Патогенез нарушений гемостаза и роль эритропоэтина в их коррекции при хронической почечной недостаточности (клинико-экспериментальное исследование) - Автореферат
Оценка, значение экспрессии тромбоцитарных рецепторов и тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий. Показатели агрегации тромбоцитов у больных хронической почечной недостаточностью. Влияние эритропоэтина на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro.
При низкой оригинальности работы "Патогенез нарушений гемостаза и роль эритропоэтина в их коррекции при хронической почечной недостаточности (клинико-экспериментальное исследование)", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Количество больных с синдромом хронической почечной недостаточности (ХПН) ежегодно увеличивается в связи с ростом заболеваемости нефропатиями различной природы, артериальной гипертензией, сахарным диабетом, атеросклерозом, учащением сосудистых поражений почек, общим старением населения, а также значительным прогрессом в области заместительной почечной терапии, увеличением ее доступности и расширением объемов (Тареева И.Е., 2000; Шейман Д.А., 2002; Бикбов Б.Т., Томилина Н.А., 2009). Значимость исследований гемостаза при ХПН подчеркивает тот факт, что факторы системы гемостаза одновременно являются компонентами других регуляторных систем организма или вмешиваются в их функционирование, что позволяет рассматривать гемостаз как мультипотентую систему регуляции гомеостаза, несущую значительную часть аллостатической нагрузки при патологии, в том числе при ХПН (Costa E. et al., 2008; MCEWEN B.S . et al., 2010, 2011). Исследовать с учетом индивидуальной реактивности выраженность нарушений гемостаза, количество, функциональную активность тромбоцитов и эндотелиоцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе. Оценить роль процессов свободно-радикального окисления, нитроксидергических процессов, азотемии, экспрессии рецепторов тромбоцитов и тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови в патогенезе нарушений гемостаза у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе. Впервые приведены данные о роли в патогенезе тромбоцитопатии у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, процессов свободно-радикального окисления в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, выраженности азотемии, изменений тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови и экспрессии тромбоцитарных рецепторов GPIB, GPIIB-IIIA.
Список литературы
По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2010); II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых ЧЕЛГМА (Челябинск, 2011); V Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011); 8-ой международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (от ангиогенеза до центрального кровообращения) (Ярославль, 2011); научно-практической конференции «Хроническая болезнь почек - этапы заместительной почечной терапии» (Челябинск, 2011); третьей международной телеконференции (Томск, 2011).
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в преподавание патофизиологии в разделе «Патофизиология гемостаза» в ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Методы исследования тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови внедрены в научную работу кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в практику отделений диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница», ГУЗ «Свердловская областная клиническая больница №1».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 246 страницах, содержит 60 таблиц и 44 рисунка; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 374 источника (73- отечественных и 301 - зарубежных авторов).
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследования
Дизайн клинического фрагмента работы представлен на схеме (рис. 1).
Проведено краткосрочное, открытое, проспективное клиническое исследование гемостазиологических эффектов ЭПО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе. План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) последнего пересмотра (Сеул, 2008), с учетом разъясняющего примечания к параграфу 29, внесенного Генеральной Ассамблеей ВМА (Вашингтон, 2002) и был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (протокол №4 от 19.03.2010 г.). В исследование было включено 160 больных с ХПН, находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница». От всех больных было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Рис 1. Этапы клинического фрагмента работы
Отбор больных для исследования проводили в соответствии с критериями включения и исключения. Критерий включения: больные с терминальной стадией хронической почечной недостаточности. Критерии исключения: 1) декомпенсация со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем; 2) наличие в анамнезе туберкулеза, венерических заболеваний, гепатита, ВИЧ-инфекции, онкологических заболеваний; 3) острые нарушения церебрального кровообращения; 4) острый воспалительный процесс; 5) беременность; 6) уровень гемоглобина ниже 60 г/л; 7) больные с гематологическими заболеваниями и системными васкулитами.
