Цитогенетический статус курящих и некурящих больных немелкоклеточным раком легкого в зависимости от генотипа. Исследование непосредственного повреждающего воздействия канцерогенов табачного дыма на легкое и возникновение цитогенетических повреждений.
При низкой оригинальности работы "Полиморфизм GST-генов и цитогенетические изменения в ткани легкого больных раком легкого", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
1 Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 2 Минский городской клинический онкологический диспансер И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ТКАНИ ЛЕГКОГО БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО Обнаружено, что носители делеции гена GSTT1 более подвержены риску возникновения немелкоклеточного рака легкого, чем носители нормального генотипа GSTT1( ). Изучение связи полиморфизма GST-генов и цитогенетических показателей у больных раком легкого показало достоверное превышение среднегруппового уровня клеток с микроядрами у больных НМРЛ с GSTT1(-), причем у курящих пациентов с мутантным генотипом частота клеток с микроядрами была выше по сравнению с курящими носителями генотипа GSTT1( ).Основными внешними факторами, вызывающими развитие онкопатологии, в том числе и рака легкого, является загрязнение окружающей среды различными химическими и радио-активными веществами. Уровень генетических повреждений клеток, вызываемых канцерогенами, в немалой степени зависит от индивидуальной чувствительности соматических клеток к этим генотоксическим агентам, которая определяется прежде всего активностью систем репарации и элиминации клеток, а также функционированием антиоксидантных ферментов. Наличие гомозиготной делеции («нулевой генотип») хо-тя бы по одному из этих генов связывают с увеличением риска заболевания различными формами рака, в том числе и немелкоклеточным раком легкого [1]. Большой интерес в связи с этим представляет цитогене-тическое проявление неблагоприятного генотипа и возможность создания на этой основе идентификации подгрупп людей высокого риска развития онкологических патологий во-обще и рака легкого в частности. Такая закономерность была обнаружена и другими исследователями в отношении многих генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: некурящие носители мутаций этих генов подвергаются большему риску развития рака легкого по сравнению с некурящими носителями аллелей дикого типа [9].
Введение
Экономические и социальные последствия устойчивого роста заболеваемости злокачественными новообразованиями и смертности от них делают актуальным разработку и совершенствование методов ранней диагностики и прогноза течения рака. На сегодняшний день решение этих вопросов связывают с молекулярно-генетическими исследованиями, которые позволяют выявлять гены, вовлеченные в процесс канцерогенеза.
Основными внешними факторами, вызывающими развитие онкопатологии, в том числе и рака легкого, является загрязнение окружающей среды различными химическими и радио-активными веществами. Уровень генетических повреждений клеток, вызываемых канцерогенами, в немалой степени зависит от индивидуальной чувствительности соматических клеток к этим генотоксическим агентам, которая определяется прежде всего активностью систем репарации и элиминации клеток, а также функционированием антиоксидантных ферментов. Среди них ключевая роль отводится глутатион-трансферазам (GST), которые принимают участие в детоксикации активированных цитохромом Р450 реактивных метаболитов во второй фазе ферментативной биотрансформации ксенобиотиков. Наиболее изученными из этих ферментов являются глутатионтрансферазы класса q (GSTM1) и класса m (GSTT1). Наличие гомозиготной делеции («нулевой генотип») хо-тя бы по одному из этих генов связывают с увеличением риска заболевания различными формами рака, в том числе и немелкоклеточным раком легкого [1]. В результате сниженной детоксикации метаболитов в реакциях биотрансформации повышается вероятность повреждения «критических генов», участвующих в регуляции клеточного роста, процессов репарации, гибели клеток, непосредственно влияющих на развитие канцерогенеза [2].
Степень чувствительности к генотоксическим агентам скорее всего определяется балансом активностей различных глутатион-S-трансфераз, поскольку они полиморфны и имеют перекрывающуюся субстратную специфичность [3]. В этом случае отсутствие функционирования одного гена может компенсироваться активностью других GST, поэтому исследование полиморфизма GST требует комплексного подхода с привлечением данных по нескольким генам одновременно.
ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1
Полиморфизм GST-генов и цитогенетические изменения в ткани легкого больных раком легкого
Анализ данных связи наследуемого функционального дефицита глутатион-S-трансферазы (GSTM1 и GSTT1) с генетическими нарушениями также подтверждает непосредственное участие фермента в метаболических путях, которые обеспечивают защиту клеток от химических и радиоактивных канцерогенов, индуцирующих повреждения ДНК [4]. Большой интерес в связи с этим представляет цитогене-тическое проявление неблагоприятного генотипа и возможность создания на этой основе идентификации подгрупп людей высокого риска развития онкологических патологий во-обще и рака легкого в частности.
Материалы и методы. Обследовали 70 больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), проходивших лечение в Минском городском клиническом онкологическом диспансере (курящих - 49, некурящих - 21). Диагноз НМРЛ у всех больных был подтвержден цитологически и гистологически. При оценке полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 контрольная группа была представлена выборкой из 103 человек без онкопатологии, проживающих в г. Минске. Анамнез курения был известен у 80 человек, среди них 22 некурящих и 58 курящих. Исследуемые выборки были представлены лицами белорусской национальности.
ДНК для молекулярного исследования выделяли из лимфоцитов периферической крови с использованием фенольно-хлороформной экстракции [5]. Типирование образцов по генам GSTM1 и GSTT1 проводили мультиплексной ПЦР, описанной Arand et al. [6], с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров (табл. 1).
Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 100-200 нг ДНК, 0,3 мкл каждого праймера, 50 ММ трис HCL (РН 8,4), 50 ММ KCL, 1,5 MM MGCL2, а также 2 ММ каждого DNTP и 1U Taq-полимеразы. Температура отжига праймеров - 64 °С. Продукты амплификации фракционировали в 1,8%-ном агарозном геле с бромистым этидием в течение 40 мин при напряжении 100 В и визуализировали в УФ-свете. Гомозиготы и гетерозиготы по нормальному аллелю « » для генов GSTM1 и GSTT1 определяли на электрофореграммах по наличию продукта амплификации размером 215 п.н. (GSTM1) и фрагмента 480 п.н. (GSTT1). Отсут-
ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1 ствие соответствующих фрагментов указывало на гомозиготность индивидуума по делеции обоих аллелей. В качестве внутреннего контроля использовали амплификацию фрагмента гена альбумина. Гетерозиготные особи «-/ » в наших экспериментах не идентифицировались.
Для цитогенетических исследований использовали метод интерфазного анализа соматических клеток без культивирования. В клетках легкого на послеоперационных мазках - отпечатках с неопухолевой ткани больных раком легкого оценивали частоту клеток с микроядрами [7]. В качестве контроля для цитогенетического анализа использовали аутопсийный материал из патологоанатомического бюро от 23 человек из Минска, умерших по причинам, не связанным с онкологическими заболеваниями. Статистическую обработку материала проводили с использованием пакета прикладных про-грамм «Statistica for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов использовали стандартный критерий c2 Пирсона. В том случае, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали критерий Фишера. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к НМРЛ судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR), которую рассчитывали по стандартной формуле OR = (A/B)/(C/D), где A и B - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно; C и D - количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. OR Таблица 1 Праймеры, использованные в работе
Праймеры Последовательность продукта, п.н.
Длина
GSTM1 (F) GAACTCCCTG AAAAGCTAAA- 215 GC
GSTM1 (R) GTTGGGCTCA AATATACGGT-GG
GSTT1 (F) TTCCTTACTG GTCCTCACAT- 480 CTC
GSTT1 (R) TCACCGGATC ATGGCCAGCA
Albumin (F) GCCCTCTGCT AACAAGTCCT- 350 AC
Albumin (R) GCCCTAAAAA GAAAATCGCC-AATC
49
Н.Н. Чакова, Е.П. Михаленко, С.Н. Полонецкая и др.
указан с 95%-ным доверительным интервалом. OR, рассчитанные сопоставлением частот только некурящих больных и здоровых людей или, наоборот, расtrialнные только для курящих больных и здоровых людей, показывают влияние генотипа (ORG) на риск возникновения рака легких, но в разных условиях окружающей среды. OR, рассчитанные путем сопоставления частот курящих больных и некурящих здоровых людей, учитывают взаимодействие генетического признака и внешнего фактора (ORG f). Если влияние этих факторов однонаправлено, то величина ORG f будет выше, чем ORG для некурящих. Если же влияние этих факторов разно-направлено, то ORG f будет ниже [8].
