Патогенетические механизмы иммунной дисфункции у новорожденных с респираторными нарушениями - Автореферат

Благодаря фундаментальным исследованиям отечественных и зарубежных иммунологов были получены убедительные данные о роли иммунной системы в изменении иммунного статуса у новорожденных с респираторными нарушениями. Частота развития инфекционных осложнений при неотложных состояниях у новорожденных с дыхательными расстройствами остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности и составляет 30-50%, занимая одно из ведущих мест в структуре детской смертности (Вермель А.Е., 2003; Володин И.И., Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., 2003; Самсыгина Г.А., 2003; Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., Соколовская Ю.В., 2005; Мархулия Х.М. и соавт., 2005; Баранов А.А., 2007; Володин Н.Н. и соавт., 2007; Яцык Г.В., 2007; Голубев А.М. и соавт., 2008; Khemani E. et al., 2007; Olaciregui I. et al., 2009; Ramirez K . et al., 2010). В настоящее время ведутся интенсивные поиски универсальных клинико-лабораторных маркеров присоединения бактериальных инфекций у новорожденных с респираторными нарушениями, находящихся на искусственной вентиляции легких (Эстрин В.В. и соавт., 2006, 2007; Бирюкова Т.В. и соавт., 2007; Дегтярева М.В., 2008). Учитывая вышеизложенное, приоритетным направлением является изучение патогенеза респираторных нарушений с позиций определения роли врожденного и адаптивного иммунитета, а также особенностей взаимодействия между ними, разработка ранней диагностики нарушений иммунологической адаптации и бактериальных осложнений у новорожденных с респираторной патологией. Выявить патогенетические механизмы повреждения иммунной системы у новорожденных с респираторными нарушениями и разработать ранние критерии диагностики, прогноза течения и возникновения бактериальных осложнений при респираторных нарушениях.

По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций - 16 публикаций, получено 5 патентов на изобретение, 46 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 311 страницах машинописного текста, содержит 107 таблиц, 29 рисунков, 2 схемы. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы».

Библиографический указатель включает 305 работ, из них 158 отечественных и 147 иностранных источников литературы.

Материалы и методы исследования

Дизайн исследования

Иммунологическое обследование детей проводили в объединенной клинико-диагностической лаборатории Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии с использованием стандартных тестов в соответствии с разработанной там же схемой иммунологического обследования, рекомендованной ВОЗ. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом института.

Материалом для исследования послужили образцы крови и бронхоальвеолярного лаважа новорожденных детей, полученных сотрудниками анестезиолого-реанимационного и родильного отделений РНИИАП в процессе лечебного процесса и планового обследования.

Для решения поставленных задач было проведено первичное, комплексное иммунологическое обследование 479 доношенных новорожденных детей. Основную группу (441 ребенок) составили новорожденные, у которых в раннем периоде адаптации отмечались дыхательные расстройства, обусловленные мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом, поступившие из родильных домов г. Ростова-на-Дону и Ростовской области, в отделение реанимации новорожденных Института акушерства и педиатрии г. Ростова-на-Дону за период с 2005 по 2009 гг.

Группу сравнения составили 38 условно-здоровых новорожденных ребенка, у которых отмечалось физиологическое течение раннего периода адаптации.

В процессе выполнения работы у новорожденных из основной группы проводилось 3-х кратное иммунологическое обследование в динамике катамнестического наблюдения. У детей группы сравнения обследование проводилось один раз сразу после рождения. Исследовались иммунологические показатели пуповинной крови.

Критерии включения новорожденных в исследование: - имели респираторную патологию и перинатальное поражение ЦНС;

- гестационный возраст 38-41 неделя;

- вес при рождении не менее 2500 грамм;

- поступали в отделение реанимации на ИВЛ не позднее 7-х суток;

- при поступлении не имели клинических признаков внутриутробной инфекции, в том числе врожденной пневмонии.

