Методика двухстадийного культивирования зелёной микроводоросли Dunaliella salina с использованием квазинепрерывного метода выращивания. Сравнение сравнительного и накопительного методов этого процесса. Условия накопления каротиноидов в клетках дуналиеллы.
При низкой оригинальности работы "Полупромышленное выращивание Dunaliella salina teod. (Chlorophyta) в восточной части Украины", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Полупромышленное выращивание Dunaliella salina Проведена апробация двухстадийного культивирования Dunaliella salina с использованием квазинепрерывного метода выращивания. При переходе от непрерывного метода выращивания к накопительному и 10-кратном разбавлении культуры наблюдалось устойчивое повышение содержания каротиноидов в клетках дуналиеллы и соотношения кар./хл. а, что свидетельствует о перестройке пигментного аппарата, а также предшествует активному накоплению каротиноидов в клетках дуналиеллы.Использующиеся в настоящее время промышленные технологии выращивания D. salina для получения ?-каротина предусматривают, как правило, двухстадийное ее культивирование. Масюк предложила двухэтапный метод культивирования D. salina, предусматривающий на первом этапе создание условий, способствующих накоплению биомассы микроводоросли, а на втором - условий, инициирующих накопление ?-каротина в ее клетках (Масюк, 1973). Он обеспечивает более высокую и стабильную продуктивность культуры, что экспериментально подтверждено лабораторными исследованиями (Боровков, 2008; Гудвилович, 2012). Первоначально культуру D. salina выращивали в квазинепрерывном режиме (5 сут), причем ежесуточный обмен составлял 10 % (скорость протока среды 0,1 сут-1). На первом этапе эксперимента плотность культуры значительно не изменялась и находилась в пределах 0,59-0,68 г СВ·дм-3, т.е. культура фактически находилась в состоянии стационарного динамического равновесия с удельной скоростью роста 0,1 сут-1 (рис.Экспериментально показано, что в условиях естественного освещения (при пасмурной погоде) в данном регионе повышения освещенности за счет разбавления культуры в 5-10 раз и повышения солености культуральной среды в 2 раза оказалось недостаточно для интенсивного накопления каротиноидов.
Введение
Зеленая микроводоросль Dunaliella salina широко известна как один из наиболее перспективных природных источников ?-каротина. Использующиеся в настоящее время промышленные технологии выращивания D. salina для получения ?-каротина предусматривают, как правило, двухстадийное ее культивирование. Еще в 60-х годах ХХ в. Н.П. Масюк предложила двухэтапный метод культивирования D. salina, предусматривающий на первом этапе создание условий, способствующих накоплению биомассы микроводоросли, а на втором — условий, инициирующих накопление ?-каротина в ее клетках (Масюк, 1973). Данная технология выращивания, как и большинство известных к настоящему времени (Ben-Amotz, 1989; Lee, 2001), основана на методе периодических культур, который наиболее изучен и разработан. Актуальным на сегодняшний день является введение в технологическую схему промышленного выращивания D. salina менее распространенного квазинепрерывного способа культивирования. Он обеспечивает более высокую и стабильную продуктивность культуры, что экспериментально подтверждено лабораторными исследованиями (Боровков, 2008; Гудвилович, 2012). Цель данной работы — апробация двухстадийного культивирования D. salina в полупромышленных условиях с использованием квазинепрерывного метода выращивания.
Материалы и методы
Работа выполнена на базе тепличного комплекса в Харьковской обл. в мае-июне 2013 г. Объект исследования — альгологически чистая культура D. salina (штамм IBSS-2) из коллекции культур ИНБЮМ НАНУ.
А.Б. Боровков, И.Н. Гудвилович при высоте слоя раствора 10 см. Культуры постоянно перемешивали с помощью аквариумной помпы «Atman». Водоросли выращивали при естественном освещении. Погода в период эксперимента была облачная, с периодическими осадками. Среднесуточная температура культуральной среды 24 ОС, РН 6—7.
Эксперимент проводили в два этапа. Первоначально культуру D. salina выращивали в квазинепрерывном режиме (5 сут), причем ежесуточный обмен составлял 10 % (скорость протока среды 0,1 сут-1). На втором этапе, продолжавшемся 7 сут, использовали накопительный режим культивирования. Выросшую на первом этапе биомассу отбирали из бассейна и разбавляли в 5 и 10 раз. Разбавление проводили модифицированной средой без солей — источников азота и фосфора. Постепенно в течение суток повышали соленость в бассейнах до 240 г·дм-3.
