Поліморфізм Wx-генів та розробка біотехнології визначення вмісту амілози в процесі селекції пшениці - Автореферат

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені І.І. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук ПОЛІМОРФІЗМ WX-ГЕНІВ І РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ ОЦІНКИ ТА КОНТРОЛЮ ВМІСТУ АМІЛОЗИ В ПРОЦЕСІ СЕЛЕКЦІЇ ПШЕНИЦІ Робота виконана у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (м.Відсутність сукупності оптимізованих методів, які надали б можливість контролювати вміст амілози на різних етапах вегетації рослин, сповільнює процес створення сортів та ліній мякої пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози. У звязку з цим теоретичний та практичний інтерес представляє вивчення питань, що стосуються ефективності використання різноманітних методів для оцінки та контролю вмісту амілози у крохмалі та детекції Wx-генів. Розробка біотехнології оцінки та контролю вмісту амілози має велике значення для генетико-селекційних досліджень, оскільки дозволяє створювати сорти пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози в крохмалі зерна. Дослідження провадили згідно з завданням 01.02 „Розробка ДНК-технології визначення показників зерна мякої пшениці: твердозерність/мякозерність, низький вміст амілози” (номер державної реєстрації 0106U002663). На основі отриманих результатів розроблено біотехнологію оцінки та контролю вмісту амілози в процесі селекції сортів та ліній мякої пшениці з низьким або нульовим вмістом даного полімеру у крохмалі.У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нові шляхи вирішення наукової задачі, що полягають в удосконаленні методів прогнозування та контролю вмісту амілози в процесі селекції озимої мякої пшениці, з низьким вмістом даного полімеру у крохмалі та розробці на їх основі ефективної біотехнології. У видів Ae. umbellulata, Ae. ovata, Ae. tauschii ssp. strangulata за Wx-В1 локусом виявлено алель Wx-B1a розміром фрагменту ампліфікації 294 п.н. на відміну від видів Ae. crassa, Ae. caudata, Ae. boeticum у яких детектовано аллель (Wx-B1a) з молекулярною масою 308 п.н., як у T. aestivum L. За результатами молекулярно-генетичного тестування алелів Wx-локусів у рослин популяції F5 (Куяльник ? Wx-12) та проведеного генетичного аналізу, добрано 10 рослин з генотипом Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Розроблена біотехнологія, що базується на використанні ПЛР-аналізу та методу спектрофотометрії дозволяє в процесі селекції пшениці прогнозувати вміст амілози і проводити контрольований добір генотипів з потрібними комбінаціями алелів на стадіїї паростка, та контролювати вміст даного полімеру у дозрілому зерні. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з детекції алельного стану Wx-генів сортів пшениці української селекції, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ ОЦІНКИ І КОНТРОЛЮ ВМІСТУ АМІЛОЗИ В ПРОЦЕСІ СЕЛЕКЦІЇ ПШЕНИЦІ

У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нові шляхи вирішення наукової задачі, що полягають в удосконаленні методів прогнозування та контролю вмісту амілози в процесі селекції озимої мякої пшениці, з низьким вмістом даного полімеру у крохмалі та розробці на їх основі ефективної біотехнології. Результати досліджень дають змогу зробити наступні висновки: 1. Виявлено значну варіацію гранулометричного складу та інтенсивності забарвлювання крохмальних гранул у досліджених сортів, селекційних ліній пшениці, видів роду Aegilops. У порівнянні з гексаплоїдною пшеницею в досліджених зразках крохмалю представників роду Aegilops виявлено низький вміст гранул типу «Б».

2. Для оцінки вмісту амілози спектрофотометричним методом оптимальними діапазонами довжин хвиль є: для абсорбції - 600-750 нм, першої похідної абсорбції -480-760 нм.

3. Середні величини ефектів впливу функціональних алелів Wx-А1а, Wx-B1а, Wx-D1а на вміст амілози в крохмалі зерна мякої пшениці відносно альтернативних нуль-алелів склали 0,050, 0,054, 0,082 одиниць абсорбції, відповідно. Неповне відтворення Wx-фенотипу за наявності нуль-алелів по Wx-локусах свідчить про присутність додаткових генетичних факторів, що впливають на вміст амілози в крохмалі зерна мякої пшениці.

4. З використанням ПЛР-аналізу із алель-специфічними праймерами при тестуванні алельного стану Wx-генів 46 сортів пшениці української селекції детектовано алелі дикого типу (Wx-А1а, Wx-B1а, Wx-D1а). У видів Ae. umbellulata, Ae. ovata, Ae. tauschii ssp. strangulata за Wx-В1 локусом виявлено алель Wx-B1a розміром фрагменту ампліфікації 294 п.н. на відміну від видів Ae. crassa, Ae. caudata, Ae. boeticum у яких детектовано аллель (Wx-B1a) з молекулярною масою 308 п.н., як у T. aestivum L.

