Патогенетическое обоснование применения синтетического аналога дерморфина при хронических воспалительных заболеваниях легких, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей (клинико-экспериментальное исследование) - Автореферат

О необходимости такого поиска свидетельствует неуклонно увеличивающееся число детей с дефектами органогенеза респираторной системы, в подавляющем большинстве случаев осложненных хроническим воспалительным процессом с непрерывно-рецидивирующим типом течения [Таточенко В.К., 2001; Середа Е.В., 2002; Спичак Т.В., 2005; Шендерук Т.В., 2007]. Тем не менее, в литературе практически отсутствуют данные об особенностях процессинга и детоксикации свободных радикалов при хронических воспалительных заболеваниях легких (ХВЗЛ), сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей. Исследованию роли свободнорадикальных нарушений в патогенезе ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, у детей, теоретическому и экспериментальному обоснованию возможности применения синтетических аналогов дерморфина при данной патологии - посвящена настоящая работа. Исследовать процессы свободнорадикального окисления в сыворотке крови, мембранах эритроцитов, бронхоальвеолярном лаваже, гранулоцитах цельной крови у детей в различные периоды ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы. В эксперименте in vitro изучить влияние синтетических аналогов дерморфина H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH и H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH на оксидативный метаболизм гранулоцитов у детей в различные периоды ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы.

По материалам диссертационного исследования опубликовано 19 работ, включая 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских и докторских диссертаций.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование осуществлялось в несколько этапов и состояло из экспериментального и клинического блоков.

Характеристика исследуемых веществ: исследовали синтетические аналоги регуляторного пептида - дерморфина. Олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH (условное название «седатин») - смешанный агонист опиоидных периферических ?-/?- и антагонист центральных ?1- рецепторов, содержащий L-аргинин в N-фланговом положении. Для выяснения возможной роли аргинина в реализации эффектов препарата, использовали безаргининовый аналог H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH.

Исследуемые пептиды были синтезированы в лаборатории химии пептидов Кардиологического научного центра РАМН (г. Москва) классическим методами пептидной химии в растворе и твердофазным методом и любезно предоставлены для исследования зав.лаб. профессором Ж.Д. Беспаловой. воспалительный легкое респираторный

Клинический этап. Работа выполнена на базе НИИ Охраны материнства и детства Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН г. Хабаровска (директор - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ В.К. Козлов) в 2004 - 2008 гг. в рамках общеинститутской НИР 012 «Региональные особенности распространенности, клинико-морфологические и иммунологические аспекты неспецифических воспалительных заболеваний легких у детей. Пути оптимизации патогенетического лечения».

Для решения поставленных задач с апреля 2004г. по июнь 2008 г. в условиях педиатрического отделения № I клиники ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМИД было проведено обследование и лечение 111 детей в возрасте от 6 до 17 лет с диагнозом ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в различные периоды заболевания.

Дизайн исследования был одобрен решением заседания Этического комитета ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМИД от 28.11.05 г. (протокол № 4).

Комплексное обследование пациентов проводилось согласно теме НИР О12, по дифференциально-диагностическому алгоритму.

Критерии включения в исследование: возраст 6 - 17 лет; верифицированный дефект органогенеза респираторной системы - установленный диагноз: порок развития легких; бронхитический вариант обострения ХВЗЛ и/или период ремиссии, а также добровольное информированное согласие родителей на участие ребенка в исследовании.

Критерии исключения из исследования: возраст младше 6 лет; не верифицированный диагноз - порок развития легких; обострение ХВЗЛ по пневмоническому типу, отсутствие согласия между врачом и родителями пациента.

Для реализации цели исследования и решения поставленных задач среди контингента обследованных детей было выделено 3 клинические группы: 1-я группа - 54 пациента с ХВЗЛ на фоне порока развития респираторной системы в периоде ремиссии;

2-я группа - 33 пациента с обострением ХВЗЛ по бронхитическому типу на фоне порока развития респираторной системы;

3-я группа - 40 практически здоровых детей

Анализируемые группы были сопоставимы по возрастно-половому составу. В каждой группе пациентов были выделены подгруппы, в зависимости от возраста: I подгруппа - 6-11 лет; II подгруппа - 12-17 лет.

Характеристика клинических и лабораторных методов исследования

Клиническое обследование детей включало сбор анамнеза жизни и заболевания, физикальный осмотр ребенка, стандартные лабораторные исследования. Анализ проводился методом анкетирования по разработанной карте-схеме, включавшей блоки по исследованию генеалогического, акушерского, аллергологического анамнеза, анализ антенатального, перинатального и постнатального периодов, перенесенные заболевания, возраст дебюта бронхолегочной патологии, оценку соматического статуса ребенка.

Сбор анамнеза, осмотр, перкуссия, пальпация, аускультация проводились по общепринятым в клинической практике методикам. Во всех случаях проводился ретроспективный анализ первичной медицинской документации (амбулаторная карта больного ф. №112/у, история болезни стационарного больного ф. № 003/у).