Содержание сухого вещества (СВ), органического вещества (ОВ), относительное содержание хлорофилла а и суммарных каротиноидов определяли по: Гудвилович, 2012.
Результаты и обсуждение
На первом этапе эксперимента плотность культуры значительно не изменялась и находилась в пределах 0,59—0,68 г СВ·дм-3, т.е. культура фактически находилась в состоянии стационарного динамического равновесия с удельной скоростью роста 0,1 сут-1 (рис. 1).
1 этап 2 этап 0.8
Плотность культуры, г СВ•л-1
0.6
0.4
1
0.2 2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 Время культивирования, сут
Рис. 1. Динамика плотности культуры при двухстадийном выращивании Dunaliella salina. Пунктирная линия — граница между непрерывным и накопительным режимами культивирования. Разбавление в 5 (1) и 10 раз (2)
Продуктивность культуры на первом этапе в среднем составила 6 г·м-2·сут-1. На этой стадии роста культуры содержание пигментов варьировало в пределах 1,7—2,1 и 0,6—0,8 % ОВ — для хлорофилла а и каротиноидов соответственно, т.е. находилось в пределах, характерных для активно растущей «зеленой формы» D. salina.
На втором этапе после разбавления культуры наблюдали рост ее плотности. Кроме того, в первые сутки происходило резкое снижение относительного содержания хлорофилла а и каротиноидов в клетках D. salina (рис. 2). В после-
422 ISSN 0868-8540. Algologia. 2014, 24(3)
Полупромышленное выращивание Dunaliella salina дующие 6 сут относительное содержание хлорофилла а в клетках водоросли в двух вариантах эксперимента в среднем составляло 0,6—0,7 % ОВ. Содержание каротиноидов при разбавлении в 5 раз изменялось незначительно (0,2—0,3 % ОВ), а при 10-кратном разбавлении — постепенно увеличивалось (от 0,15 до 0,45 % ОВ) (см. рис. 2).
Продуктивность культуры D. salina по биомассе на первом этапе (6 г·м-2·сут-1) была в 3 раза выше, чем на промышленных производствах Израиля и Испании (Ben-Amotz, 1995; Garcia-Gonzalez et al., 2003). Полученная продуктивность для региона восточной Украины достигнута без использования добавок углекислого газа в культуральную среду.
А Б
2,50 Хлорофилла Каротиноиды
2,00 Кар/Хла
Относительное содержание, %ОВ
1,50
1,00
0,50
0,70 2,50
Относительное содержание, %ОВ
0,60 2,00 0,50
Соотношение Кар / Хл а 0,40 1,50
0,30 1,00
0,20
0,50
0,10
Хлорофилла 0,70
Каротиноиды
Кар/Хла 0,60
Соотношение Кар / Хл а 0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00 0,00
0 1 2 3 4 5 6
0,00 0,00
0 1 2 3 4 5 6 7
Время, сутки Время, сутки
Рис. 2. Динамика относительного содержания хлорофилла а, каротиноидов и их соотношения. Разбавление культуры в 5 (А) и 10 раз (Б)
На втором этапе после разбавления культуры наблюдали рост ее плотности, который обусловлен изменением световых условий и, по-видимому, остаточной концентрацией биогенных элементов в среде. Отмеченное в первые сутки после изменения условий резкое снижение относительного содержания пигментов, как правило, рассматривается исследователями как ответная реакция на одно-временное скачкообразное изменение сразу нескольких факторов среды: концентрации биогенов, освещенности, РН, солености и др. (Дробецкая, 2005). Причем в случае максимального разбавления воздействие данных факторов было более ярко выражено, так как содержание пигментов за первые сутки уменьшилось в 4,5 раза, тогда как в другом варианте опыта — в 2,5 раза.