В соответствии с целями и задачами исследования 62 больных ХПН, в т.ч. 32 женщины и 30 мужчин (средний возраст 47,96±1,33 лет) были распределены на 4 основные группы (группы II-V). Основными причинами ХПН явились хронический гломерулонефрит (42 %), хронический пиелонефрит (26 %), поликистоз почек (19 %), артериальная гипертензия (6,5 %), сахарный диабет (6,5%). Стаж заболевания составил от 1 года до 13 лет (в среднем 5,1±1,6 лет). Все больные ХПН 3 раза в неделю в течение 4 часов получали гемодиализную терапию в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница» на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия). Диализаторы «Elisio 190H» (Nipro, Япония), коэффициент ультрафильтрации 76 мл/час • мм.рт.ст., клиренс: мочевины 199 мл/мин, креатинина 197 мл/мин. Количество сеансов диализа у обследуемых больных - от 105 до 1356 (в среднем 404,6±45,3). Величина диализной дозы Kt/V - от 0,9 мл/мин до 1,45 мл/мин (в среднем 1,24±0,01 мл/мин). Кровь для исследований брали из артериального колена артерио-венозной фистулы до и после сеанса гемодиализа.
Больные IV и V групп дополнительно получали эритропоэтин в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000-4000 МЕ в течение 2 месяцев. Суммарная доза введенного ЭПО составила около 50000 МЕ. Контрольная группа (группа I, n=25) представлена клинически здоровыми добровольцами - донорами областной станции переливания крови г. Челябинска, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами.
Экспериментальный фрагмент работы выполнен на 123 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., цельной крови 126 клинически здоровых добровольцев и цельной крови 24 больных ХПН, не принимающих ЭПО.
Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.).
Модель хронической почечной недостаточности у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани (Шуркалин Б.К. и др., 2010; Santos L.S. et al., 2006). Терминальная стадия ХПН развивалась через 21 сутки, критериями развития ХПН служили значимое повышение в сыворотке концентрации креатинина (> 60 мкмоль/л), мочевины (> 5 ммоль/л). Для исследования гемостазиологических эффектов ЭПО вводили в форме препарата «Рекормон» внутрибрюшинно, начиная с 21 суток, ежедневно в дозе 100 МЕ/кг массы в течение 9 дней, суммарная доза 900 МЕ/кг. Контрольной группе ложнооперированных животных вводили эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 30 сутки.
Модель острой почечной недостаточности создавали подкожным введением в межлопаточную область водного 10 % (масса/объем) раствора хлорида ртути (II) в дозе 5 мг/кг однократно (Черненко Г.П., 1965; Gstraunthaler G. et al., 1983). Для исследования гемостазиологических эффектов ЭПО вводили в форме препарата «Рекормон» на 5 сутки от индукции ОПН однократно внутрибрюшинно в дозе 5000 МЕ/кг массы (Johnson, D.W. et al., 2006). Исследования проводили на 6 сутки.
Применение ЭПО в условиях интактного организма проводили для выяснения независимости от наличия патологии почек гемостазиологических эффектов ЭПО. ЭПО в форме препарата «Рекормон» вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 5000 МЕ/кг массы. Исследования проводили на 2 сутки.
Эксперименты в условиях in vitro: 1) оценка влияния креатинина и мочевины на агрегацию тромбоцитов клинически здоровых людей. Использованы концентрации мочевины 30 ммоль/л, креатинина - 1 ммоль/л.
2) оценка гемостазиологических эффектов ЭПО в цельной крови клинически здоровых людей. ЭПО в форме препарата «Рекормон» применяли в концентрациях 30 МЕ/л; 15 МЕ/л; 7,5 МЕ/л; 3,75 МЕ/л; 1,88 МЕ/л. После добавления ЭПО кровь инкубировали в условиях термостата при температуре 37°С в течение 30 мин. Оценивали показатели коагуляционого и клеточного звеньев гемостаза.
3) оценка влияния ЭПО в указанных выше концентрациях на показатели клеточного гемостаза в цельной крови больных ХПН, не принимающих ЭПО.
Для клинической оценки состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН до и после процедуры гемодиализа использовали манжеточную пробу Румпеля - Лееде - Кончаловского и измерение времени кровотечения по Дьюку (Баркаган З.С. и др., 2001).
Гематологические методы. На гематологическом анализаторе фирмы «Orphee» (Япония) волюмометрическим методом определяли основные количественные и морфологические показатели клеток крови. Тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия исследовали в суспензии эритроцитов и тромбоцитов, количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов подсчитывали в камере Горяева (Осиков М.В., 2005).