Хемилюминесцентный анализ процессов свободнорадикального окисления

Хемилюминесцентное исследование проводили на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ДВГМУ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С. Тимошин). Материалом для исследования служили сыворотка крови, мембраны эритроцитов, гранулоциты цельной крови, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛЖ) пациентов с ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, в различные периоды заболевания.

Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER» по методикам Ю.А. Владимирова и соавт. (1991), М.П. Шерстнева (1997), А.В. Арутюняна и соавт. (2000), Z. Cheng et. al. (2003).

Определяли: S-sp - светосумму за 1 минуту спонтанной ХМЛ, величина которой прямо коррелирует с интенсивностью генерации АКМ; S-luc - светосумму за 1 минуту люцигенин-зависимого свечения, величина которой прямо коррелирует с образованием супероксид-анион-радикала; S-lum - светосумму за 1 минуту люминол-зависимой ХМЛ, величина которой находится в прямой зависимости от интенсивности продукции гидроксил-радикала; h - амплитуду быстрой вспышки Fe2 -индуцированного свечения, свидетельствующую о концентрации гидроперекисей липидов; Sind-1 - светосумму за 2 минуты Fe2 -индуцированной ХМЛ, величина которой указывает на скорость образования перекисных радикалов; H - амплитуду H202 - индуцированного люминол-зависимого свечения, величина которой обратно коррелирует с перекисной резистентностью субстрата; Sind-2 - светосумму за 2 минуты H202 - индуцированной люминол-зависимой ХМЛ, величина которой обратно коррелирует с активностью антиоксидантной антирадикальной системы защиты (АОРЗ).

Исследование влияния синтетических аналогов дерморфина на показатели оксидативного метаболизма гранулоцитов цельной крови пациентов проводили по методикам ХМЛ-анализа У.Р. Фархутдинова (2007), V. Witko-Sarsat et al. (2003). Регистрировали светосуммы: базальной ХМЛ - S-lum и S-luc и стимулированной фагоцитозом опсонизированного зимозана ХМЛ: S-(lum z) и S-(luc z).

Помимо абсолютных, определяли также относительные параметры ХМЛ-значений. Коэффициент стимуляции (K) - отношение уровней S-(luc z) / S-luc ; S-(lum z) / S-lum, раскрывает величину резервных возможностей гранулоцитов.

Экспериментальный этап проводился на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ДВГМУ (заведующий лабораторией - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ С.С. Тимошин).

Эксперимент in vitro. Исследовались образцы цельной крови детей всех наблюдаемых клинических групп.

Оксидативный метаболизм гранулоцитов изучался по методике А.Р. Монастырской и соавт. (1987) на фоне введения в инкубационную среду исследуемых пептидов в концентрации 10-8 М. Методом ХМЛ анализа определяли S-lum, S-luc, S-(lum z), S-(luc z), а также коэффициенты стимуляции (S-(luc z) / S-luc), (S-(lum z) / S-lum).

Согласно дизайна исследования образцы цельной крови детей исследуемых клинических групп подразделялись на группы: · Группа «И» - интактные образцы цельной крови пациентов, не подвергавшиеся обработке препаратами;

· Группа «Арг( )аналог» - образцы цельной крови пациентов, обработанные аргининсодержащим олигопептидом;

· Группа «Арг(-)аналог» - образцы цельной крови пациентов, обработанные безаргининовым аналогом;

· Группа «Ф» - образцы цельной крови пациентов с введением эквиобъемного количества изотонического раствора хлорида натрия;

В качестве контроля анализировались ХМЛ-значения гранулоцитов цельной крови здоровых детей.

Эксперимент in vivo.

Характеристика экспериментальных животных. В экспериментальных исследованиях использовали самок беспородных белых крыс 3-4 месячного возраста. Животных с 14 по 19 день гестации на 4 часа ежедневно помещали в барокамеру и создавали разрежение, соответствующее высоте 9000 м над уровнем моря (давление 224 мм.рт.ст.). Потомство подопытных и интактных крыс забивали методом быстрой декапитации на 7 сутки постнатального развития. Всего в эксперименте было использовано потомство от 75 самок.

Эксперименты проводили на 182 новорожденных белых крысах.

Крысы 1 группы - с нормальным кислородным обеспечением пренатального периода, получали аргининовый аналог H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH с 2 по 6 сутки постнатального развития, в режиме ежедневного внутрибрюшинного введения, в дозе 100 мкг/кг.

Крысы 2 группы - с нормальным кислородным обеспечением пренатального периода, получали безаргининовый аналог H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH в аналогичном режиме.

Крысы 3 группы - перенесшие пренатальную гипоксию. Состояние гипоксии моделировали ежедневным 4-часовым пребыванием самок-крыс в барокамере СБК-49 (высота 9000 м.), с 14-й по 19-й день беременности.

Крысы 4, 5 группы - перенесшие пренатальную гипоксию и получавшие, соответственно, олигопептид H-Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH и безаргининовый аналог в выше обозначенном режиме.

Животным 6 группы - группы «контроль» в соответствующем режиме вводили эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия.

Эксперименты проводились согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ № 755 от 12 августа 1977г. Министерства Здравоохранения СССР). Дизайн экспериментальных исследований был одобрен на заседании комитета по биомедицинской этике ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства 17.10.05 (протокол № 5).