5. За результатами молекулярно-генетичного тестування алелів Wx-локусів у рослин популяції F5 (Куяльник ? Wx-12) та проведеного генетичного аналізу, добрано 10 рослин з генотипом Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Мікросателітний аналіз індивідуальних рослин - носіїв трьох нуль-алелів за Wx-генами (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b) та кластерний аналіз (UPGMA) показав, що генотипи 65/1, 65/2, 180/2, 180/3, є найбільш генетично наближеними до сорту Куяльник.

6. Розроблена біотехнологія, що базується на використанні ПЛР-аналізу та методу спектрофотометрії дозволяє в процесі селекції пшениці прогнозувати вміст амілози і проводити контрольований добір генотипів з потрібними комбінаціями алелів на стадіїї паростка, та контролювати вміст даного полімеру у дозрілому зерні.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Розроблена біотехнологія оцінки та контролю вмісту амілози в генотипах озимої мякої пшениці рекомендована для використання в генетико-селекційних дослідженнях при створенні форм з низьким або нульовим вмістом амілози.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петрова И.В. Идентификация Wx-генотипов среди сортов озимой мягкой пшеницы / И.В. Петрова, С.В. Чеботарь, А.И. Рыбалка, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика - 2007. - Т. 41. - № 6.- С. 11-17. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з детекції алельного стану Wx-генів сортів пшениці української селекції, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку).

2. Петрова І.В. Оптимізація спектрофотометричного визначення вмісту амілози в зерновому крохмалі селекційного матеріалу пшениці / І.В. Петрова, О.М. Хохлов, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // Фізіологія та біохімія культурних рослин. - 2008. - Т. 40. - № 3 (233). - С. 223-230. (Здобувачем сплановано основні напрями досліджень, проведено добір, підготовку матеріалу для аналізу, серії дослідів із спектрофотометричної оцінки вмісту амілози у крохмалі. Разом із співавторами проведено статистичний аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків, підготовку статті до друку).

3. Пат. 37137 Україна, МПК (2006) А01Н1/00. Спосіб діагностики та контролю Wx-генів при створенні сортів пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози / І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, О.М. Хохлов, Ю.М. Сиволап; заявник та патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u200801321; заявка 04.02.08; опубл. 25.11.2008, Бюл. № 22. (Особисто дисертантом проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, разом із співавторами проаналізовано результати дослідження, зроблено висновки та рекомендації, що слугували основою отримання патенту).

4. Сиволап Ю.М. Детекція Wx-генів в селекції озимої мякої пшениці на низький вміст амілози в крохмалі / Ю.М. Сиволап, І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка - Одеса: Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, 2008. - 12 с. (методичні рекомендації). (Дисертантом проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, разом із співавторами здійснено аналіз одержаних даних, сформовано висновки і підготовлено методичні рекомендації до друку).

5. Петрова І.В. ПЛР-аналіз алельного стану Wx-генів у сортів пшениці/ І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів: зб. наук. праць. - 2006. - Т.3. - С. 127-132. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу з детекції алельного стану Wx-генів сортів пшениці української селекції, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовлено публікацію до друку).

6. Петрова И.В. Контроль Wx-генов в процессе селекции при создании форм мягкой пшеницы с нулевым и низким содержанием амилозы / И.В. Петрова, С.В. Чеботарь, А.И. Рыбалка, Ю.М. Сиволап // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. - 2007. - Т. 1. - С. 162-164. (Особисто дисертантом проведено добір матеріалу, експериментальну роботу, статистичну обробку одержаних даних, разом із співавторами проведено аналіз результатів, формулювання основних положень і висновків, написання та підготовку статті до друку).

7. Petrova I. Diversity allelic state of the Wx genes / I. Petrova, S. Chebotar, Yu. Sivolap // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: III International Young Scientists conference, 15-18 May 2007: abstracts - Odessa, 2007. - P. 215. (Дисертантом особисто проведено аналіз літературних джерел, разом із співавторами оформлено та підготовлено до друку тези).

8. Петрова І.В. SSR-аналіз селекційних форм мякої пшениці з нульовим вмістом амілози у крохмалі / І.В. Петрова, С.В. Чеботар, О.І. Рибалка, Ю.М. Сиволап // V Міжнародна конференція «Геном рослин»: зб. наук. ст. - 2008. - С. 110-115. (Особисто здобувачем проведено експериментальну роботу, статистичну обробку одержаних даних, разом із співавторами - аналіз результатів, формулювання основних положень та висновків, підготовку публікації до друку).