Изучение влияния новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro. Оценка влияния перспективного антиагреганта на уровень свободного кальция в цитоплазме лимфоцитов.
При низкой оригинальности работы "Поиск потенциальных антеагрегационных средств среди вновь синтезированных дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АНТИАГРЕГАЦИОННЫХ СРЕДСТВ СРЕДИ ВНОВЬ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ДЕРИВАТОВ ПИРИДИН-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫРабота выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Александр Георгиевич Муляр Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Даниил Борисович Утешев доктор медицинских наук, профессор Александр Сергеевич Кинзирский Защита состоится «___»____________________2008 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.01 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127473, г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Государственного Медико-стоматологического Университета по адресу: 127206, г.Перспективным направлением в лечении этих заболеваний является применение лекарственных препаратов, изменяющих соотношение между продуктами метаболизма арахидоновой кислоты - простациклином и тромбоксаном А2 в сторону увеличения первого, что вызывает антиагрегационный эффект. Избирательное влияние на систему метаболизма арахидоновой кислоты, способствующее антиагрегационному действию, оказывает пиридин-3-карбоновая кислота, которая угнетает активность тромбоксансинтетазы и снижает уровень тромбогенного фактора - ТХА2, не влияя на синтез простациклина [A. В тоже время имеются исследования, свидетельствующие, что по силе и продолжительности антиагрегационного эффекта пиридин-3-карбоновую кислоту превосходили ее дериваты [Т.Л. Создание высокоэффективного и малотоксичного антиагреганта среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты позволит предложить для клинической практики медикаментозное средство, предназначенное для борьбы с тромбозами и различными сердечно-сосудистыми заболеваниями. Изучить влияние 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (в сравнении с эталонной субстанцией) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую аденозиндифосфорной кислотой в условиях in vitro.
Список литературы
Результаты исследований по теме диссертации изложены в 7 печатных научных работах, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов, содержит 22 рисунка, 7 таблиц. Список используемой литературы включает 59 отечественных и 106 зарубежных источников.
Материалы и методы исследования
В ходе опытов использовались 78 кроликов, 72 мыши, кровь здоровых доноров и кровь больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Было исследовано 16 химических веществ - производных пиридин-3-карбоновой кислоты. Данные химически чистые вещества были синтезированы старшим научным сотрудником НИИ Фармакологии РАМН Е.А. Кузнецовой и любезно предоставлены для исследований. 13 из них растворимы в Н2О (ИБХФ-21, ИБХФ-22, ИБХФ-24, ИБХФ-20, ИФК-393, ИФК-309, ИФК-367, ИФК-321, ИФК-472, ИФК-366, ЛБК-10, ЛБК-78, ЛБК-149) и 3 вещества (ИБХФ-23, ИФК-406, ИФК-392) нерастворимы не только в Н2О, но и в ТВИН и ДМСО.
Исследование агрегации тромбоцитов
Исследование агрегации тромбоцитов проводилось по методу Born GVR (1962). До начала опыта и в конце его в каждом образце плазмы подсчитывалось количество тромбоцитов. Если она содержала большее количество тромбоцитов, ее разводили до нужной концентрации плазмой, бедной тромбоцитами, которую получали центрифугированием крови при 650g (3000 об./мин) в течение 10 минут.
Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на агрегометре фирмы «Chrono-log» (США).
Исследуемые вещества изучались в концентрациях 10-3, 10-4 и 10-5М, при необходимости их концентрации последовательно уменьшали до той, при которой действие АДФ восстанавливалось до контрольных значений (in vitro) или для доз через определенные промежутки времени (30, 60, 120, 180 и 240 минут) после перорального введения животным (in vivo). В качестве препарата сравнения использовалась пиридин-3-карбоновая кислота с ранее установленным антиагрегационным эффектом. Индуктором агрегации была выбрана АДФ - НПО «Ренам», Россия; (серийный № 0902) - в концентрации 10-5 М.
Полученные данные обрабатывалась методом вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивалась с применением критерия Стьюдента-Фишера. В работе был принят уровень вероятности р? 0,05.