Гемостазиологические методы. Клеточное звено гемостаза оценивали по количественным показателям тромбоцитов, АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе «LA-230» (Россия). Регистрировали амплитуду (%), время (мин) и скорость агрегации (%/мин). Сосудистое звено гемостаза оценивали при исследовании концентрации конечных стабильных метаболитов NO (NOX) в сыворотке и активности фактора фон Виллебранда (VWF) в плазме. Уровень NOX оценивали с помощью реакции Griess (Емченко Н.Л. и др., 1994), результат выражали в мкмоль/л. Для определения активности VWF использована его способность вызывать агглютинацию тромбоцитов в присутствии ристоцетина (НПО «Ренам», Москва), результат выражали в %. Коагуляционное звено гемостаза исследовали по показателям тромбинового времени по Biggs R., Macfarlane R.G., активированного парциального тромбопластинового времени (Баркаган З.С. и др., 2001), протромбинового времени, концентрации в плазме фибриногена по Клаусу, активности антитромбина, ХІІА-зависимого фибринолиза (Архипов А.Г. и др., 1985). Использованы наборы реагентов фирмы «Технология-Стандарт» (Барнаул).
Биохимические методы. Определение веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНИСММ) в плазме проводили после осаждения высокомолекулярных белков фотометрией на спектрофотометре «СС - 104» (Россия) при длине волны 210 нм (Камышников В.С., 2000). Результат выражали г/л. Концентрацию мочевины, мочевой кислоты и креатинина в сыворотке определяли энзиматическим колориметрическим методом и кинетическим методом без депротеинизации на аппарате «Roki-6T» (Россия, Санкт-Петербург) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия). Уровень продуктов ПОЛ в плазме и обогащенной тромбоцитами плазме определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А. и др., 1989, 2000; Львовская Е.И. и др., 1991). Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) - Е232/Е220 (относительное содержание диеновых коньюгатов - ДК), Е278/Е220 (уровень кетодиенов и сопряженных триенов - КД и СТ) и Е400/Е220 (уровень оснований Шиффа - ШО). О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) (С. Чевари и др., 1985) и каталазы сыворотки крови (Коралюк М.А. и др., 1988).
Оценка экспрессии тромбоцитарных рецепторов и тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий выполнялась методом проточной цитометрии на цитофлюориметре «FACS Canto-II» (Becton Dickinson, США). Для оценки экспрессии на поверхности тромбоцитов рецепторов Gp IIB/IIIA, Gp IIB, Gp Ib-Ix использованы соответственно моноклональные антитела CD61 -FIT («Beckman Coulte», США), CD41 -FITC («Beckman Coulte», США), CD42b - РЕ («Becton Dickinson Pharmingen», США), результат выражали в условных единицах флюоресценции (у.е.ф.) среднепикового значения. Из цельной крови выделяли популяции лейкоцитов по интенсивности экспрессии CD45-PERCP («Beckman Coulte», США) и характеристикам светорассеяния клеток. Оценка тромбоцитарно-лейкоцитарных коопераций осуществлялась по относительному количеству лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, взаимодействующих с тромбоцитами.
Статистические методы. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0» (Реброва О.Ю., 2006). Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий - критерий Левена. Проверку статистических гипотез проводили с использованием параметрических (парный критерий Стьюдента) и непараметрических (U - критерий Манна-Уитни, WW - критерий Вальда-Вольфовитца, W -критерий Вилкоксона) критериев. При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони. Для выявления связи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Силу влияния факторов на исследуемые показатели вычисляли методами дисперсионного анализа. Отличия считали статистически значимыми при р?0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу. До процедуры гемодиализа время кровотечения удлиняется в среднем на 60%, количество петехий в манжеточной пробе Румпеля-Лееде-Кончаловского увеличивается в среднем в 6 раз (табл. 1). Процедура гемодиализа приводит к удлинению времени кровотечения и увеличению количество петехий. Установлено, что патогенез геморрагического синдрома у больных ХПН связан с развитием тромбоцитопении, тромбоцитопатии и эндотелиальной дисфункции. У больных ХПН при исследовании до и после гемодиализа в крови снижается количество тромбоцитов и уменьшается их средний объем (табл. 2).