Для оценки ассоциации исследуемых генотипов с уровнем клеток с микроядрами использовали t-критерий.
Результаты исследований и их обсуждение. Хорошо известно, что в этиологии заболевания раком легкого не последнее место занимает курение. В группе обследованных нами больных c такой патологией 70 % оказались курильщиками. У этих пациентов рак легкого возник в более раннем возрасте (60,3 года) по сравнению с некурящими (66,5 года). Данные по генотипированию GSTM1 и GSTT1 с учетом статуса курения представлены в табл. 2. В контрольной группе частота встречаемости нуль-генотипов GSTM1 и GSTT1 составляла 41,7 и 12,6 %, что соответствует литературным данным о распространенности нуль-генотипов GSTM1 и GSTT1 в западноевропейских популяциях [9]. В группе пациентов с НМРЛ частота генотипа GSTM1(-) не отличалась от контрольной группы. Иную ситуацию наблюдали в отношении генотипа GSTT1(-), частота встречаемости которого у больных была достоверно выше в 2,4 раза по сравнению с контролем, что, по-видимому, указывает на доминирующую роль GSTT1(-) в формировании предрасположенности к НМРЛ.
Для генотипа GSTM1(-) величины ORG в группах курящих и некурящих больных не различались. Для генотипа GSTT1(-) у некурящих величина ORG достигла величины 5,0 и являлась статистически значимой, в то же время в группе курящих выявлено недостоверное повышение ORG. Более высокая величина OR для генотипа GSTT1(-) у некурящих людей по сравнению с курящими может объясняться большей чувствительностью носителей нуль-генотипа к патогенным эффектам загрязнителей окружающей среды в области низких концентраций. Такая закономерность была обнаружена и другими исследователями в отношении многих генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: некурящие носители мутаций этих генов подвергаются большему риску развития рака легкого по сравнению с некурящими носителями аллелей дикого типа [9]. Для курящих больных наличие мутантных аллелей ферментов биотрансформации в развитии рака легкого, очевидно, не является столь определя- trialца 2 Ассоциация генотипов GST с риском возникновения НМРЛ
Примечание. * р < 0,05, ** р < 0,01; р - уровень значимости различий по критерию c2 всравнении с аналогичными группами в контроле.
50 ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1
Полиморфизм GST-генов и цитогенетические изменения в ткани легкого больных раком легкого ющим. По-видимому, курение, будучи комплексным фактором риска, вовлекает множество других существенных механизмов развития заболевания, в частности, вызывает более высокую экспрессию энзимов, участвующих в репарации повреждений ДНК [10]. Оценка относительного риска генотипов в сочетании с курением (ORG f) также подтвердила, что курение модифицирует рисковую значимость генотипов в возникновении рака легкого.