Регистрация образования активных форм кислорода «Дыхательный взрыв»
Для определения АФК использовался чувствительный метод хемилюминисценции люминофоров - соединений, возбуждающихся в результате взаимодействия с радикалами кислорода и затем люминесцирующих в более длинноволновой области спектра при их рекомбинации. В качестве люминофора использовался люцигенин, конечная концентрация которого в пробе составила 20 МКМ. Хемилюмининсценция регистрировалась в виде количества импульсов в минуту на люминометре «Биотокс-7», соединенным с персональным компьютером. Эксперименты проводились на образцах неразведенной периферической цельной крови здоровых доноров и крови больных острым инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II стадии. Кровь бралась непосредственно перед экспериментом в шприц, стенки которого предварительно обрабатывались гепарином (500 МЕ/мл).
Изучение концентрации свободного кальция [Ca2 ]i в лимфоцитах здорового человека
Величина концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме клеток оценивалась с помощью флуоресцентного индикатора ионов кальция Fura-2M. Измерение флуоресценции проводилось на спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония).
Определение острой токсичности
Острая токсичность (LD50) исследуемого соединения определялась на мышах массой 20±2 г. при постоянной температуре окружающей среды (20-22°С).
LD50 рассчитывалась по методу Кербера, спустя 24 часа после введения вещества.
Результаты исследования
Распространенность тромбозов, занимающих существенное место среди непосредственных причин смерти больных при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, диктует необходимость поиска новых эффективных противотромботических веществ, в т.ч. антиагрегантов для профилактики и лечения осложнений основных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Целесообразность проведения исследований производных пиридин-3-карбоновой кислоты обусловлена тем, что ее дериваты обладают широким спектром биологической активности.
В соответствии с этим первая серия опытов была посвящена изучению влияния 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro по сравнению с эталонным препаратом - пиридин-3-карбоновой кислотой. Выбор данной модели стимуляции тромбоцитов был обусловлен тем, что АДФ является одним из наиболее мощных активаторов данных форменных элементов крови. Исследуемые субстанции использовались в концентрациях от 10-6 до 10-3М (табл. 1, рис.1).
В результате опытов было установлено, что 3 вещества в разной степени угнетали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Наиболее выраженной способностью подавлять основную функцию тромбоцитов, обладало вещество ИФК-366. В концентрации 10-3М оно снижало показатель агрегации, т.е. процент падения оптической плотности плазмы на 27% по сравнению с контролем. В концентрации 10-4М действие АДФ еще больше ослабевало и составило 34% от первоначальных значений. Данный эффект был в 1,9 раза был выше, чем у пиридин-3-карбоновой кислоты в концентрации 10-3М (18%).
Таблица 1
Влияние новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов в условиях in vitro
№ № Вещества % падения оптической плотности плазмы, богатой тромбоцитами
Концентрации исследуемых веществ
Контроль (АДФ) 10-3М /?% 10-4М/?% 10-5М/?% 10-6М / ?%
Примечание: * - достоверно по сравнению с контролем при р?0,05; ? - эффективность, по сравнению с контролем (в %).
При использовании ИФК-366 в концентрации 10-5М наблюдалось ослабление антиагрегационного эффекта, т.к. процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, не превышал 19% по сравнению с таковым одного АДФ. Более низкая концентрация изучаемого вещества (10-6М) не оказывала ожидаемого эффекта.
Вещество ИФК-472 наиболее активно подавляло склеивание тромбоцитов в концентрации 10-4М (25% от исходных значений). При последующем десятикратном разведении этот процесс практически сохранялся и составил 21%. В концентрации 10-6М действие ИФК-472 прекращалось.
Соединение ИФК-321 инициировало антиагрегационное действие (13% от контроля, при р?0,05) только в концентрации 10-3М.
Остальные изученные вещества (ИФК-309, 393, 367, ЛБК-10, 78, 149, ИБХФ-20, 21, 22 и 24) по отношению к изучаемой функции тромбоцитов были инертны.
Учитывая, что 2 соединения из 13 изученных новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты (ИФК-366 и ИФК-472) были наиболее активны и подавляли АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro в диапазоне концентраций от 10-5 до 10-3М, именно они были отобраны для последующего этапа опытов в условиях живого организма (in vivo).
В постановке данного эксперимента дозы изучаемых веществ рассчитывались с учетом максимально эффективных концентраций, найденных в опытах in vitro, с последующей аппроксимацией на массу тела кроликов; при этом объем крови считался равным 10% от веса животного.
Разовая доза исследуемых веществ варьировала в соответствии с их молекулярной массой и вводилась перорально.