Развитие тромбоцитопатии у больных ХПН презентируется угнетением АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, усугубляемой после процедуры гемодиализа (табл. 3). Доказано, что время кровотечения удлиняется, а количество петехий в манжеточной пробе возрастает по мере снижения количества тромбоцитов (соответственно R=?0,65; R=?0,63; р<0,05), и замедления агрегации тромбоцитов (соответственно R=?0,67; R=?0,64; р<0,05).
У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается эндотелиальная дисфункция, констатируемая активацией нитроксидергических процессов и повышением уровня VWF в крови. При оценке уровня NOX в сыворотке до гемодиализа наблюдается преимущественный прирост нитритов по сравнению с нитратами (табл. 4). После процедуры гемодиализа концентрация NOX в сыворотке снижается до нормы. При анализе индивидуальной реактивности отмечена гетерогенность содержания метаболитов NO в сыворотке у больных ХПН, выраженность которой возрастает после диализа. Активность VWF в крови значимо нарастает по мере увеличения концентрации NOX (R=0,84; р<0,05). Полагают, что пероксинитрит (ONOO•), образующийся в условиях оксидативного стресса при ХПН, напрямую повышает синтез и экспрессию VWF в эндотелиоцитах (Malyszko J. et al., 2004). Угнетение агрегации тромбоцитов у больных ХПН нарастает по мере повышения концентрации NOX (R=?0,76; р<0,05).
У больных ХПН развивается окислительный стресс в плазме и в тромбоцитах. До процедуры гемодиализа регистрируется повышенный уровень продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы (табл. 5), снижается активность каталазы и СОД (табл. 7). У больных ХПН до процедуры гемодиализа в гептановой фракции липидного экстракта обогащенной тромбоцитами плазмы возрастает содержание первичных, вторичных, конечных продуктов ПОЛ, в изопропанольной фракции - первичных и вторичных продуктов ПОЛ (табл. 6). Процедура гемодиализа приводит к элиминации из тромбоцитов первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракции липидного экстракта. Установлено, что дисфункция тромбоцитов при ХПН нарастает по мере увеличения содержания продуктов ПОЛ в плазме и в тромбоцитах и снижения активности ферментов антиокислительной защиты в плазме.
У больных ХПН в плазме зафиксирован значительный прирост содержания ВНИСММ, креатинина и мочевины, частично корригируемый процедурой гемодиализа (табл. 8). Угнетение агрегационной способности тромбоцитов у больных ХПН нарастает по мере увеличения уровня в плазме ВНИСММ (R=?0,90; р0,05) и креатинина (R=?0,39; р>0,05). В аналитических экспериментах in vitro креатинин и мочевина в концентрациях, сопоставимых с таковыми в крови у больных ХПН, не изменяют показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Исследование экспрессии наиболее значимых тромбоцитарных рецепторов у больных ХПН не подтвердило ожидаемую связь с изменением функции тромбоцитов. До процедуры гемодиализа у больных ХПН повышается представительство на тромбоцитах Gp IIB-IIIA на 35%, Gp IIB - на 43%, Gp Ib - на 52% (табл. 10). Количество клеток, экспрессирующих Gp Ib, значимо не изменяется, что свидетельствует об увеличении плотности рецепторов. После гемодиализа экспрессия Gp IIB-IIIA и Gp Ib возвращается к нормальному уровню. Уремические тромбоциты имеют дефекты цитоскелета, ассоциированные с молекулами актина, альфа-актинина и миозина, что препятствует нормальной интернализации гликопротеинов внутрь тромбоцита и приводит к их накоплению на поверхности (Diaz-Ricart М. et al., 2000).
Установлено, что уремические тромбоциты усиленно взаимодействуют с нейтрофилами (прирост 31%) и моноцитами (прирост 84%), связь тромбоцитов с лимфоцитами ослабевает (табл. 11). После гемодиализа количество тромбоцитарно-нейтрофильных коагрегатов снижается до нормального уровня, а тромбоцитарно-моноцитарных и тромбоцитарно-лимфоцитарных - значимо не изменяется. Установлено, что, количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов до гемодиализа нарастает по мере увеличения экспрессии на тромбоцитах Gp IIB-IIIA (соответственно R=0,75; R=0,47; р<0,05), после гемодиализа такая зависимость сохраняется только в отношении тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов (R=0,48; р<0,05). Дисфункция тромбоцитов у больных ХПН в определенной мере связана с изменением тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий в крови. Скорость агрегации тромбоцитов угнетается по мере увеличения тромбоцитарно-нейтрофильных (R =?0,33; р<0,05) и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (R =?0,41; р<0,05) в крови. Взаимодействие тромбоцитов с эритроцитами до процедуры гемодиализа ослабевает, а после гемодиализа восстанавливается до нормального уровня (табл. 11).