Нужно отметить, что связь генов ферментов биотрансформации, в том числе GST, с риском возникновения рака легкого активно изучается многими исследовательскими коллективами, при этом имеются достаточно противоречивые данные. В работе Raimondi et al. [11] не было выявлено связи между делецией в гене GSTT1 и развитием рака легкого, а также между статусом GSTT1 и курением в отношении этого заболевания. В то же время в работе немецких ученых [12] показано, что наличие нуль-генотипа GSTT1 увеличивало риск заболевания у курильщиков. Российские исследователи [13, 14] показали достоверное увеличение нулевого генотипа гена GSTT1 у больных раком легкого и пациентов с хроническими неспецифическими заболеваниями легких. Противоречивость данных, полученных различными исследователями, может быть объяснена реально существующими различиями в генотипической структуре изучаемых популяций. В частности, различные этнические группы могут обладать неодинаковым соотношением аллелей генов ферментов, обладающих сходной с глутатион-S-трансферазами субстратной специфичностью. Известно, что мутации в генах детоксикации сопровождаются изменением уровня цитогенетических показателей в соматических клетках [10]. Можно предположить, что сниженная активность или отсутствие некоторых ферментов второй фазы детоксикации способствует более длительному сохранению в организме промежуточных продуктов биотрансформации ксенобиотиков, которые могут быть весьма токсичными, проявлять выраженную мутагенную активность и вследствие этого являться причиной различных патологических состояний легкого [14]. В результате проведенного нами цитогенетического исследования неопухолевой ткани легкого выявлено отсутствие
ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1
Таблица 3 Цитогенетический анализ неопухолевой ткани у больных НМРЛ с различным генотипом по GSTT1
Таблица 4 Цитогенетический статус курящих и некурящих больных НМРЛ в зависимости от генотипа
Частота клеток
Генотипы с микроядрами, x ± SX, %
Курящие пациенты
GSTT1( ) 0,30 ± 0,04 GSTT1(-) 0,57 ± 0,09*
Некурящие пациенты
GSTT1( ) 0,37 ± 0,10 GSTT1(-) 0,40 ± 0,10
* Достоверная разница с обладателями генотипа GSTT1( ) (р < 0,05). различий в частоте клеток с микроядрами у людей с генотипами GSTT1(-) и GSTT1( ) в контрольной группе и показано статистически достоверное превышение среднегруппового уровня этого показателя у больных НМРЛ с мутантным генотипом (табл. 3).
В связи с тем, что у курящих и некурящих пациентов наблюдалось различное соотношение мутантных и немутантных генотипов GSTT1, полученные данные цитогенетического анализа неопухолевой ткани легкого оценены нами с учетом фактора курения (табл. 4).
В клетках неопухолевой ткани легкого у больных НМРЛ без учета генотипов не обнаружено различий в средних уровнях исследуемых показателей у курящих и некурящих пациентов. Однако у курящих пациентов с генотипом GSTT1(-) было показано статистически досто-
51
Н.Н. Чакова, Е.П. Михаленко, С.Н. Полонецкая и др.
верное превышение среднегруппового уровня клеток с микроядрами (0,57 ± 0,09 %) по сравнению с GSTT1( ) (0,30 ± 0,04 %). В то же время у некурящих пациентов не обнаружено связи между генотипом GSTT1 и уровнем мутационного процесса в неопухолевой ткани легкого: частота клеток с микроядрами не различалась у GSTT1(-) - 0,40 ± 0,10 % и GSTT1( ) - 0,37 ± 0,10 %. Одним из объяснений этого факта служит непосредственное повреждающее воздействие канцерогенов табачного дыма на ткань легкого, что в сочетании с мутантным геном GSTT1 приводит к высокой вероятности возникновения цитогенетических повреждений.
Таким образом, результаты нашей работы позволяют сделать предварительный вывод о том, что носители делеции гена GSTT1 в белорусской популяции более подвержены риску возникновения рака легкого, чем носители нормального генотипа GSTT1( ), и указывают на модифицирующее влияние факторов курения и полиморфизма гена GSTT1(-) на выход клеток с хромосомными аберрациями. Изучение ассоциации полиморфизма генов детоксикации с возникновением рака легкого позволяет сделать вывод о том, что для оценки того или иного генотипа как фактора риска необходимы знания о спектре канцерогенов, воздействию которых подвергается население той или иной территории, а также условий жизни отдельных людей, входящих в исследуемые группы (вредность на производстве, курение, диета). В зависимости от природы химических соединений, входящих в состав загрязнителей конкретной территории, может меняться степень риска, связанная с геном и его продуктом. Более того, то, что являлось фактором риска в одних условиях, может стать фактором устойчивости в других [15].
AND CYTOGENETIC CHANGES IN LUNG TISSUES OF LUNG CANCER PATIENTS
Carriers of GSTT1 gene deletion were found to be more subjected to a risk of emerging non-small-cell lung cancer (NSLC) than those of normal GSTT1( ) genotype. Study on the relation between GST gene polymorphism
52
and cytogenetic indices in lung cancer patients has shown a significant excess of the group average level in cells with micronuclei in NSLC patients with GSTT1(-). The frequency of cells with micronuclei was higher in smoking patients with a mutant genotype than in smoking carriers of the GSTT1( ) genotype.
