовано, яка з ізоформ цитохрому Р450 вносить вирішальний вклад в гепатотоксичність парацетамолу. Досліди було сплановано таким чином, що в частині печінки визначалась вихідна активність ізоформспецифічних ферментів, а інша використовувалась для отримання ізольованих гепатоцитів, на яких досліджувалась токсична дія парацетамолу. Це дозволило провести кореляційний аналіз між ізоензимспецифічними активностями та гепатотоксичністю (табл. 1). Досліди показали, що інкубація гепатоцитів з парацетамолом спричиняє різке зростання відсотку клітин, які фарбуються трипановим синім, виснаження запасів глутатіону та підвищення виходу лактатдегідрогенази в інкубаційне середовище. Кореляційним аналізом встановлено, що гепатотоксичність парацетамолу прямо і сильно корелює з маркерами CYP2E1 - активністю анілінгідроксилази та нітрофенолгідроксилази, та активністю ацетанілідгідроксилази, маркером CYP1А2. Значно слабкішим був звязок між токсичністю парацетамолу та маркерними активностями інших ізоформ цитохрому Р450 - амідопірин-N-деметилази (CYP2В та 2С) еритроміциндеметилази, та метопрололдеметилази (CYP 3А та 2D, відповідно).

Нами встановлено існування доволі тісного, але зворотного звязку між гепатотоксичною дією парацетамолу та активністю ферментів конюгації. Отримані результати узгоджуються з роллю цих ферментів в детоксикації парацетамолу, оскільки завдяки глутатіон-S-трансферазі інактивується N-ацетил-пара-бензохінонімін, а завдяки УДФ-глюкуронілтрансферазі та фенолсульфотрансферазі блокується фенольний гідроксил і підвищується полярність і, відповідно, елімінація парацетамолу. На токсичність парацетамолу деякий вплив справляла і активність карбоксилестерази (ариламідази), ферменту, що гідролізує парацетамол з утворенням більш токсичного, ніж вихідна речовина, пара-амінофенолу.

Ці дані вказують на важливу роль в токсичності парацетамолу не лише біотрансформації в цілому, але й співвідношення між активностями окремих метаболізуючих ферментів.

Звязок метаболізуючих ферментів з токсичністю парацетамолу нами підтверджено також in vivo на тваринах з протестованою амідопірином та ацетанілідом активністю метаболізуючих ферментів. Досліди підтвердили, наявність звязку між токсичністю парацетамолу та активністю ферментів, залежних від цитохромів 1А2 та 2Е1. Висока активність процесів конюгації парацетамолу з сульфатом та глюкуроновою кислотою виявилась чутливим предиктором зменшення токсичності парацетамолу, оскільки у тварин з високою активністю цих ферментів спостерігали значно нижчі показники трансаміназ та білірубіну в крові і вищий рівень глутатіону в печінці.

Значення біотрансформації в токсикогенезі парацетамолу було нами оцінено в дослідах з відносно специфічними та плейотропними індукторами та інгібіторами. Досліди показали, що гепатотоксичність парацетамолу значно зростає при вибірковій індукції цитохрому Р4502Е1 ацетоном та етанолом або ж при застосуванні плейотропного індуктора фенобарбіталу, який здатний стимулювати експресію багатьох ферментів, в тому числі цитохромів Р450 2Е1 та 1А2. Здатність етанолу підсилювати токсичність парацетамолу повязана, очевидно, не лише з індукцією вказаного цитохрому, але й зі стимуляцією макрофагів [A.P.Bautista, J.J.Spitzer, 1999], які є потужними продуцентами токсичних форм кисню та оксиду азоту [Mantle D., V.R.Preedy, 1999; H.Matsumoto et al., 2000].

Більшість інгібіторів суттєво зменшувало токсичну дію парацетамолу, проте максимальний ефект проявляв діетилдитіокарбамат (ДЕДТК) - частка профарбованих гепатоцитів зменшувалась при його застосуванні більш ніж удвічі, а вихід лактатдегідрогенази в інкубаційне середовище зменшувався майже на 50%. Меншою протекторною активністю володів неспецифічний інгібітор циметидин. Під його впливом на одну третину зменшувалась загибель гепатоцитів і в 1,3 рази зменшувався вихід лактатдегідрогенази. Близьким за величиною був вплив диметилсульфоксиду.