ИФК-321 ИФК-472 ИФК-366
Рис. 1 Изменение оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами, под влиянием ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366 (в % по отношению к контролю)
Использование вещества ИФК-472 во всех изученных дозах (4, 8 и 16 мг/кг) в течение всего периода наблюдения (240 мин.), не сопровождалось подавлением агрегации тромбоцитов кроликов.
Введение ИФК-366 в дозе 2 мг/кг на всех этапах опыта, не оказывало антиагрегационного эффекта.
Применение ИФК-366 в дозе 4 мг/кг через 90 мин. после перорального введения, снижало процент падения оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами по сравнению с контролем в 2 раза. Еще через 30 мин. опыта эффект незначительно ослабевал и сохранялся на протяжении трех часов наблюдения. Последующий забор крови через 240 мин. после начала эксперимента не выявил каких-либо значимых различий по сравнению с действием одного АДФ (рис. 2).
При увеличении дозы ИФК-366 в 2 раза активность тромбоцитов, индуцированная АДФ, снизилась через час после перорального введения в 1,4 раза, а еще через 30 мин. функция данных форменных элементов крови восстановилась.
Таким образом, можно утверждать, что новое производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет индуцированную агрегацию тромбоцитов как в условиях in vitro, так и in vivo.
Этот факт послужил основанием для продолжения исследований с целью уточнения некоторых механизмов его антиагрегационного действия.
Рис. 2 Влияние ИФК-366 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов кроликов при пероральном введении
Была сделана попытка определить изменение уровня свободного кальция [Ca2 ]i в цитоплазме лимфоцитов доноров под влиянием ИФК-366, учитывая, что данный ион играет ведущую роль в процессах тромбообразования. Лимфоциты были выбраны в качестве объекта исследования не случайно, т.к. вследствие сходных с тромбоцитами механизмов кальциевого обмена они являются более стабильными клетками крови и меньше реагируют на центрифугирование и другие механические воздействия при обработке.
Известно, что повышение внутриклеточного Са2 приводит к активации Са2 -зависимой ФЛА2, отщеплению от мембранных фосфолипидов арахидоновой кислоты и последующему образованию из нее тромбоксана А2, который по принципу положительной обратной связи способствует дальнейшему усилению стимуляции и вовлечению в процесс тромбообразования новых циркулирующих тромбоцитов.
С помощью метода спектрофлуометрии при изучении ИФК-366 на [Ca2 ]i в цитоплазме лимфоцитов доноров было установлено, что данное производное пиридин-3-карбоновой кислоты подавляет его исходный уровень, по-видимому, угнетая активность SOC каналов (store operated Ca2 channels), которое было повышено тапсигаргином (стандартный либератор Са2 ).
Принимая во внимание способность ИФК-366 снижать [Ca2 ]i на примере лимфоцитов, можно высказать предположение, что антиагрегационный эффект изученного вещества реализуется через регуляцию уровня данного катиона.
«Дыхательный взрыв» имеет большое значение при патологии сердечно-сосудистой системы. Образующиеся в результате этого процесса АФК, обладают выраженным реакционным действием и могут изменять активность и структуру многих макромолекул в клетках различных органов и тканей.
Кроме того, избыток данных пероксидных анионов может повышать агрегацию тромбоцитов.
Было доказано, что ИФК-366 в широком диапазоне концентраций угнетает образование АФК, индуцированное различными дозами стандартных агентов - FMLP и РМА в образцах цельной крови не только здоровых доноров, но и больных, страдающих инфарктом миокарда и гипертонической болезнью II ст. (рис. 3). Этот эффект по силе действия не уступает аналогичному у индапамида, как известно, обладающего не только диуретическим эффектом, но и антиоксидантным действием.
Рис. 3 Влияние бактериального трипептида - формил-метионин-лецил-фенилаланина (FLMP), форболового эфира (РМА) и с ИФК-366 на образование АФК в образце цельной крови больного острым инфарктом миокарда
FMLP - 3МКМ, РМА - 1МКМ, ИФК-366 - 50 МКМ
По оси абсцисс - время в мин. (10, 20 и 30 мин.)
По оси ординат - количества имп. в мин.
Повышенная активность указанного вещества (антиагрегационный эффект, угнетение образования активных форм кислорода нейтрофилами человека) может быть объяснена высокой степенью стерического (конформационного) соответствия данного рецепторного аппарата и ИФК-366 и, как следствие, эффективным биологическим ответом.
