ПЛР-аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму людини в судовій медицині - Автореферат

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИАвтореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук Роботу виконано на кафедрі судової медицини з післядипломною підготовкою Одеського державного медичного університету і в Центрі судовомедичної молекулярно-генетичної експертизи Одеського обласного бюро судовомедичної експертизи Управління охорони здоровя Одеської обласної державної адміністрації Науковий консультант:доктор біологічних наук, професор, академік УААН Сиволап Юрій Михайлович, Південний біотехнологічний центр УААН і МОН України, директор. Тараса Шевченка, професор кафедри криміналістики доктор медичних наук, професор Мішалов Володимир Демянович Дніпропетровська Державна медична академія, завідувач кафедри судової медицини гіперверіабельний локус праймер полімеразний доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Малюта Станіслав Станіславович, Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ, заступник директора Захист дисертації відбудеться “26_” вересня 2003 р. о 12_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.613.03 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім.Піонером використання аналізу поліморфізму ДНК у судовій медицині вважається англійський учений Алекс Джеффріс, який перший у світі розвязав проблему визначення спірного батьківства за допомогою аналізу “сателітної” ДНК. Розробка теоретичних аспектів і технології використання ДНК-ового аналізу методом полімеразної ланцюгової реакції в умовах популяції, що мешкає на Україні, є актуальною проблемою судової медицини. Тому значну частину експериментального розділу дисертаційної роботи займають дані з вдосконалення методів виділення ДНК із різних обєктів біологічного походження, добору локусів, визначення частоти зустрічальності алелів у популяції та ін. Це дослідження є складовою частиною наукової теми Одеського державного медичного університету “Розробка методів діагностики та оцінки ефективності фармакотерапії специфічних та неспецифічних інфекційно-запальних захворювань на основі молекулярно-генетичних і біофізичних технологій” (№ держреєстрації 0199U000262), що входить до Науково-технічної програми 01.01. Завданням роботи є визначення умов добору і збереження біологічного матеріалу для ДНК-аналізу, визначення гіперваріабельних локусів людини, що дозволяють проводити диференціацію й ідентифікацію осіб, добір праймерів, що визначають алельний стан аналізованих локусів, оптимізація ПЛР згідно зі складом праймерів, встановлення алельного розподілу локусів геному людини в українській популяції, впровадження сучасних методів візуалізації профілів ДНК.Для ампліфікації ДНК використовували: 1 - тест-системи "Promega" (США), що містять 10 ? буфер, до складу якого входить: розчин DNTPS, 10 ? розчин праймерів, ДНК-полімераза Taq, деіонізована вода, розчин контрольної ДНК; 2 - тест-системи “ТАПОТИЛИ” (Росія), що містять 10 ? буфер, 10 ? розчин праймерів, 10 ? розчин DNTPS, ДНК-полімеразу Taq, деіонізовану воду, розчин контрольної ДНК; 3 - тест-системи, зроблені в Центрі судово-медичних молекулярно-генетичних експертиз (Україна), які містили: 10 ? буфер, до складу якого входили 670 m трис-HCL PH 8,8; 166 m (NH4)2SO4; 0,1%-й твін 20; 1-4 MM MGCL2 і 5MM розчин DNTPS, 10 ? розчин праймерів, ДНК-полімераза Taq, стерильна деіонізована вода. При розрахунках ймовірності випадкового збігу генотипів і ймовірності підтвердження батьківства/материнства використовували дані частот алелів для європеоїдів, застосовуючи при цьому методи популяційної генетики. Розрахунок ймовірності випадкового збігу генотипів (Р) за кожним дослідженим локусом проводили згідно з формулою: Р = ра(2-pa) у випадку, якщо профіль ДНК містив алелі а й а, і за формулою: Р = pa(2-pa) pb(2-pb) - 2papb у випадку, якщо профіль ДНК містив алелі а і b. Очікувану гетерозиготність Hobs, гетерозиготність, що спостерігається (фактичну) Hexp, ймовірність випадкового збігу генотипів двох неспоріднених індивідуумів РМ (probability of random match), ймовірність розрізнення генотипів двох неспоріднених індивідуумів PD (power of discrimination), теоретичну мінімальну частоту зустрічальності алеля min xobs, мінімальну частоту зустрічальності алеля, що спостерігається, min xexp, розраховували за такими формулами: Hexp = (1 - Sxi2) x n/(n-1); Для кавказоїдів Німеччини у вибірці з 110 індивідуумів і США у вибірці з 40 індивідуумів виявлено шість алелів, у вибірці з російської популяції виявлено 7 алелів довжиною від 197 до 199 п. н.Відпрацьовано та удосконалено методи виділення ДНК з експертних зразків і запропоновано підходи оптимізації підготовки матеріалу, які дозволяють проводити типування ДНК за ПЛР-аналізом. Проведено аналіз алельного поліморфізму мінісателітних і мікросателітних локусів у вибірці змішаної популяції України та визначено параметри інформативності досліджених локусів щодо їх обгрунтованого практичного використання в судовомедичній практиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