Таким чином, проведені дослідження свідчать про тісну залежність між активністю окремих ізоформ цитохрому Р450 та токсикогенезом парацетамолу, причому ця закономірність реалізується як на ізольованих гепатоцитах, так і в цілісному організмі.

Досліджена нами нефротоксичність парацетамолу проявляла також супряженість з активністю ферментів метаболізму ксенобіотиків. Індуктори та інгібітори суттєво модифікували нефротоксичні ефекти парацетамолу, які оцінювали за клубочковою фільтрацією, активністю в сечі ферментів - маркерів пошкодження канальців, рівнем глутатіону в нирках та іншими показниками. Виявилось, що фенобарбітал та етанол потенціюють, а ДЕДТК - зменшує нефротоксичність парацетамолу. Зокрема, ДЕДТК зменшував викликану парацетамолом протеїнурію вдвічі, а глюкозурію в 4 рази. Активність гама-глутамілтрансамінази сечі під впливом ДЕДТК знизилась з 5,17±0,41 до 1,94±0,24 нмоль/хв/мл. Ефект ДЕДТК повязаний, очевидно, з відомими його властивостями специфічно гальмувати CYP2E1 [Eagling VA. et al., 1998], а саме ця ізоформа переважно відповідає за утворення токсичного метаболіту N-ацетил-пара-бензохіноніміну.

З огляду на складність механізмів токсикогенезу парацетамолу, можливу причетність до нього вільно-радикальних процесів, нами оцінена можливість використання в ролі гепато- та нефропротекторів антиоксидантів (токоферолу, ретинолу, селеніту натрію, триметазидину), субстратів конюгації (УДФ-глюкози, сульфату натрію), антагоніста кальцію (дилтіазему) та блокатора клітин Купфера (гадолінію хлориду). Для порівняння був досліджений класичний протектор токсичності парацетамолу - ацетилцистеїн.

Дослідження показали, що аліментарний дефіцит токоферолу та ретинолу є фактором, який потенціює токсичність парацетамолу, а додаткове введення антиоксидантних вітамінів, селеніту натрію, триметазидину, УДФ-глюкози, сульфату натрію, дилтіазему та гадолінію хлориду протидіє токсичному впливу парацетамолу (рис.). У тварин, які попередньо отримували вказані вище речовини зменшувалось парацетамол-індуковане зростання трансаміназ в сироватці крові, малонового діальдегіду в мікросомах печінки, меншим було виснаження запасів в печінці відновленого глутатіону. За гепатопротекторною активністю випробувані речовини розташувались в такому порядку - триметазидин, ацетилцистеїн, селеніт натрію, токоферол, гадоліній, дилтіазем, УДФ-глюкоза, сульфат натрію та ретинол.

В морфологічній частині роботи було проаналізовано вплив триметазидину та селеніту натрію на парацетамол-індуковані зміни в структурі печінки і показано здатність цих речовин гальмувати альтеративні процеси в паренхімі органу.

Антиоксиданти виявились також ефективними нефропротекторами. Нами встановлено, що в найбільшій мірі попереджував парацетамол-індуковане зниження клубочкової фільтрації, рівня глутатіону в нирках та зростання активності гама-глутамілтрансферази в сечі триметазидин, на другому місці був селеніт натрію, потім токоферол і ретинол.

Оскільки в механізмі токсичної дії парацетамолу провідна роль належить його метаболіту N-ацетил-пара-бензохіноніміну, для зясування механізмів протекторної дії індукторів та інгібіторів, антиоксидантів, кофакторів конюгації, дилтіазему та гадолінію, нами вивчений їх вплив на біотрансформацію парацетамолу у щурів (табл. 2). Встановлено, що введення фенобарбіталу та етанолу підвищує екскрецію з сечею меркаптурових кислот (маркер утворення реакційноздатного метаболіту N-ацетил-пара-бензохіноніміну) та екскрецію нефротоксичного метаболіту - вільного пара-амінофенолу. В той же час ДЕДТК гальмував утворення цих інтермедіатів і стимулював конюгацію парацетамолу з сульфатом та глюкуроновою кислотою.