При определении острой токсичности было установлено, что LD50 ИФК-366 составляет 3334 мг/кг, что позволяет отнести его по классификации Hodge и Sterner к IV классу, т.е. к группе относительно безвредных веществ (И.В. Саноцкий, 1997).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой антиагрегационной эффективности ИФК-366 и диктуют необходимость изучения хронической токсичности ИФК-366 с целью получения разрешения на клинические испытания в качестве противотромботического (антиагрегационного) средства.
Выводы
1. При скрининге антиагрегационной активности 13 новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты у 3 ее производных (ИФК-321, ИФК-472 и ИФК-366) выявлено ослабление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в условиях in vitro.
2. При пероральном введении кроликам, лишь гидрохлорид диэтилового эфира N-(5-L-гидроксипиридин-3-карбоноил)-L-глутаминовой кислоты (ИФК-366) ингибировал агрегацию тромбоцитов.
3. Гидрохлорид диэтилового эфира N-(5-L-гидроксипиридин-3-карбоноил)-L-глутаминовой кислоты угнетает транспорт Са2 через кальциевые каналы плазматических мембран лимфоцитов доноров и снижает [Ca2 ]i в данных форменных элементах крови.
4. Гидрохлорид диэтилового эфира N-(5-L-гидроксипиридин-3-карбоноил)-L-глутаминовой кислоты подавляет образование активных форм кислорода в образцах цельной крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (инфаркт миокарда, гипертоническая болезнь ІІСТ.), не уступая индопамиду.
5. Потенциальный антиагрегант - гидрохлорид диэтилового эфира N-(5-L-гидроксипиридин-3-карбоноил)-L-глутаминовой кислоты относится к группе относительно безвредных соединений (LD50 - 3334 мг/кг).
Практические рекомендации
Результаты исследований позволили дать рекомендации химикам для продолжения синтеза химических соединений среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты с заданной биологической активностью в целях дальнейшего поиска перспективных противотромботических лекарственных препаратов.
Полученные результаты являются основной частью пакета документов для получения в МЗ и СР РФ разрешения на клинические исследования гидрохлорида диэтилового эфира N-(5-L-гидроксипиридин-3-карбоноил)-L-глутаминовой кислоты (ИФК - 366) для последующего внедрения его в медицинскую практику, как эффективного антиагрегационного средства.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Григорьев Г.К., Муляр А.Г., Гасанов М.Т., Изюмов Е.Г./ Влияние нового производного пиридин-3-карбоновой кислоты на образование активных радикалов кислорода фагоцитами крови здоровых и больных людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и изменение уровня внутриклеточного кальция в цитоплазме лимфоцитов человека// Материалы научно-практической конференции «Общество. Здоровье. Лекарство». Саранск. 2005. С. 42.
2. Муляр А.Г., Гасанов М.Т., Григорьев Г.К., Кириллова А.В./ Сравнительная оценка антиагрегационной активности новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы научно-практической конференции «Общество. Здоровье. Лекарство». Саранск. 2005. С. 76-77.
3. Григорьев Г.К., Гасанов М.Т./ Изучение влияния новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты на тромбоцитарный гемостаз// Материалы конференции «Молодежная наука и современность». Курск. 2006. С. 67.
4. Муляр А.Г., Григорьев Г.К., Гасанов М.Т., Авфукова Ю.С./ Поиск новых антиагрегантов среди производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Сборник материалов XIII национального конгресса «Человек и Лекарство». Москва. 2006. С. 561.
5. Муляр А.Г., Григорьев Г.К., Гасанов М.Т., Кириллова А.В./ Пути лекарственной профилактики и лечения тромбозов с помощью новых производных пиридин-3-карбоновой кислоты// Нижегородский медицинский журнал. Нижний Новгород. 2006. №7. С. 115-117.
6. Гасанов М.Т., Муляр А.Г., Григорьев Г.К., Кириллова А.В., Останин А.А./ Новые производные пиридин-3-карбоновой кислоты, как источник получения новых противотромботических средств// Сборник материалов XIV национального конгресса «Человек и Лекарство». Москва. 2007. С. 811.
7. Останин А.А., Муляр А.Г., Гасанов М.Т., Григорьев Г.К./ Экспериментальное исследование противотромботической активности новых дериватов пиридин-3-карбоновой кислоты// Материалы 9-го Всероссийского научно-образовательного форума «Кардиология 2007». Москва. 2007. С. 222-223.
Размещено на .ru
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
