Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств - Автореферат

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наукВ первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом B.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, и болезнью, обнаруженной в Европе. В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявление антител к возбудителю. Высокая вариабельность особенно характерна для внешних поверхностных белков боррелий, которые с одной стороны являются иммунодоминантными, с другой стороны - гомология среди белков этого класса варьирует от 70 до 100% даже среди изолятов выделенных на одной территории. Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов FLAA, FLAB, OSPC, OSPA и DBPB западносибирского изолята B.garinii, группы 20047Т и гена OSPC западносибирского изолята B.afzelii; выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FLAA, FLAB, OSPC, OSPA и DBPB спирохет B. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GENEBANK (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 20047Т (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе.На первом этапе определяли присутствие геномных ДНК боррелий в препаратах ДНК, выделенных из клещей, с помощью амплификации методом ПЦР межгенной области rrf-rrl (генов 5S и 23S РРНК) генома спирохет. 1 видно, что 7 исследуемых образцов (дорожки 2, 4, 7, 10-13) содержат геномную ДНК спирохет, относящихся к геновиду B.garinii (геномная группа 20047T); 1 образец (дорожка 3) - к геновиду B.japonica; 1 образец (дорожка 8) - к геновиду B.afzelii; 1 образец (дорожка 6) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.garinii (геномные группы NT29 и 20047T); 1 исследуемый образец (дорожка 9) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.japonica и B.garinii 20047T. Для удобства клонирования выбранных нами генов иммунодоминантых белков боррелий и обеспечения эффективной экспрессии этих генов в клетках E.coli были сконструированы экспрессирующие векторы серии PRAC. Затем мы выполнили ряд последовательных процедур по реконструкции вектора PREB2: 1) участок вектора PREB2, расположенный между сайтом рестрикции BAMHI и терминатором транскрипции T0, включающий ген дигидрофолатредуктазы, был удален, таким образом стоп кодон трансляции был помещен вблизи терминатора транскрипции T0; 2) заменили участок плазмиды, включающий сайт SD и последовательность до инициирующего кодона ATG, регуляторного района гена RECA Proteus mirabilis на соответствующий район сильного синтетического промотора Ptaq; 3) слева от сайта SD промотора Ptaq был встроен энхансер трансляции гена 10 бактериофага Т7 с помощью пары комплементарных синтетических олигонуклеотидов. фрагмент гена hla S.aureus, кодирующий сигнальный пептид стафилококкового альфатоксина (САТ); hla - область гена hla S.aureus, кодирующая полипептид-предшественник альфатоксина; 6His - участок ДНК, кодирующий 6-ти гистидиновую последовательность; DHFR - ген дигидрофолатредуктазы; T0-region - область терминатора транскрипции гена t0 бактериофага ?; Ori PMB1 - ориджин репликации плазмиды PMB1; PBR322 region - участок ДНК плазмиды PBR322; AMPR - ген bla, кодирующий бета-лактамазу - фермент обусловливающий устойчивость клеток E.coli к ампициллину.В настоящей работе была определена зараженность и геновидовой состав спирохет Borrelia burgdorferi s.l. в клещах Ixodes persulcatus Schulze, обитающих на территории Новосибирского научного центра и отловленных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 г.г. Впервые на территории Новосибирской области в клещах Ixodes persulcatus были обнаружены спирохеты геновида Borrelia japonica (2006 и 2008 г.г.). В работе были получены культуры спирохет B.garinii и B.afzelii, циркулирующих в популяции иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ.Зараженность клещей Ixodes persulcatus Schulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в весенние периоды с 2003 по 2008 г.г., спирохетами Borrelia burgdorferi s.l., колебалась в зависимости от года наблюдений в пределах 20% - 32%. В популяции исследованных клещей Новосибирской области выявлены только три геновида боррелий - Borrelia garinii (группы NT29 и 20047T), Borrelia afzelii и Borrelia japonica с явным преобладанием первого (~75%).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящей работе была определена зараженность и геновидовой состав спирохет Borrelia burgdorferi s.l. в клещах Ixodes persulcatus Schulze, обитающих на территории Новосибирского научного центра и отловленных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 г.г. Впервые на территории Новосибирской области в клещах Ixodes persulcatus были обнаружены спирохеты геновида Borrelia japonica (2006 и 2008 г.г.). В работе были получены культуры спирохет B.garinii и B.afzelii, циркулирующих в популяции иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ. Были проклонированы в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов PRAC3 и PETM кодирующие области генов внешних поверхностных липопротеинов (OSPA и OSPC), флагеллярных белков (FLAA и FLAB) и декоринсвязывающего белка В (DBPB) изолята B.garinii группы 20047Т и белка OSPC изолята B.afzelii.