ТА ЦИТОПЛАЗМАТИЧНІ ЗМІНИ В ТКАНИНІ ЛЕГЕНІВ У ХВОРИХ РАКОМ ЛЕГЕНІВ
Виявлено, що носії делеції гена GSTT1 більш схильні до ризику виникнення немілкоклітинного раку легенів (НМРЛ), ніж носії нормального генотипу GSTT1( ). Вивчення зв’язку поліморфізму GST-генів та цитогенетичних показників у хворих раком легенів показало вірогідне перевищення середньогрупового рівня клітин з мікроядрами у хворих НМРЛ з GSTT1(-), до того ж у пацієнтів, що палять, з мутантним генотипом частина клітин з мікроядрами була вище порівняно з носіями генотипу GSTT1( ), що палять.
Список литературы
1. Bartsch H., Hietanen E. The role of individual susceptibility in cancer burden related to environmental exposure // Environ. Health. Perspect. - 1996. - 104, № l3. - P. 569-577.
2. Raunio H., Husgafvel-Pursiainen K., Anttila S. et al. Diagnosis of polymorphisms in carcinogen-activating and inactivating enzymes and cancer susceptibility-a review // Gene. - 1995. - 159, № 1. - P. 113-121.
3. Knudson A.G.Jr. Hereditary cancer, oncogenes, and anti-oncogenes // Cancer Res. 1985. - 45, № 4. - P. 1437- 1443.
4. Karahalil B., Sardas S., Kocabas N.A. et al. Chromosomal aberrations under basal conditions and after treatment with X-ray in human lymphocytes as related to the GSTM1 genotype // Mutat. Res. - 2002. -515, № 1/2. - P. 135-140.
5. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberger J.I. Jr., Hodes M.E., Crisp M. A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested // J. Biochem. Biophys. Meth. - 1992. - 25, № 4. - Р. 193-205.
6. Arand M., Muhlbauer R., Hengstler J. et al. A multiplex polymerase chain reaction protocol for the simultaneous analysis of the glutathione S-transferase GSTM1 and GSTT1 polymorphisms // Anal. Biochem. - 1996. - 236, № 1. - Р. 184-186.
7. Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. - 1975. - 31, № 5. - P. 9-15.
ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1
Полиморфизм GST-генов и цитогенетические изменения в ткани легкого больных раком легкого
8. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Макарова С.И. и др. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа // Вестн. Рос. академии мед. наук. - 2000. - № 12. - С. 36-41.
9. Drakoulis N., Cascorbi I., Brockmoller J. et al. Polymorphisms in the human CYP1A1 gene as susceptibility factors for lung cancer: exon-7 mutation (4889 A to G), and a T to C mutation in the 3"-flanking region // Clin. Investig. - 1994. - 72, № 3. - P. 240-248.
10. Marcon F., Andreoli C., Rossi S. et al. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population // Mutat. Res. - 2003. - 541, № 1/2. - P. 1-8.
11. Raimondi S., Paracchini V., Autrup H. et al. Meta- and pooled analysis of GSTT1 and lung cancer: a HUGE-GSEC review // Amer. J. Epidemiol. - 2006. - 164, № 11. - Р. 1027-1042.
ISSN 0564-3783. Цитология и генетика. 2009. № 1
12. Schneider J., Bernges U., Philipp M., Woitowitz H.J. GSTM1, GSTT1, and GSTP1 polymorphism and lung cancer risk in relation to tobacco smoking // Cancer. Lett. - 2004. - 208, № 1. - Р. 65-74.
13. Дмитриева А.И., Новицкий В.В., Севостьянова Н.В. и др. Изучение полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого // Бюл. СО РАМН. - 2004. - № 1. - С. 60-62.
14. Иващенко Т.Э., Сиделева О.Г., Петрова М.А. и др. Генетические факторы предрасположенности к бронхиальной астме // Генетика. - 2001. - 37, № 1. - С. 107-111.
15. Гуляева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе. Сер. Экология. - Новосибирск, 2000. - Вып. 57. - 85 с.
Поступила 19.12.07
53
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