Установлено, что анемия у больных ХПН вносит определенный вклад в развитие геморрагического синдрома, тромбоцитопатии и угнетение тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий. Время кровотечения и количество петехий в манжеточной пробе, а также угнетение агрегации тромбоцитов нарастают по мере снижения количества эритроцитов, гемоглобина и гематокрита. Количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов уменьшается по мере снижения количества эритроцитов в крови у больных ХПН (R=0,65; р<0,05).
При экспериментальной ХПН наблюдается активация системы фибринообразования с заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего путей по показателям тромбинового, протромбинового и активированного парциального тромбопластинового времени (табл. 12). Зафиксированная гиперфибриногенемия, вероятно, развивается в ходе ответа острой фазы, так как фибриноген относится к положительным реактантам острой фазы (Назаров П.Г., 2001). Активность системы фибринолиза не изменяется, а антитромбина - уменьшается, что может свидетельствовать об истощении противосвертывающей системы. При кратковременной уремии (модель ОПН), как и при ХПН, фиксируется активация коагуляционного каскада, повышается активность антитромбина и ускоряется фибринолиз (табл. 13).
Применение ЭПО у больных ХПН приводит к снижению выраженности геморрагического синдрома: время кровотечения укорачивается, количество петехий уменьшается (табл. 1). Данный факт связан с увеличением количества эритроцитов (соответственно R=?0,50; R=?0,49; р<0,05), гемоглобина (соответственно R=?0,73; R=?0,51; р<0,05) и гематокрита (соответственно R=?0,76; R=?0,60; р<0,05). Однако, укорочение времени кровотечения у больных ХПН наблюдается менее чем через две недели после начала терапии ЭПО, когда уровень гемоглобина и гематокрита еще существенно не изменяются, что свидетельствует о прямых гемостазиологических эффектах ЭПО при ХПН.
Таблица 1
Клинические тесты оценки гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=16) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Проба Румпеля-Лееде-Кончаловского, петехий 1,69±0,35 10,46±1,54* 14,50±2,89*# 5,90 ±0,78*# 7,50 ±0,87*& Время кровотечения, сек 85,05±4,11 132,60±6,55* 141,11±7,86*# 121,18±5,48*# 126,00±5,89*& Примечание. Здесь и далее * - значимые различия (р<0.05) с группой 1, # - с группой 2, & - с группой 3, ^ - с группой 4.
ЭПО у больных ХПН увеличивает количество тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов (табл. 2). После гемодиализа снижается количество тромбоцитов и уменьшается их средний объем, что является следствием механизма негативной селекции тромбоцитов в ходе процедуры гемодиализа. Механизм действия ЭПО может быть связан со стимуляцией мегакарио- и/или тромбоцитопоэза, принимая во внимание общие предшественники эритроцитов и тромбоцитов, на которые ЭПО оказывает пролиферативное и антиапоптическое влияние.
ЭПО у больных ХПН восстановливает скорость агрегации тромбоцитов (табл. 3). Сразу после гемодиализа скорость агрегации тромбоцитов вновь падает, вероятно, за счет избыточной активации и удаления функционально полноценных молодых форм тромбоцитов. Полагаем, что ЭПО напрямую, через связывание с рецепторами вмешивается в реализацию активности тромбоцитов, о чем свидетельствуют данные в экспериментах in vitro, где ЭПО дозо-зависимо (R=?0,44; р<0,05) ускоряет агрегацию интактных и от больных ХПН тромбоцитов в диапазоне доз от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л (рис. 2). Причем, наибольшей стимулирующей активностью обладают малые дозы ЭПО, а в максимальной дозе 30 МЕ/л ЭПО вообще не оказывает влияния на тромбоциты больных ХПН.