Метод авторадиографии. Объектами исследования служили эпителий и гладкие миоциты трахеи 7-суточных белых крыс. Новорожденным животным за 1 час до эвтаназии вводили 3Н-тимидин в дозе 1 МККЮРИ на грамм веса (уд.активность 84 Кюри/моль). Радиоавтографы готовили по принятой в лаборатории методике. Индекс меченых ядер (ИМЯ) - отношение числа меченых 3Н-тимидином ядер к общему их количеству - определяли на основании просмотра 2000-2500 ядер и выражали в процентах. Мечеными считали ядра, над которыми проецировалось не менее 5 треков. Средним числом зерен серебра над 100 мечеными ядрами выражали интенсивность метки (ИМ), характеризующей скорость прохождения клетками синтетического периода клеточного цикла.

Определение методом ХМЛ-анализа оксидативного статуса различных биосубстратов экспериментальных животных. Исследованию подвергали сыворотку крови и гомогенаты легких новорожденных белых крыс по методикам описанным выше. Определяли: Ssp; S-luc; S-lum; h; Sind-1; H; Sind-2.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обработаны с применением математико-статистических методов с вычислением относительных величин (среднее арифметическое, среднее геометрическое, стандартное отклонение, ошибку средней величины, достоверность различий между показателями с учетом доверительной вероятности по критерию Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05. Качественные признаки характеризовали с помощью ранговой оценки с последующим корреляционным анализом (метод Спирмена).

Собственные результаты

В зависимости от признаков активности хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе детей нами были сформированы клинические группы наблюдения. Период болезни определялся данными комплекса клинико-лабораторных, инструментальных методов обследования. В 100% случаев дефект органогенеза легких верифицирован морфологически путем трансторакальной биопсии. Нозологическая структура: врожденные пороки развития легких по типу тканевой дисплазии, включающей «изменения тканевых компонентов - соединительной ткани, хряща и паренхимы легкого, перекалибровку сосудов, ангиоматоз, чередование участков эмфиземы и ателектазов, а также метаплазию эпителия трахеи и бронхов, утолщение стенок сосудов» [Акинфеев А.А., Рыжавский Б.Я., 2004], - составили 68,6%, по типу гипоплазии - 31,4%.

При поступлении в клинику ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ ОМИД в периоде обострения ХВЗЛ состояние средней степени тяжести было зарегистрировано у 28,57% пациентов младшей возрастной группы, в то время как в старшей возрастной группе в средней степени тяжести было госпитализировано 41,66% пациентов (табл. 1). У пациентов старшей возрастной подгруппы обострение не сопровождалось повышением температуры тела в 83,3% случаев, у пациентов младшего возраста - в 66,6%. Фебрилитет в младшей возрастной подгруппе отмечался чаще, чем у пациентов старшего возраста.

Исследуя особенности клинического течения различных периодов ХВЗЛ у наших пациентов, нами была выявлена маломанифестность симптомов в периоде обострения хронического бронхолегочного процесса. Характер кашля в возрастных группах практически не различался по частоте встречаемости сухого и влажного, в то время как малопродуктивный кашель несколько чаще отмечался у пациентов младшего возраста. Достоверно чаще у пациентов младшего возраста отмечалось жесткое дыхание. Со стороны аускультативной картины в легких в отношении хрипов сколь либо значимой разницы между возрастными группами выявлено не было.

Таблица 1 Характеристика основных клинических симптомов у пациентов в периоды ремиссии и обострения ХВЗЛ, сочетанных с дефектами органогенеза респираторной системы, (%±m)

ХВЗЛ

Возрастной диапазон (годы) I возрастная подгруппа (6-11 лет) II возрастная подгруппа (12-17 лет) I возрастная подгруппа (6-11 лет) II возрастная подгруппа (12-17 лет)

1 Обострение Ремиссия

Состояние при поступлении: удовлетворительное средней тяжести 71,42±10,10 28,57±10,10 58,33±14,86 41,66±14,86 Симптомы хронической интоксикации

Температура тела: нормотермия субфебрилитет фебрилитет 66,66±10,54 9,52±6,56 23,80±9,52 83,33±11,23 0±25,74 16,66±11,23 39,13±10,40 22,58±7,63

Характер кашля: сухой влажный малопродуктивный 23,80±9,52 52,38±11,16 23,80±9,52 25,0±13,05 58,33±14,86 16,66±11,23 21,73±8,79 8,69±6,00 12,9±6,12 38,7±8,89**

Экспираторная одышка 38,09±10,85 41,66±14,86 30,43±9,81 51,61±9,12

Аускультативная картина: везикулярное дыхание жесткое дыхание локально ослабленное 90,47±6,56 9,52±6,56 50,0±15,07* 16,66±11,23 47,82±10,64 52,17±10,64 0±15,68 70,96±8,28 22,58±7,6* 6,45±4,48

Характер хрипов: хрипы отсутствуют рассеянные сухие хрипы рассеянные влажные хрипы рассеянные сухие и влажные хрипы локальные влажные хрипы 47,61±11,16 14,28±7,82 28,57±10,10 4,76±4,76 19,04±8,78 58,33±14,86 16,66±11,23 25,0±13,05 0±25,74 8,33±8,33 95,65±4,34 4,34±4,34 0±15,68 83,87±6,71 6,45±4,48 9,67±5,39

Примечание: * - p<0.05 при сравнении между возрастными подгруппами. ** - p<0.01 при сравнении между возрастными подгруппами.