Серед інших вивчених нами речовин найбільше зменшував утворення токсичних метаболітів триметазидин, потім токоферол і селеніт натрію, потім ретинол, дилтіазем і гадоліній, УДФ-глюкоза і натрію сульфат. Триметазидин, селеніт натрію, УДФ-глюкоза і, частково, ретинол стимулювали синтез глюкуронідів парацетамолу, а інші препарати не впливали на цю реакцію.

З метою вивчення механізму протекторної дії випробуваних речовин ми оцінили вплив найбільш активних з них на індуковане парацетамолом утворення оксиду азоту. Виявилось, що попереднє введення етанолу потенціює продукцію оксиду азоту і в плазмі крові зростає вміст його метаболітів - нітритів та нітратів до 151,9±9,87 мкмоль/л, тоді як в групі “парацетамол” цей показник складає 110,5±7,96 мкмоль/л. Введення ДЕДТК значно зменшувало їх концентрацію (61,5±3,25 мкмоль/л). Сильно блокують підвищення рівня нітритів та нітратів - триметазидин, селеніт натрію та, особливо, гадолінію хлорид. Трохи меншим був ефект токоферолу.

Таким чином, в експериментальній частині було обґрунтовано два принципово різних підходи до зменшення токсичної дії на нирки та печінку парацетамолу. Перший підхід ґрунтується на цілеспрямованому втручанні в біотрансформацію парацетамолу з метою спрямування її в більш безпечне для організму русло. З цією метою нами успішно був апробований ДЕДТК, який, будучи селективним інгібітором цитохрому Р4502Е1, проявив себе як потужний протектор токсичної дії парацетамолу.

Інший підхід полягає в додатковому призначенні антиоксидантів, що дозволяє підвищити ефективність детоксикації реакційноздатних метаболітів парацетамолу та вільних радикалів кисню та азоту і протидіяти вторинним патологічним реакціям, які виникають внаслідок дії реактивних метаболітів.

Клінічні дослідження. Для апробації ефективності запобігання токсичності парацетамолу в умовах клініки нами обрано підхід з застосуванням антиоксидантів. У дорослих ми застосували триметазидин, а в педіатричній практиці - комбінований препарат селену та антиоксидантних вітамінів - триовіт, який дозволений до застосування у дітей.

В перший день дослідження вивчено фармакокінетику парацетамолу після прийому разової дози 0,5 г. Зясувалось, що у відповідності до відомих даних літератури, парацетамол швидко всмоктується з шлунково-кишкового тракту, а максимальна концентрація в плазмі крові створюється вже через одну годину. Період напіввиведення і середній час утримання в організмі складає біля трьох годин. Виявилось, що 5-денний прийом парацетамолу викликає явище самоіндукції, оскільки через вказаний термін істотно зменшується період напіввиведення, середній час утримання в організмі, зростає кліренс парацетамолу. Введення триовіту чи триметазидину разом з парацетамолом не змінювало фармакокінетичну поведінку останнього, і викликана парацетамолом індукція залишалась і при поєднанні з антиоксидантами.

Не впливаючи на динаміку концентрації парацетамолу в крові, триовіт та триметазидин істотно змінюють спектр екскретованих з сечею його метаболітів. Обидва препарати зменшують екскрецію з сечею токсичних метаболітів - вільного парацетамолу та меркаптурових кислот (на 35-40%). Така зміна метаболічного профілю парацетамолу є сприятливою, оскільки свідчить про зменшення утворення токсичних інтермедіатів препарату. Цього виявилось достатньо для істотного зменшення токсичного впливу парацетамолу на печінку та нирки.

