Полимеразная цепная реакция - Реферат

Институт естественных наук Реферат на тему: ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯПолимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе) [1]. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro.Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев: ? Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3"-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза (термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З"-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности) начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. ? Не должны образовывать димеры и петли - не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом. ? Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров.Для удобства обнаружения или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси включают дополнительные компоненты. Внутренние контроли - гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный (фланкированный) специфическими праймерами. Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам ДНК-зонды могут использоваться для обнаружения продуктов реакции. Элонгация - синтез - комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров (рис. Температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3"-конца праймера, связанного с матрицей, и движется в направлении от 3" к 5" концу (рис.Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает - «эффект плато». В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения «эффекта плато» влияют: ? Утилизация субстратов (ДНТФ и праймеров);Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. ПЦР с обратной транскрипцией - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице МРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную КДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Используют смесь двух полимераз, одна из которых-Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая-ДНК полимераза с 3"-5" экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза.Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.На сегодняшний день метод полимеразной цепной реакции имеет огромное научное и прикладное значение, с его помощью можно реализовывать масштабные исследования в области медицины и биологии. Направления исследований, в которых ПЦР начинает играть ведущую роль: ? Диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Непосредственное определение возбудителей инфекционных заболеваний - дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического фрагмента ДНК возбудителя.

Содержание

Введение

Глава 1. Механизм полимеразной цепной реакции

1.1 Необходимые компоненты

1.2 Дополнительные компоненты

1.3 Эффект плато

Глава 2. Разновидности методов ПЦР

Глава 3. Область и границы применения метода ПЦР

Заключение

Список литературы

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. Впоследствии он получил за данное изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний [10].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе) [1].

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуального анализа. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (амплификации), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом, таких как введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК. Кроме этого широко используется в биологической и медицинской практике[4].