Клинические симптомы у больных с минимальной степенью активности воспалительного процесса - в периоде ремиссии характеризовались следующими признаками. Симптомы хронической интоксикации в младшей возрастной подгруппе наблюдались более чем у трети пациентов, в старшей возрастной подгруппе - у 22,6%. При этом в периоде ремиссии кашель беспокоил около 1/3 детей младшего возраста и более половины детей старшего возраста.

Достоверно чаще влажный кашель отмечался у пациентов в возрасте 12-17 лет. У 6,45% пациентов старшего возраста были зарегистрированы жалобы на одышку с затрудненным выдохом, в то время как в группе пациентов младшего возраста жалоб такого характера не отмечалось. Аускультативная картина легких у детей младшей возрастной группы характеризовалась следующими признаками. Жесткое дыхание отмечалось достоверно чаще - более чем у половины пациентов, в то время как у детей старшего возраста в периоде ремиссии жесткое дыхание регистрировалось у 22,6% пациентов. Локальная симптоматика в виде влажных локальных хрипов отмечалась только у пациентов старшего возраста. В 4,34% наблюдались влажные рассеянные хрипы. У детей старшей возрастной группы отмечалось в 70,9% везикулярное дыхание, в 22,6% - жесткое.

При исследовании ХМЛ-показателей оксидативного статуса биосубстратов пациентов различных возрастных групп нами были выявлены следующие особенности.

Анализ ХМЛ-грамм сыворотки крови детей младшего возраста в периоде обострения ХВЗЛ по бронхитическому типу позволил выявить (Рис. 1) выраженные нарушения биогенеза АКМ на системном уровне. Так, показатель интенсивности свободнорадикальных процессов (Ssp) превышал аналогичный в контроле в 5,2 раза, при этом зарегистрировано достоверное увеличение продукции супероксид-радикала (Sluc) в 5,5 раза, гидроксил-радикала (Slum) - в 5,7 раза. Значительный вклад в этот процесс вносила активация перекисного окисления липидов, о чем свидетельствовало увеличение концентрации гидроперекисей липидов (h) в 5,3 раза и ускорение образования перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) в 5,5 раза. Выявленные нарушения АКМ-статуса сопровождались ослаблением антиоксидантной антирадикальной системы защиты. Об этом свидетельствовало повышение показателя (Sind-2) в 5,2 раза, а также снижение резистентности к перекисному окислению (Н увеличилась в 5,1 раза).

Декомпенсированное накопление в сыворотке крови АКМ радикальной и не радикальной природы на фоне угнетения АОРЗ свидетельствует о наличии оксидативного стресса у пациентов младшего возраста в периоде обострения ХВЗЛ.

В периоде ремиссии (Рис. 1) у этой группы пациентов сохранялись признаки оксидативного стресса: хотя все исследуемые ХМЛ-параметры (Ssp, Sluc, Slum, h, Sind-1, Sind-2, Н) снизились в 1,7-2 раза в сравнении с аналогичными при обострении, но при этом продолжали превышать контрольные величины в 2,5-3 раза.

У пациентов старшего возраста в сыворотке крови в периоде обострения ХВЗЛ (Рис. 2) также выявлено наличие признаков оксидативного стресса: все исследуемые ХМЛ-параметры превышали контрольные значения в 4-4,7 раза. Признаки оксидативного стресса на системном уровне зарегистрировали у пациентов и в периоде ремиссии ХВЗЛ: исследуемые показатели продукции АКМ снизились в 2,5-2,8 раза в сравнении с аналогичными при обострении, однако продолжали превышать аналогичные в контрольной группе в 1,5-1,8 раза.

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периоде обострения имеет место оксидативный стресс, сохраняющийся, хотя и в меньшей степени выраженности, и в периоде ремиссии.

При сравнительном анализе ХМЛ-статуса сыворотки крови пациентов различных возрастных подгрупп установлено, что у пациентов младшего возраста отмечались более выраженные признаки оксидативного стресса в периоде ремиссии ХВЗЛ, чем у пациентов старшей возрастной подгруппы, о чем свидетельствует достоверное превышение (Ssp), (Sluc), (Slum), (h) (Sind-1), (Sind-2), (Н) в 1,2-1,5 раза (Табл. 2).

Рис. 1. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса сыворотки крови пациентов младшей возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ.

Рис. 2. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса сыворотки крови пациентов старшей возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ.

Примечание: - p<0.05 по отношению к группе "контроль".

* - p<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение».

Известно, что мембрана эритроцитов является универсальной моделью плазматической мембраны, и метаболические процессы, происходящие в них, отражают изменения в мембранах других органов и тканей, в т.ч. и в легких, представляющих наиболее крупную мембрану организма [Merker M.P. et al., 2004].