Количественный состав и морфологические признаки тромбоцитов периферической крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Тромбоциты, • 109/ л 328,85±8,26 178,92±5,46* 163,82±7,08* 253,79±7,58*# 239,94 ±8,37*&^
Ширина распределения по объему 14,54±0,14 13,30 ±0,19* 13,35 ±0,30* 13,34 ±0,16* 12,34 ±0,16*&^
Таблица 3
Показатели агрегации тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Время агрегации, мин 4,85±0,13 3,91±0,24* 3,79±0,17* 3,44±0,15*# 3,38±0,19*
Скорость агрегации, %/мин 18,24±0,69 8,44±0,55* 5,62±1,26*# 17,70±0,99# 5,25±0,35*^
Рис. 2. Влияние эритропоэтина на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro.
* - значимые (р<0,05) различия с группой контроля при исследовании тромбоцитов больных ХПН, # - интактных тромбоцитов.
Эндотелиотропные эффекты ЭПО у больных ХПН проявляются снижением продукции NO и VWF, вероятно, за счет прямого вмешательства в метаболизм эндотелиоцитов, т.к. на их поверхности обнаружены специфические рецепторы, инициирующие активацию внутриклеточных сигнальных путей с последующей регуляцией активности ферментов, в т.ч. ENOS (Teng R et al., 2011). Концентрация NOX в сыворотке снижается за счет нитратов, процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на выраженность нитроксидергических процессов (табл. 4). Активность VWF под влиянием ЭПО снижается, но остается выше, чем в группе здоровых людей. Данные эффекты ЭПО находят свое отражение в восстановлении функциональной активности тромбоцитов при ХПН: увеличение скорости агрегации тромбоцитов под влиянием ЭПО нарастает по мере снижения NOX (R=?0,82; р<0,05).
Содержание стабильных метаболитов оксида азота (II) в сыворотке и активность фактора Виллебранда в плазме у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Влияние ЭПО на функциональную активность тромбоцитов и эндотелиоцитов в определенной мере опосредовано изменением процессов СРО и выраженности азотемии. ЭПО при ХПН проявляет ПОЛ-ограничивающий эффект в плазме и в тромбоцитах. В гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы, а также обогащенной тромбоцитами плазмы снижается содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ (табл. 5, 6).
Таблица 5
Содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели, ед. индексов окисления Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
КД и СТ [и] 0,30±0,01 0,35±0,03* 0,39±0,07* 0,27±0,01 # 0,37±0,05
ШО [и] 0,06±0,01 0,04±0,01* 0,06±0,01* 0,02±0,01*# 0,02±0,01*& Примечание. Здесь и в табл. 7 «г» - гептановая фракция, «и» - изопропанольная фракция.
Таблица 6
Содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта обогащенной тромбоцитами плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели, ед. индексов окисления Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
В плазме больных ХПН повышается активность ферментов антиокислительной защиты СОД и каталазы (табл. 7). Эффект ЭПО наиболее выражен до процедуры гемодиализа, вероятно, прооксидантный потенциал плазмы возрастает в ходе гемодиализа при контакте фагоцитов и тромбоцитов с мембраной диализатора и элементами экстракорпорального контура. Полагают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации антиоксидантного транскрипционного ядерного фактора-2 и как следствие изменения активности НАД(Ф)Н-оксидоредуктазы, глутатион-S-трансферазы ?-1, глютатионпероксидазы, гемоксигеназы-1, а также снижения внутриклеточного содержания железа (II) (Jin W. et al.,2011, Zhang J. et al., 2010).
Активность ферментов антиокислительной системы плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=26) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Каталаза, мкат/л 17,88±0,72 6,52±0,47* 9,79±2,49* 13,58±2,00*# 12,51±2,18*& Дезинтоксикационный эффект ЭПО при ХПН проявляется снижением концентрации в плазме ВНИСММ, креатинина и мочевины (табл. 8). При этом, эфферентные свойства ЭПО оказались наиболее выраженными в отношении мочевины и креатинина, их концентрация после процедуры гемодиализа еще больше снижалась, но не достигала значений контрольной группы здоровых людей. Дезинтоксикационный эффект ЭПО проявляется при экспериментальной ХПН у крыс (табл. 9). Корреляционный анализ продемонстрировал значимую зависимость ПОЛ-ограничивающего эффекта ЭПО при ХПН от выраженности азотемии и гемической гипоксии. По мере снижения концентрации мочевины, креатинина и ВНИСММ в плазме снижается содержание вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции плазмы, а также нарастает активность каталазы и СОД в плазме. В тоже время, по мере увеличения количества эритроцитов в периферической крови в изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы снижается содержание вторичных и конечных продуктов ПОЛ, уменьшается концентрация мочевины, креатинина и ВНИСММ в плазме.