В работе были получены высоко очищенные рекомбинантные белки боррелий OSPC-Bg, OSPC-Ba, OSPA, FLAA, FLAB и DBPB и исследованы их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ. По результатам ИФА можно сделать вывод о пригодности полученных в данной работе рекомбинантных антигенов OSPC, FLAA и FLAB B.garinii и OSPC B.afzelii для серодиагностики инфекций ранней и диссеминированной стадий. Рекомбинантные белки OSPA и DBPB могут быть использованы для серодиагностики диссеминированной и хронической стадий ИКБ. Результаты ИФА свидетельствуют о необходимости использования композиций антигенов для увеличения чувствительности методов серодиагностики ИКБ. На примере рекомбинантных белков OSPC изолятов B.garinii и B.afzelii показана необходимость использования для серодиагностики гомологичных вариабельных антигенов, всех патогенных изолятов боррелий циркулирующих на территории Новосибирской области.

По данным сравнения аминокислотных последовательностей, полученных в настоящей работе рекомбинантных белков, с первичными структурами аналогичных белков боррелий, представленных в базе данных GENBANK, изолят B.garinii 20047Т (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.1. Зараженность клещей Ixodes persulcatus Schulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в весенние периоды с 2003 по 2008 г.г., спирохетами Borrelia burgdorferi s.l., колебалась в зависимости от года наблюдений в пределах 20% - 32%.

2. В популяции исследованных клещей Новосибирской области выявлены только три геновида боррелий - Borrelia garinii (группы NT29 и 20047T), Borrelia afzelii и Borrelia japonica с явным преобладанием первого (~75%).

3. Сконструированные плазмидные векторы PRAC3 и РЕТМ, обеспечивают эффективную экспрессию клонируемых в их составе генов в клетках E.coli шт. BL21(DE3) и шт. Rosetta2 и последующую аффинную очистку рекомбинантных белков.

4. Штамм E.coli, содержащий вектор PRAC, может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения мутагенов химичечской и физической природы в исследуемых образцах.

5. Штаммы E.coli BL21(DE3) и Rosetta2, несущие экспрессирующий вектор РЕТМ со встроенными в него кодирующими областями генов FLAA, FLAB, OSPC, OSPA и DBPB B.garinii 20047Т и OSPC B.afzelii обеспечивают эффективный синтез соответствующих этим генам рекомбинантных белков.

6. Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FLAA, FLAB, OSPC, OSPA и DBPB могут быть использованы для конструирования тест-систем серодиагностики локализованной и диссеменированной стадий ИКБ.

7. Западносибирский изолят B.garinii 20047Т (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.

1. Рябченко А.В., Ивлева И.Н., Беклемишев А.Б. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространенных в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. // Журнал инфекционной патологии. - 2004. - Т. 11. - № 3-4. - С. 107-110.

2. Рябченко А.В., Терехова Д.В., Ивлева И.В., Бирюков А.Ю., Беклемишев А.Б. Выделение и типирование западносибирских изолятов боррелий, возбудителей иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международного мультидисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». - 2004. - Судак, Украина. - С. 141-142.

3. Рябченко А.В. Получение западносибирских культур Borrelia burgdorferi s.l. // Аспирантский сборник НГПУ 2004. - Новосибирск: Изд. НГПУ. - 2004. - Ч. 2. - С. 160-168.

4. Рябченко А.В., Караваев В.С., Ивлева И.Н., Терехова Д.В., Беклемишев А.Б. Оценка пригодности ряда антигенов сибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato для диагностики иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». - 2004. - Новосибирск, Россия. - С. 272.

5. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2005 г. в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. // Журнал инфекционной патологии. - 2005. - Т. 12. - № 3-4. - С. 109-110.

6. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б., Ивлева И.Н. Конструирование вектора для эффективной экспрессии генов в клетках E.coli. // Материалы третьего Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М: ЗАО "Экспо-биохим-технология", РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2005. - Ч. 1. - С. 99-100.

7. Рябченко А.В., Караваев В.С., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных форм некоторых иммунодоминантных белков западносибирских изолятов возбудителя Лайм-боррелиоза и оценка их диагностической значимости // Материалы московской международной конференции «Биотехнология и медицина». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технология», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2006. - С. 55.

8. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание биосенсорной тест-системы для детекции повреждений ДНК путем использования репортерного белка GFP //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141. - № 1. - С. 38-40.

9. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Мониторинг зараженности клещей рекреационной зоны г. Новосибирска возбудителями Лайм-боррелиоза // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 106-110.

10. Лавриненко И.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание цельноклеточной биосенсорной тест-системы для обнаружения генотоксических воздействий на клетку // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 95-99.

11. Рябченко А.В., Лавриненко И.А., Беклемишев А.Б. Рекомбинантная плазмидная ДНК для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) // Патент РФ № 2311459 от 27.11.2007.

12. Караваев В.С., Иванов И.Д., Рябченко А.В. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков OSPC и фрагмента FLAB (f-FLAB) Borrelia garinii NT29 в экспериментах с сыворотками больных Лайм-боррелиозом // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 53-57.

13. Рябченко А.В., Мамаев А.Л. Инфицированность клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2006г. в лесопарковой зоне новосибирского академгородка // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 58-61.

14. Караваев В.С., Иванов И.Д., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных белков OSPC и фрагмента FLAB (f-FLAB) западносибирских изолятов Borrelia garinii NT29 и исследование их свойств // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2008. - № 1. - С. 18-22.

Размещено на .ru