У детей младшего возраста на мембранно-клеточном уровне выявлены сходные изменения активности процессинга АКМ, что и в сыворотке крови (Рис. 3). При обострении ХВЗЛ показатели ХМЛ превышали контрольные значения в 2,7-4,6 раза. В периоде ремиссии ХМЛ-параметры снизились в сравнении с аналогичными при обострении, но сохранялись на достоверно высоком уровне по отношении к контролю, превышая их в 1,3-1,9 раза. У пациентов старшего возраста выявлена аналогичная динамика свободнорадикальных изменений в мембранах эритроцитов (Рис. 4). В периоде обострения исследуемые ХМЛ-параметры превышали контрольные значения в 3,5-6,1 раза.

Рис. 3. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса мембран эритроцитов пациентов младшей возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ.

Рис. 4. ХМЛ-параметры (отн.ед) оксидативного статуса мембран эритроцитов пациентов старшей возрастной подгруппы в различные периоды ХВЗЛ.

Примечание: - p<0.05 по отношению к группе "контроль".

* - p<0.05 по отношению к группе "ХВЗЛ-обострение».

В периоде ремиссии ХВЗЛ зарегистрировано снижение интенсивности процессов свободнорадикального окисления (СРО): все исследуемые параметры снизились в 1,8-2,8 раза, но продолжали превышать контрольные значения в 1,4-1,8 раза.

Сравнительный анализ ХМЛ-показателей мембран эритроцитов у пациентов различных возрастных групп продемонстрировал, что нарушения биогенеза АКМ на мембранно-клеточном уровне (в отличие от аналогичных процессов на организменном уровне) были более выражены в старшей возрастной группе как в периоде обострения, так и в периоде ремиссии ХВЗЛ (Табл. 2).

Фибробронхоскопия и исследование бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) осуществлялись по строгим клиническим показаниям. По этическим причинам здоровым детям данная процедура не проводилась. В связи с чем, полученные показатели БАЛЖ нами были оценены в отношении интенсивности воспалительного процесса.

Установлено, что в БАЛЖ пациентов старшей возрастной подгруппы в периоде обострения ХВЗЛ имела место более выраженная, чем в младшей возрастной подгруппе, интенсификация процессов СРО (Табл. 2). Так, в старшей возрастной подгруппе в периоде обострения активизировался процессинг АКМ: показатели (Ssp), (Sluc), (Slum) превышали аналогичные у пациентов младшей подгруппы в 2 - 2,5 раза.

Таблица 2 ХМЛ-показатели мембран эритроцитов (МЭ), бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) и сыворотки крови (СК), пациентов младшей и старшей возрастных подгрупп в различные периоды ХВЗЛ, (M±m)

Показатель (отн.ед.) ХВЗЛ - обострение ХВЗЛ - ремиссия ХВЗЛ - обострение ХВЗЛ - ремиссия

6-11 лет 12-17 лет

Ssp МЭ 1,28±0,06* 0,54±0,03*,*** 2,46±0,11*,** 1,31±0,05*,**,***

БАЛЖ 1,62±0,10 0,74±0,04*** 3,24±0,2** 1,72±0,11**

СК 0,234±0,010* 0,123±0,007*,*** 0,251±0,01* 0,100±0,005*, **,*** h МЭ 1,74±0,14* 0,61±0,04*,*** 3,07±0,24*,** 1,70±0,13*,**,***

БАЛЖ 2,11±0,13 0,81±0,05*** 4,12±0,32** 2,36±0,16**

СК 0,281±0,017* 0,155±0,010*,**,*** 0,315±0,025* 0,111±0,007*, **,***

Sind-1 МЭ 2,86±0,19* 1,19±0,04*,*** 5,83±0,27*,** 3,16±0,11*,**,***

БАЛЖ 3,62±0,17 1,62±0,10*** 6,48±0,22** 3,40±0,16**

СК 0,553±0,021* 0,284±0,013*,**,*** 0,581±0,030* 0,229±0,011*,**,***

Sluc МЭ 0,85±0,05* 0,47±0,03*,*** 1,49±0,09*,** 0,89±0,04*,**,***

БАЛЖ 1,19±0,06 0,57±0,04*** 2,62±0,11** 1,45±0,10**

СК 0,211±0,015* 0,098±0,006*,**,*** 0,200±0,012* 0,078±0,005*,**,***

Slum МЭ 1,15±0,07* 0,56±0,03*,*** 1,94±0,12*,** 1,12±0,06*,**,***

БАЛЖ 2,00±0,10 0,78±0,05*** 5,11±0,26** 2,40±0,11**

СК 0,334±0,020* 0,160±0,010*,**,*** 0,340±0,019* 0,120±0,009*,**,***

Н МЭ 3,52±0,13* 1,85±0,11*,** 5,10±0,25*,** 3,55±0,12*,**,***

БАЛЖ 3,95±0,15 1,35±0,10*** 6,62±0,34** 4,28±0,24**

СК 0,665±0,043* 0,390±0,024*,**,*** 0,670±0,038* 0,255±0,020*,**,***

Sind-2 МЭ 5,26±0,30* 1,93±0,09*,*** 7,27±0,44*,** 4,91±0,24*,**,***

БАЛЖ 5,71±0,34 2,54±0,15*** 8,99±0,47** 5,55±0,31**

СК 0,890±0,040* 0,428±0,028*,*** 0,920±0,053* 0,340±0,023*,**, ***

Примечание: * - p<0.05 по отношению к группе «контроль»;