Встановлено, що 5-денний курс парацетамолу у дорослих (1,5 г/добу) та дітей (вікові дози) призводить до зростання в сироватці крові вмісту білірубіну в 1,5-2,2 рази та активності трансаміназ в 1,6-1,8 рази, хоча в цілому ці показники і не виходили за верхню межу референтного інтервалу. Прийом парацетамолу викликає явище оксидативного стресу, на що вказувало зниження рівня відновленого глутатіону в еритроцитах на 30-40% та підвищення вмісту малонового діальдегіду в плазмі крові в 1,6-1,9 рази.

Призначення хворим триметазидину чи триовіту ефективно зменшувало гепатотоксичну дію парацетамолу, про що свідчать істотно нижчі показники активності трансаміназ та малонового діальдегіду та більш високі рівні глутатіону в еритроцитах. Тобто, триовіт та триметазидин досить активно запобігали токсичному впливу парацетамолу на печінку.

Призначення триовіту та триметазидину попереджало також токсичний вплив парацетамолу на нирки. Через 5 днів прийому парацетамолу без антиоксидантів в сечі зростала активність маркерних ферментів канальців нирок - гама-глутамілтрансферази та альдолази, що супроводжувалось невеликим (в межах референтних величин) зростанням вмісту сечовини і зменшенням клубочкової фільтрації. Призначення антиоксидантів істотно послабляло негативний вплив парацетамолу, про що свідчили нижчі рівні ферментурії.

Таким чином, проведені дослідження показали, що токсичні ефекти парацетамолу великою мірою визначаються індивідуальними особливостями експресії метаболізуючих ферментів печінки. Індукція CYP2Е1, 1А2, 3A посилює токсичні прояви парацетамолу, тоді як гальмування цих ферментів істотно зменшує гепатотоксичність препарату. Виявлені закономірності створюють умови для прогнозування небажаних взаємодій з препаратами, які спроможні індукувати ці цитохроми. Висока активність конюгуючих ферментів (сульфотрансферази, УДФ-глюкуронілтрансферази та глутатіон-S-трансферази) є предиктором низької токсичності парацетамолу, а гіповітамінози Е та А - є несприятливим чинником, на тлі якого істотно посилюється гепатотоксичний ефект парацетамолу. Експериментально доведено наявність гепатопротекторних властивостей у інгібітора монооксигеназ ДЕДТК, та інгібітора клітин Купфера гадолінію, антагоніста кальцію дилтіазему, антиоксидантів - токоферолу, ретинолу, селеніту натрію та триметазидину, субстратів конюгації УДФ-глюкози та сульфату натрію.

В умовах клініки доведена доцільність поєднання парацетамолу з антиоксидантами триметазидином чи триовітом, оскільки це дозволяє попередити виникнення побічних ефектів парацетамолу з боку нирок та печінки.

ВИСНОВКИ

В дисертації узагальнено теоретичні та клінічні аспекти ролі процесів біотрансформації в реалізації токсичної дії анальгетика парацетамолу та обґрунтовано нові підходи до підвищення безпечності фармакотерапії парацетамолом.

1. Метаболічними детермінантами гепатотоксичності парацетамолу за умов in vivo є активність ізоформ цитохрому Р4502Е1 і 1А2, карбоксилестерази та конюгуючих ферментів. Ступінь токсичної дії парацетамолу прямо корелює з активностями CYP2Е1 (r=0,64-0,71), 1А2 (r=0,65-0,67) та карбоксилестерази (r=0,62-0,69) і зворотно - з активністю УДФ-глюкуронілтрансферази (r=-0,75-0,94), сульфотрансферази (r=-0,7-0,86) та глутатіон-S-трансферази (r=-0,7-0,86).

2. Введення парацетамолу щурам в токсичних дозах (3 г/кг) викликає виснаження в печінці запасів глутатіону (на 83%), субстратів конюгації - сульфату та глюкуронової кислоти (на 75-85%), підвищення вмісту в печінці малонового діальдегіду (в 3,2 рази), зростання активності в плазмі крові АЛАТ (в 7,8 рази) та АСАТ (в 6,3 рази).