По литературным данным, основными стрессовыми факторами для индукции синтеза ?-каротина являются: комбинация высокой освещенности и дефицита биогенных элементов (Масюк, 1973; Боровков, 2008; Ben-Amotz, 1989, 1995; Lamers, 2010). На втором этапе после повышения освещенности в 5 и 10 раз (за счет разбавления культуры) и повышения солености среды в 2 раза индукции гиперсинтеза ?-каротина не произошло. По-видимому, отрицательную роль сыграли погодные условия. Пасмурная погода на протяжении всего эксперимента не позволила достигнуть уровня необходимой освещенности для гиперсинтеза каротиноидов. Тем не менее, для варианта эксперимента с 10-кратным разведением, в котором влияние фактора освещенности и дефицита биогенных элементов в культуре было более выражено, чем при 5-кратном, ISSN 0868-8540. Альгология. 2014, 24(3) 423
А.Б. Боровков, И.Н. Гудвилович содержание каротиноидов и, соответственно, значение соотношения кар./хл. а имело стабильную тенденцию к повышению (от 0,4 в начале до 0,65 к окончанию эксперимента). Данный процесс свидетельствует о перестройке пигментного аппарата и обычно наблюдается перед активным накоплением каротиноидов в клетках дуналиеллы.
Вывод
Проведена апробация двухстадийного культивирования Dunaliella salina в полупромышленных условиях с использованием квазинепрерывного метода выращивания. Экспериментально показано, что в условиях естественного освещения (при пасмурной погоде) в данном регионе повышения освещенности за счет разбавления культуры в 5—10 раз и повышения солености культуральной среды в 2 раза оказалось недостаточно для интенсивного накопления каротиноидов. Тем не менее, при 10-кратном разбавлении наблюдалось устойчивое повышение соотношения кар./хл. а. Дальнейшее исследование по подбору условий и оптимизации перевода культуры D. salina от фазы активного роста к фазе накопления каротиноидов позволит разработать эффективную технологию получения в интенсивной культуре биомассы D. salina, обогащенной каротином.
Список литературы
Боровков А.Б. Динамика пигментов и роста микроводорослей в хемостате на примере Dunaliella salina Teod.: Автореф. дис. … канд. биол. наук. — Севастополь, 2008. — 28 с.
Гудвилович И.Н., Боровков А.Б. Ростовые и биохимические показатели квазинепрерывной культуры Dunaliella salina // Біотехнологія. — 2012. — 5(3). — С. 105—111.
Дробецкая И.В. Влияние условий минерального питания на рост и химический состав Spirulina platensis (Nordst.) Geitl.: Автореф. дис. … канд. биол. наук. — Севастополь, 2005. — 26 с.
Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. — Киев: Наук. думка, 1973. — 487 с.
Ben-Amotz A. New mode of Dunaliella biotechnology: two-phase growth for ?-carotene production // J. Appl. Phycol. — 1995. — 7. — P. 65—68.
Ben-Amotz A., Shaish A., Avron M. Mode of action of the massively accumulated ?-carotene of Dunaliella bardawil in protecting the algae aqainst damage by excess irradiation // Plant. Physiol. — 1989. — 91(3). — P. 1040—1043.
Garcia-Gonzalez M., Moreno J., Canavate J.P. et al. Conditions for open-air outdoor culture of Dunaliella salina in southern Spain // J. Appl. Phycol. — 2003. — 15. — P. 177—184.
Lamers P.P., Van de Laak C.C.W., Kaasenbrood P.S. et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina // Biotechnol. and Bioeng. — 2010. — 106(4). — P. 638— 648.
Lee Y.K. Microalgae mass culture system and methods: Their limitation and potential // J. Appl. Phycol. — 2001. — 13. — P. 307—315.
Подписал в печать П.М. Царенко
424 ISSN 0868-8540. Algologia. 2014, 24(3)
Полупромышленное выращивание Dunaliella salina
А.B. Borovkov, I.N. Gudvilovich
A.O. Kovalevsky Institute of Biology of Southern Seas, NAS of Ukraine, 2, Nakhimov Av., 99011 Sevastopol, Ukraine e-mail: spirit2000@ua.fm, gudirina2008@yandex.ru
PILOT-SCALE CULTIVATION OF DUNALIELLA SALINA TEOD. (CHLOROPHYTA) IN THE EASTERN PART OF UKRAINE
The testing of two-stage system of industrial cultivation of Dunaliella salina with semicontinuous mode was carried out. After transition from continuous to the batch cultivation and 10-fold culture dilution steady increase in both the carotenoid content in Dunaliella cells, and the car./chl. a ratio was observed. This indicates restructuring of the pigment complex which is observed before the active carotenoids accumulation in Dunaliella cells.