** - p<0.05 при сравнении между возрастными подгруппами;

*** - p<0.05 внутри возрастных подгрупп "ХВЗЛ-обострение», "ХВЗЛ-ремиссиия».

Более интенсивно протекали процессы перекисного окисления липидов: значения (h), (Sind-1) превышали аналогичные значения в 1,9 -1,8 раза. Изменения АОРЗ также были более выражены у пациентов старшей возрастной группы.

В периоде ремиссии у пациентов старшего возраста (Табл. 2) также отмечалась более высокая генерация кислородных дериватов: показатели (Ssp), (Sluc), (Slum), хотя и снизились по сравнению с аналогичными в периоде обострения, однако продолжали превышать показатели у пациентов младшего возраста в 2,3 - 3,1 раза. ХМЛ-параметры, характеризующие процессы перекисного окисления липидов: (h), (Sind-1) также значительно превышали аналогичные значения в младшей группе в 2,9 - 2,1 раза. Кроме того, значения (Sind-2) и (H) в 2,1-3,1 раза превосходили аналогичные в группе пациентов младшего возраста.

Необходимо отметить, что в периоде ремиссии у пациентов старшего возраста сохранялся более интенсивный процессинг АКМ на фоне более выраженного угнетения АОРЗ. Все исследуемые ХМЛ-параметры в периоде ремиссии снизились в 1,5-2,1 раза. В то время как у пациентов младшего возраста в периоде ремиссии зарегистрировано большее снижение интенсивности свободнорадикальных процессов: (Ssp), (Sluc), (Slum), (h), (Sind-1) снизились в 2,1-2,6 раза на фоне повышения активности АОРЗ.

Выявленные особенности ХМЛ-грамм мембран эритроцитов, БАЛЖ и сыворотки крови у пациентов с ХВЗЛ младшего и старшего возраста свидетельствуют о наличии возрастной эволюции нарушений оксидативного статуса на мембранно-клеточном, органном и организменном уровнях.

Гранулоциты и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участников воспаления в респираторной системе. Кроме того, в других органах и тканях отсутствует такой специфический для легких эффект, как явление значимого нарастания способности гранулоцитов превращать кислород в АКМ при прохождении через сосудистое русло легких [Коган А.Х. и соавт., 1989].

Важнейшим механизмом, задействованным в процессах активации гранулоцитов является изменение интенсивности кислород-зависимого метаболизма и генерации свободных радикалов (СР) [Маянский А.Н., 2005; Behe P. et al., 2007; Nauseff W.M., 2007]. При анализе оксидативного статуса гранулоцитов цельной крови пациентов младшей возрастной подгруппы (Табл. 6) установлено, что в периоде обострения базальная продукции супероксид радикала (Sluc) превышала контрольные значениями в 5,4 раза. При стимуляции зимозаном продукция супероксид радикала (Sluc Z) возросла в 5,1 раза, превысив при этом контрольные показатели (Sluc Z) в 3,07 раза. Однако, при сравнении, ответ на стимуляцию зимозаном гранулоцитов контрольной группы (Sluc Z) составил 9-кратное увеличение продукции супероксид радикала.

Помимо абсолютных, исследовали относительные параметры оксидативного метаболизма гранулоцитов, а именно коэффициент стимуляции, отражающий резервные возможности гранулоцитов. Исследование позволило зарегистрировать снижение резервных возможностй гранулоцитов исследуемой клинической группы - коэффициент стимуляции (K-luc) был ниже аналогичных контрольных значений в 1,7 раза. При исследовании показателей генерации гидроксил-радикала выявлен аналогичный характер изменений. Так, показатели базальной и стимулированной генерации гидроксил-радикала (Slum) превышали контрольные значения в 4,9 - 2,8 раза, соответственно. Однако коэффициент стимуляции (К-lum) при этом был ниже контрольных цифр в 1,8 раза.

В периоде ремиссии у пациентов младшей возрастной подгруппы (Табл. 6) ХМЛ-показатели гранулоцитов снизились в 1,2-2,1, но сохранились в пределах, достоверно превышающих показатели в группе «контроль» в 2,1-2,6 раза. Индексы стимуляции (K-luc), (К-lum) в периоде ремиссии возросли в 1,5 раза, не достигнув, однако, контрольных значений.

При исследовании оксидативного метаболизма гранулоцитов пациентов с ХВЗЛ старшей возрастной подгруппы как в периоде обострения, так и в периоде ремиссии была зарегистрирована аналогичная динамика ХМЛ-параметров (Табл. 7).