3. Зменшення токсичного впливу парацетамолу на печінку та нирки щурів досягається шляхом профілактичного застосування селективних інгібіторів CYP2Е1 (діетилдитіокарбамату та диметилсульфоксиду), субстратів конюгації (УДФ-глюкози та сульфату натрію), антагоніста кальцієвих каналів (дилтіазему) та антиоксидантів (ретинолу, токоферолу, селеніту натрію, триметазидину). Зокрема знижується рівень ферментемії, білірубінемії, менше виснажуються запаси глутатіону та субстратів конюгації. Індуктори монооксигеназ фенобарбітал, етанол та ацетон посилюють токсичну дію парацетамолу, підвищуючи активність АЛАТ в крові в 10-12 разів, знижуючи вміст глутатіону в печінці на 89-92%.

4. Нефротоксичність парацетамолу проявляється зниженням клубочкової фільтрації в 2,6 рази на тлі 3-разового підвищення в сечі активності гама-глутамілтрансферази. Застосування парацетамолу разом з індукторами монооксгеназ фенобарбіталом чи етанолом супроводжується подальшим зниженням клубочкової фільтрації та підвищенням екскреції з сечею гама-глутамілтрансферази. Інгібітор CYP2E1 (діетилдитіокарбамат), антиоксиданти (триметазидин та селеніт натрію) в 2-3 рази зменшують індуковане парацетамолом падіння клубочкової фільтрації.

5. В дослідженнях in vitro встановлено, що присутність в інкубаційному середовищі парацетамолу (2,5 ММ) справляє токсичну дію на клітини печінки, що підтверджується збільшенням в 2,5 рази кількості нежиттєздатних гепатоцитів, зниженням вдвічі вмісту в них відновленого глутатіону та зростанням в інкубаційному середовищі в півтора рази активності лактатдегідрогенази. Попереднє 5-денне введення щурам триметазидину (10 мг/кг), селеніту натрію (30 мкг/кг по селену) підвищує стійкість ізольованих гепатоцитів до токсичної дії парацетамолу.

6. Гіповітамінози А та Е підвищують чутливість ізольованих гепатоцитів щурів до токсичної дії парацетамолу (кількість загиблих гепатоцитів зростає в 1,3-1,5 рази, а активність лактатдегідрогенази - в 2,0-2,2 рази). Двотижневе призначення щурам ретинолу (3000 МО/кг на добу) чи токоферолу (20 мг/кг на добу) не тільки запобігає обумовленому гіповітамінозом посиленню токсичності парацетамолу, але й значно послабляє його токсичний вплив на гепатоцити в порівнянні з тваринами, оптимально забезпеченими вітамінами.

7. Застосування у пацієнтів парацетамолу супроводжується зростанням активності в плазмі крові АЛАТ та АСАТ в 1,6-1,7 рази та рівня білірубіну на 50-70%, підвищенням в 2,8 рази екскреції гама-глутамілтрансферази з сечею. Застосування парацетамолу в середніх терапевтичних дозах протягом пяти днів у дітей та дорослих після ортопедичних операцій викликає явище самоіндукції. Про це свідчить прискорення елімінації препарату з організму (період напіввиведення падає в 1,38 рази) і зниження його концентрації в плазмі крові на 5 день дослідження у порівнянні з першим днем в 1,3-1,4 рази.

8. Призначення разом з парацетамолом триметазидину (60 мг на добу) у дорослих чи триовіту (3 капсули на день) у дітей попереджує гепато- та нефротоксичну дію парацетамолу, про що свідчать значно нижчі активності в плазмі крові трансаміназ (на 21-27%), зменшення рівня білірубіну (на 23-27%) та екскреції з сечею гама-глутамілтрансферази (на 47-54%), порівняно з пацієнтами, яким застосовували парацетамол без коректорів.

Практичні рекомендації: 1. Для діагностики доклінічних проявів нефротоксичної дії парацетамолу слід визначати в сечі активність гама-глутамілтрансферази та альдолази. Активність ферментів вище 2,5 та 30,0 нмоль/мл/хв, відповідно, розглядати як ранній прояв нефротоксичності парацетамолу.