Влияние эритропоэтина на показатели эндогенной интоксикации в крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Примечание. Здесь и в табл. 12, 13 * - значимые различия (р<0.05) с группой 1, # - с группой 2.
ЭПО у больных ХПН снижает представительство рецептора Ib и комплекса IIB-IIIA, причем, последнего до уровня, наблюдаемого у здоровых людей и, вероятно, за счет субъединицы IIIA, т.к. экспрессия субъединицы IIB значимо не изменяется (табл. 10). Установлено, что представительство Gp IIB-IIIA и Gp Ib на тромбоцитах уменьшается по мере снижения продуктов ПОЛ в плазме и в тромбоцитах, увеличения активности каталазы и СОД, а также снижения в плазме концентрации ВНИСММ, креатинина и мочевины.
Влияние эритропоэтина на экспрессию рецепторов тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
Gp IIB-IIIA, у.е.ф. 1,66±0,04 2,25±0,18* 1,93±0,15 1,63±0,04* 1,77±0,07
Gp IIB, у.е.ф. 1,99±0,04 2,84±0,16* 2,70±0,14* 2,40±0,06* 2,65±0,10*
Gp Ib, у.е.ф. 560,40±39,34 850,09±79,41* 728,36±76,74 650,29±27,93*# 529,54±26,84&^
Gp Ib,% кл. 74,86±3,68 73,66±4,44 61,92±4,92* 85,56±1,89*# 60,89±3,84^
ЭПО уменьшает количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов в связи со снижением представительства Gp IIB-IIIA на тромбоцитах, увеличивает количество тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов до нормы (табл. 11). Полагаем, что восстановление тромбоцитарно-лимфоцитарной кооперации обусловлено антиапоптогенными свойствами ЭПО в отношении лимфоцитов. Известно, что процедура гемодиализа инициирует апоптоз лимфоцитов, а лимфоциты экспрессируют рецепторы ЭПО и опухольнекротизирующего фактора, через которые ЭПО активирует антиапоптические сигнальн, включая NF-KB, JANUS-2/STAT, гены bcl-XL (Lisowska K. et al., 2010, 2011; Borges A. et al., 2011). ЭПО у больных ХПН приводит к восстановлению количества эритроцитарно-тромбоцитарных коагрегатов за счет малых форм розеток. Эффект ЭПО, в том числе, обусловлен увеличением количества эритроцитов в кровотоке (R=0,27; р<0,05), а возможно, и антиоксидантным эффектом и как следствие стабилизацией цитоплазматической мембраны, маркируемой экстернализацией фосфатидилсерина (Amer J. et al., 2010). Установлено, что скорость агрегации тромбоцитов возрастает по мере снижения тромбоцитарно-нейтрофильных (коэффициент корреляции Спирмена R = - 0,39; р<0,05) и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (R = - 0,37; р<0,05) в крови.