Следует подчеркнуть особо неблагоприятное соотношение интенсивности двух процессов оксидативного метаболизма гранулоцитов - неадекватно высокий уровень базальной генерации АКМ и неадекватно низкий уровень стимулированного ответа. Снижение резервных возможностей гранулоцитарной системы имеет ключевое значение в хронизации и персистировании воспалительного процесса в бронхолегочной системе. Таким образом, у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы в периодах обострения и ремиссии имеет место снижение функционального резерва гранулоцитов на фоне гиперпродукции супероксид-анион- и гидроксил-радикалов этими клетками.

При исследовании возрастных особенностей оксидативного метаболизма гранулоцитов у наших пациентов установлено, что у детей старшей возрастной подгруппы в периоде ремиссии имело место более выраженное истощение функциональных резервов этих клеток.

С помощью корреляционного анализа выявлено, что гранулоцитарные АКМ - супероксид- и гидроксил-радикалы - участвуют в формировании нарушений оксидативного статуса на клеточно-мембранном, органном и организменном уровнях у детей с ХВЗЛ в периоды обострения и ремиссии ХВЗЛ. При исследовании структуры значимых корреляций в периоде обострения между параметрами ХМЛ-ответа гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови, БАЛЖ выявлено наличие сильной прямой корреляции связи между показателями люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции гранулоцитов и эритроцитарных мембран (r=0,83 и r=0,87, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и сыворотки крови (r=0,80 и r=0,84, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и БАЛЖ (r=0,85 и r=0,82, соответственно).

При исследовании структуры значимых корреляций у детей с ХВЗЛ в периоде ремиссии между параметрами ХМЛ-ответа гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови, БАЛЖ выявлено наличие сильной прямой корреляции связи между показателями люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции гранулоцитов и эритроцитарных мембран (r=0,80 и r=0,82, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и сыворотки крови (r=0,75 и r=0,77, соответственно), между аналогичными показателями гранулоцитов и БАЛЖ (r=0,84 и r=0,88, соответственно).

Таким образом, корреляционные взаимосвязи показателей оксидативного статуса гранулоцитов, мембран эритроцитов, сыворотки крови и бронхоальвеолярного лаважа у детей с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы свидетельствуют о сопряженности нарушений оксидативного метаболизма на локальных и системном уровнях.

Выявленная нами повышенная генерация гранулоцитами АКМ вероятно играет значительную роль в АКМ-обусловленном повреждении тканей респираторного тракта и может представлять собой частный случай аутофагоцитарных заболеваний.

Полученные данные свидетельствуют о несовпадении у наших пациентов сроков клинической ремиссии и метаболической. Дети с ХВЗЛ на фоне дефектов органогенеза респираторной системы нуждаются в антиоксидантной антирадикальной терапии не только в периоде обострения, но и в периоде ремиссии.

Для исследования возможных антиоксидантных антирадикальных свойств синтетических аналогов дерморфина возникла необходимость в экспериментальном моделировании состояния оксидативного стресса на соответствующем локальном и системном уровнях. Нами была использована модель гипобарической гипоксии, поскольку многими клинико-экспериментальными исследованиями [Haworth S.G., Hislop A.A., 2003; Peyronnet J. et al., 2007] установлено, что хроническая внутриутробная гипоксия является универсальным повреждающим фактором, вызывающим дезинтеграцию структурно-метаболических процессов в системе органов дыхания.

Анализ экспериментальных данных продемонстрировал (Табл. 3), что воздействие внутриутробной гипоксии интенсифицировало процессы СРО в легких новорожденных белых крыс - показатель (Ssp) увеличился в 1,9 раза, при этом отмечалось значительное увеличение продукции супероксид-радикала (Sluc) и гидроксил-радикала (Slum) в 2,3 и 2 раза, соответственно. Зарегистрирована активация перекисного окисления липидов (h) и ускорение образования перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) - показатели возросли в 2,15 и 2,2 раза, соответственно. Выявленные нарушения свободнорадикального статуса обусловлены ослаблением антиоксидантной антирадикальной защиты в целом и снижением резистентности к перекисному окислению, в частности - показатели (Sind-2) и (Н) снизились в 2 раза и 3 раза, соответственно.

В сыворотке крови новорожденных крыс, перенесших пренатальную гипоксию, зарегистрировали изменения в сравнении с контрольным уровнем аналогичной направленности что и в легких, но в большей степени выраженные (Табл. 3).

Таблица 3 Влияние пренатальной гипоксии на показатели спонтанной и индуцированной ХМЛ гомогенатов легких и сыворотки крови новорожденных белых крыс, (M±m).

Показатель (отн.ед.) Контроль Гипоксия

Легкие Кровь Легкие Кровь

Ssp 1,44±0,08 0,31±0,02 2,86±0,15* 0,74±0,062* h 1,32±0,10 0,186±0,01 2,83±0,15* 0,64±0,05*

Sind-1 3,27±0,21 0,797±0,04 7,12±0,43* 2,23±0,11*

Sluc 0,93±0,05 0,235±0,18 2,13±0,10* 0,520±0,35*

Slum 1,48±0,09 0,330±0,23 3,08±0,14* 0,790±0,50*

Н 4,63 0,25 1,69 0,10 12,56±1,11* 6,06±0,52*

Sind-2 8,27 0,65 2,34 0,20 17,14±1,15* 9,30±0,70*

Примечание: * - p<0.05 по отношению к группе "контроль".