2. При тривалому застосуванні парацетамолу з метою запобігання його побічної дії на нирки та печінку до комплексу лікування дорослим доцільно включати антиоксидант триметазидин в добовій дозі 60 мг, а дітям - вітамінно-мікроелементний комплекс триовіт.

3. При проведенні комбінованої фармакотерапії парацетамолом з лікарськими засобами, які здатні модифікувати активність метаболізуючих ферментів, необхідно враховувати можливість виникнення між ними фармакокінетичної та фармакодинамічної взаємодії.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Блажиевская Г.И., Андреев А.П., Качула С.А., Пентюк Н.А., Столярчук Э.В., Паламарчук О.В., Пентюк А.А.. Гепатотоксическое действие парацетамола у крыс с различной исходной активностью ферментов метаболизирующих ксенобиотики. Вісник Вінницького державного медичного університету. 1997.- №1.1.- С.4-6. [особистий внесок дисертанта 75%]

2. Блажієвська Г.Й. Вплив антиоксидантів триметазидину та селеніту натрію на гістологічні ознаки гепатотоксичної дії парацетамолу у щурів. Вісник морфології.- 1999.- №5.1.- С. 47-49. [особистий внесок дисертанта 100%].

3. Пентюк О.О., Андреев А.П., Блажієвська Г.Й., Качула С.А., Коваленко Є.М., Полеся Т.А., Паламарчук О.В., Сокур С.О., Григорянц В.Г. Вплив гіперкетонемії на маркерні активності ізоформ цитохрому Р-450 та гепатотоксичність тетрахлорметану, парацетамолу та гідразину. Ліки.- 1999.- №2.- С. 72-75. [особистий внесок дисертанта 20%].

4. Желіба Л.М., Блажієвська Г.Й., Паламарчук О.В., Качула С.О. Гепатотоксичність вальпроату натрію, парацетамолу та тетрахлорметану при різній забезпеченості щурів ретинолом, токоферолом та тіаміном. Вісник Вінницького державного медичного університету. -2000.- №.4.1.- С.20-22. [особистий внесок дисертанта 33%].

5. Пентюк О.О., Андрєєв А.П., Блажієвська Г.Й., Мороз Л.В., Качула С.А., Коваленко Е.М., Паламарчук О.В Вплив інгібіторів цитохрому Р-450 на гепатотоксичність парацетамолу// Ліки. -2000.- №.5.- С.26-31. [особистий внесок дисертанта 66%].

6. Блажиевская Г.И., Яковлева О.А., Медвидь З.С., Андреев А.П., Пентюк А.А., Качула С.А., Пентюк Н.А. Метаболические предикторы гепатотоксического действия тетрахлорметана у крыс. Токсикологический вестник. Москва.- 1998.- №1.- С.21-25. [особистий внесок дисертанта 35%].

7. Блажієвська Г.Й., Пентюк Н.О.Гальмування утворення реакційноздатних метаболітів парацетамолу - можливий механізм антитоксичної дії токоферолу, дибунолу та селену//14 обєднана наукова медико-технічна конференція з міжнародною участю. Матеріали конференції.- Київ-Вінниця., 1996. - С.47. [особистий внесок дисертанта 90%].

8. Григорянц В.Г., Сокур С.О., Блажієвська Г.Й., Мороз Л.В., Качула С.А., Коваленко Є.М.,Дмітрієва К.Ю.,Істошин В.М., Пентюк О.О. Вплив гіперкетонемії та фенобарбіталу на вміст відновленого глутатіону в ізольованих гепатоцитах щурів при їх інкубації з тетрахлорметаном, парацетамолом та гідразином. 2-а Українська Наукова Конференція з міжнародною участю “Актуальні проблемиклінічної фармакології”. Матеріали конференції. - Вінниця., 1998. - С. 234-235. [особистий внесок дисертанта 30%].

9. Пентюк О.О., Блажієвська Г.Й., Станіславчук М.А. Вплив триовіту та триметазидину на нефро- та гепатотоксичність парацетамолу. Збірник наукових робіт “Актуальні питання медицини”. Вінниця. -2000, с.122-125. [особистий внесок дисертанта 90%].

Размещено на .ru