Таблица 11
Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-клеточные взаимодействия у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (M±m)
Группы / показатели Группа 1: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (n=24) Группа 3: ХПН после диализа (n=24) Группа 4: ХПН ЭПО до диализа (n=38) Группа 5: ХПН ЭПО после диализа (n=38)
ТНА, % клеток 24,58±0,93 32,16±4,05* 26,90±1,58 24,78±0,71# 23,93±0,68
ТМА, % клеток 23,12±0,79 42,59±5,54* 32,40±2,57* 29,75±1,96*# 27,68±1,02*
Применение ЭПО при экспериментальной ХПН частично восстанавливает показатели коагуляционного гемостаза (табл. 12). При экспериментальной ОПН ЭПО полностью восстанавливает показатели внешнего, внутреннего и общего путей активации коагуляционного каскада (табл. 13). Влияние ЭПО на коагуляционные процессы не опосредовано изменением активности антитромбина в крови. На этом фоне снижается активность системы фибринолиза, она становится ниже, чем в контрольной группе. Эффекты ЭПО на показатели активности плазменных протеолитических систем при почечной недостаточности могут быть связаны, во-первых, с прямым нефропротекторным действием этого гликопротеина, т.к. рецепторы ЭПО обнаружены на нефроэпителии (Vesey D.A. et al., 2004, Taoufik E. et al., 2008). Во-вторых, с дезинтоксикационным и антиоксидантным действием. При экспериментальной ХПН установлена обратная значимая корреляция между показателем протромбинового времени и концентрацией креатинина (R=?0,41; р<0,05) и мочевой кислоты в плазме (R=?0,36; р<0,05). Угнетая нитроксидергические и оксидативные процессы при ХПН, ЭПО может оказывать позитивное влияние на эндотелиальную функцию, восстанавливать баланс между про- и антикоагулянтными факторами эндотелиоцитов, предупреждать изменение структуры и функции факторов свертывания и компонентов противосвертывающей и фибринолитической систем.
Гемокоагуляционные эффекты ЭПО проявляются только при патологии и отсутствуют при его введении интактным животным. В тоже время, в экспериментальных условиях in vitro установлено, что эффекты ЭПО на активность плазменных систем фибринообразования и фибринолиза носят самостоятельный прямой дозозависимый характер (рис. 3).
Предполагаемый механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции отражены на интегральной схеме (рис. 4).
Таблица 12
Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при экспериментальной хронической почечной недостаточности (M±m)
Группы животных / Показатели Группа I: Ложноопе-рированные (n=16) Группа II: ХПН (n=12) Группа III: ХПН ЭПО (n=20)
ТВ, с 36,50±0,79 15,70±1,62 * 20,40±3,94*#
АПТВ, с 33,82±4,15 29,77±2,59 * 34,57±2,80#
ПТВ, с 54,64±7,43 24,38±0,78 * 39,41±3,69#
Фибриноген, г/л 1,63±0,07 2,45±0,13 * 2,55±0,09*
Фибринолиз, мин 6,31±0,35 7,05±0,81 6,58±0,55
Активность антитромбина, с 95,31±4,35 72,72±5,36 * 129,08±10,39*#
Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при экспериментальной острой почечной недостаточности (M±m)
Группы животных / Показатели Группа I: Интактные (n=19) Группа II: ОПН (n=18) Группа III: ОПН ЭПО (n=13)
ТВ, с 59,58±9,71 24,55±3,57* 64,32±10,59#
АПТВ, с 32,13±3,98 18,21±1,00* 24,98±2,66#
ПТВ, с 27,48±2,16 22,25±0,10* 29,85±2,45#
Фибриноген, г/л 1,84±0,17 2,83±0,12* 2,81±0,38*
Фибринолиз, мин 11,41±1,07 6,58±0,69* 14,07±2,69*#
Активность антитромбина, с 104,96±8,02 131,09±3,92* 129,08±10,39
Рис. 3. Влияние ЭПО на показатели коагуляционного гемостаза в условиях in vitro.
* - значимые (р<0,05) различия с группой контроля.
Рис. 4. Предполагаемый механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции.
1. У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу, выраженность которого возрастает после процедуры гемодиализа. Патогенез геморрагического синдрома связан с развитием анемии, тромбоцитопении, тромбоцитопатии и эндотелиальной дисфункции.
2. Патогенез тромбоцитопатии у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, включает активацию процессов свободно-радикального окисления в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, азотемию, изменение тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови и экспрессии гликопротеинов Ib-Ix и IIB-IIIA на тромбоцитах.
3. Особенностями индивидуальной реактивности у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, являются неоднородность показателей клинических тестов выраженности геморрагического синдрома, функциональной активности тромбоцитов и нитроксидергических процессов.
4. При экспериментальной ХПН наблюдается активация системы фибринообразования и подавление активности противосвертывающей системы крови. Применение эритропоэтина при экспериментальной ХПН восстанавливает активность плазменных протеолитических систем, участвующих в гемокоагуляции.
5. В экспериментальных условиях in vitro эритропоэтин дозо-зави
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