Одним из основных показателей структурного гомеостаза системы органов дыхания является ДНК-синтетическая активность эпителиально-гладкомышечного компартмента воздухоносных путей [Zaher T.E. et al., 2007].

Являясь универсальными передатчиками сигналов, АКМ осуществляют свою эффекторную роль, воздействуя на активность факторов транскрипции в режиме позитивной или негативной регуляции [Zaher T.E. et al., 2007; Reddy S.P., 2008]. В частности, доказано участие АКМ в регуляции активности универсального фактора транскрипции - ядерного фактора NF-?B [Martin L.D. et al., 1998; Janssen-Heininger Y. et al., 2000; Barnes P.J. et al., 2003]. Осуществляя редокс-активацию через NF-?B, оксиданты вовлекаются в регуляцию процессов морфогенеза на уровне генома [Gardner A.M. et al., 1997; Franco R. et al., 2007].

В нашем исследовании мы попытались выяснить, реализовались ли эффекты АКМ в отношении пролиферативной активности эпителиально-гладкомышечного компартмента у новорожденных белых крыс, перенесших внутриутробную гипоксию.

Авторадиографический анализ (рис. 5) продемонстрировал, что в трахее 7-суточных новорожденных крыс, перенесших пренатальную гипоксию, имеют место разнонаправленные изменения пролиферативной активности эпителиоцитов и гладких миоцитов. Величина ИМЯ эпителиоцитов снизилась на 69,1%, при этом наблюдалось статистически значимое замедление прохождения эпителиоцитами S-периода клеточного цикла. В этих условиях ДНК-синтетическая активность гладких миоцитов превышала контрольные показатели в отношении ИМЯ - на 50,1%, ИМ - на 21%.

Таким образом, воздействие пренатальной гипоксии вызывает разнонаправленные изменения активности синтеза ДНК в эпителиально-гладкомышечном компартменте трахеи новорожденных белых крыс: снижение - в эпителиоцитах и повышение - в гладких миоцитах. Более высокая резистентность гладких миоцитов в сравнении с эпителиоцитами к воздействию оксидативного стресса, обусловлена, вероятно, тканеспецифическими особенностями эффекторной АКМ-регуляции процессов клеточного цикла.

Полученные нами in vivo данные о стимулирующем влиянии пренатального гипоксического воздействия на величину пула пролиферирующих гладких миоцитов трахеи 7-суточных белых крыс в определенной степени согласуются с результатами исследований гипоксического воздействия in vitro: пролиферативной активности фетальных гладких миоцитов трахеи человека [Pandya H.C., 2002] и трахеи 28-36 суточных крыс [Cogo A., 2003] и отражают типичную реакцию гладкомышечной ткани на оксидативный стресс. Участие АКМ в качестве универсальных внутри- и межклеточных мессенджеров эффекторных процессов, результатом которых является активация процессов синтеза ДНК в гладких миоцитах воздухоносной системы, косвенно подтверждается данными [Patel H. J. et al., 1999] об антипролиферативном действии супероксиддисмутазы в отношении гладких миоцитов бронхов человека.

Рис. 5. Показатели ИМЯ и ИМ эпителиоцитов и гладких миоцитов трахеи 7-суточных белых крыс, подвергнутых пренатальной гипоксии.

Примечание: * - p<0.05 по отношению к группе "контроль"

Следует отметить, что изменения оксидативного статуса и пролиферативной активности были выявлены у 7-суточных крыс (через 10 суток после заключительного гипобарического воздействия), что свидетельствует о сохранении постгипоксического структурно-метаболического следа в системе органов дыхания как минимум до конца периода новорожденности. Пренатальная гипоксия является ведущим фактором риска формирования пневмопатий новорожденных, в т.ч. бронхолегочной дисплазии [Tang J.R., 2000; Balasubramaniam V., 2003; Polosukhin V.V., 2007; Steinke J.W., 2008], сопровождающейся ремоделированием воздухоносных путей. [Cheung E., 2000; Cogo A., 2003; Cutz E., 2007; Polosukhin V.V., 2007; Coraux C., 2008; Steinke J.W., 2008]. В литературе имеются единичные данные, полученные преимущественно в экспериментах in vitro - на клеточных культурах эпителиоцитов и гладких миоцитов воздухоносных путей различных видов млекопитающих, о пролиферотропных эффектах непосредственного гипоксического воздействия [Cheung E., 2000; Pandya H.C., 2002; Cogo A., 2003]. Аналогичных данных о ранних постнатальных последствиях недостаточного кислородного обеспечения эмбриогенеза, зарегистрированных в эпителиальном и гладкомышечном клеточных пулах слизистой респираторного тракта in vivo (в условиях целостного организма), в доступной литературе нами не обнаружено. В нашем исследовании установлено, что у новорожденных белых крыс постгипоксическое нарушение процессов синт