Критерии исключения новорожденных в исследование: - генетического нарушения гемопоэза;

- синдрома Дауна;

Наличие у детей острой дыхательной недостаточности (ОДН) в сочетании с данными прямой ларингоскопии, обнаружившей меконий ниже голосовых связок, позволили поставить диагноз мекониально аспирационный синдром (МАС) у 186 новорожденных (42,2%). У остальных 255 новорожденных (57,8%), вошедших в исследование, имели место вторичные ателектазы легких, причиной которых в 2% случаев стал геморрагический синдром, а в 98% - перинатальное сочетанное поражение центральной нервной системы (ЦНС)- у них был диагностирован респираторный дистресс-синдром.

В процессе терапии течение основного заболевания новорожденных детей осложнялось развитием сепсиса (7,48%).

Ретроспективно все дети с МАС и РДС были разделены на 4 группы. В первых группах (МАС, n=155; РДС, n=212) заболевание закончилось благоприятно. Эти дети в дальнейшем, после стабилизации жизненно важных функций, для продолжения лечения были переведены в отделение патологии новорожденных. У новорожденных, составивших вторую группу (МАС, n=12; РДС, n=11), основное заболевание осложнилось присоединением септической инфекции и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных. Третью группу (МАС, n=2; РДС, n=8) составили новорожденные с присоединившейся септической инфекцией и летальным исходом. У новорожденных, составивших четвертую группу (МАС, n=17; РДС, n=24), основное заболевание закончилось летально.

Методы исследования

Исследование параметров иммунной системы проводилось на основе патогенетического принципа оценки иммунного статуса, разработанного в 1990 и дополненного в 1997 годах А.Н. Чередеевым и Л.В. Ковальчуком. В основу было положено изучение основных этапов функционирования клеток иммунной системы в процессе развития иммунного ответа, таких как распознавание, активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция.

Исследование иммунного статуса проводилось сразу после поступления детей в отделение реанимации и в динамике (на 3-5-е сутки и исходе заболевания (20-е сутки)). Большинство новорожденных поступало в первые 48 часов жизни, поэтому результаты этих исследований отражали исходное состояние иммунной системы.

Определяли количественные и функциональные показатели клеточного и гуморального иммунитета, иммунорегуляторного звена, системы фагоцитов, уровня апоптоза. При оценке клеточного звена иммунитета определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и моноцитов периферической крови (CD3 CD19-, CD3-CD19 , CD3 CD4 , CD3 CD8 , CD14 CD16 ), уровень экспрессии маркеров активации лимфоцитов и моноцитов (CD3 CD25 , CD4 CD25 , CD16 CD25 , CD3 CD69 , CD3 CD71 , CD3 HLA-DR , CD3 CD95 , CD14 CD69 , CD14 CD71 , CD14 HLA-DR , CD14 CD95 ), молекул адгезии (CD14 CD11b , CD14 CD11c , CD14 CD54 ), TLR- рецепторов (CD14 , CD14 CD282 , CD14 CD284 ), а также CD3-CD16 56 , CD3 CD16 56 , CD16 CD11b , CD14 CD64 , CD14 CD35 , CD45-FITC/CD14-PE методом одно- и двухпараметрического фенотипирования, используя комбинации моноклональных антител к дифференцировочным и активационным маркерам фирмы IQPRODUCTS (Нидерланды), Caltag (США), Immunotex (Франция), HYCULTBIOTECHNOLOGY (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) и PE (фикоэритрин)- меченые.

Клетки метили анти-CD45 и анти-CD14 МАТ для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов и моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45 CD14-, моноцитарно-макрофагальный гейт включал не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45 CD14 . В каждом образце анализировали не менее 104 клеток.

Количество лимфоцитов и моноцитов, вступивших в апоптоз, выявляли с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V , меченый FITC и пропидиум йодид (PI ), меченый PE (Caltag, США).

Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили с использованием лизирующего раствора OPTILISE C фирмы Immunotex (Франция) по прилагаемому протоколу.

Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США), используя стандартные протоколы.

Определение количества лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов проводили на автоматическом гематологическом анализаторе МЕК 8222 (Япония). Исследовали периферическую кровь в режиме цельной крови. В анализаторе лейкоциты дифференцировались на популяции: лимфоциты, гранулоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы.

Количественное содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965).

Спонтанный и индуцированный уровень продукции активных форм кислорода оценивали в НСТ-тесте по Пинегину Б.В. и соавт. (1989) методом спектрофотометрии.

Фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови определяли с использование стандартизированных по размеру частиц монодисперсного латекса с диаметром 1,3 - 1,5 мкм (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000).

Количественное определение содержания цитокинов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА = ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы - производителя. Определяли IL-1?, IL-6, IL-8, TNF-?, IFN-?, IFN-?, TGF-?1, RANTES, GM-CSF, NO с использованием тест-систем фирмы Biosource (США), Bender Medsistems (Австрия), R&D Systems (США).

Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением Multilabel Counter Victor - 2 1420 (Финляндия).

Количественную оценку результатов проводили методом построения калибровочной кривой, на которой отражена зависимость оптической плотности (ОП) от концентрации исследуемого цитокина. Результаты выражали в пг/мл и ммоль/л - оксид азота (NO).

Выделение альвеолярных макрофагов (АМ) проводили в пробах бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), полученного у новорожденных, находящихся на ИВЛ. Идентификацию клеток производили после окраски по Романовскому - Гимза на светооптическом микроскопе.

Статистическая обработка данных

При статистическом анализе полученных результатов: При анализе различных несвязанных групп применялся критерий Манна-Уитни, а для связанных - критерий Вилкоксона. В расчет принимались случаи при максимальном уровне ошибки первого рода р<0,05. Показатели описательной статистики были представлены в виде выборочной средней и доверительного интервала.

При предварительном анализе данных для оценки тесноты связей отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену.

Для оценки связей значимых признаков применялся метод «деревьев решений», который позволил провести деление по категориальным предикторам.

Оценка точности, специфичности и чувствительности полученных методов разделения групп проводилась на основе контрольных выборок, которые не использовались при предварительном статистическом анализе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что наличие иммунной недостаточности у человека обуславливает различную дискоординацию иммунного реагирования на различные антигены (вирусы, микробы, грибы и т.д.). От эффективности защитно-приспособительных реакций зависит тяжесть и длительность заболевания, сроки выздоровления, хронизация воспалительных процессов, эффективность проводимой терапии.

Нами был проведен сравнительный анализ среднестатистических параметров иммунного статуса при первичном иммунологическом обследовании новорожденных с мекониально-аспирационным синдромом (МАС) и здоровых новорожденных.

В результате анализа полученных данных нами было установлено, что у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации, по сравнению со здоровыми новорожденными имелись следующие статистически обоснованные различия параметров иммунного статуса.

Результаты фенотипирования лейкоцитов методом проточной цитометрии показали, что у новорожденных с мекониальной аспирацией было достоверно снижено процентное и абсолютное содержание количества CD3 CD19- (58,44±2,16% и 78,47±0,36%, 1,41±0,15 ·109/л и 2,63±0,06·109/л, соответственно), CD3 CD4 (42,76±1,73% и 56,31±0,33%, 1,03±0,11·109/л и 1,89±0,04·109/л, соответственно), CD3 CD8 (13,16±0,62% и 22,21±0,3%, 0,32±0,04·109/л и 0,74±0,01·109/л, соответственно), увеличение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (3,53±0,22 и 2,54±0,04 у здоровых новорожденных) вследствие количественного дефицита CD3 CD8 лимфоцитов, который является одним из основных показателей, характеризующий гармоничность функционирования иммунной системы (р<0,05). При этом особо значимым было снижение процентного и абсолютного количества CD3-CD19 лимфоцитов у новорожденных с МАС по сравнению со здоровыми новорожденными (2,98±0,9% и 11,39±0,38%, 0,06±0,01·109/л и 0,38±0,01·109/л, соответственно) (р<0,05). Спектр гуморальной защиты новорожденных с МАС оказался существенно ограничен за счет сниженной концентрации IGG (6,62±0,67 г/л, против 11,49±0,3 г/л) (р<0,05). Такой низкий уровень IGG у новорожденных рассматривается как свидетельство низкого уровня пассивного иммунитета, увеличивающего риск инфекционных осложнений в постнатальном периоде.

Причем, отклонения иммунного статуса такого рода у обследованных новорожденных с МАС составляли от 40 и до 79% от уровня нормальных показателей, что можно трактовать как иммунную недостаточность.

У новорожденных с МАС на 3-5 сутки динамического наблюдения достоверно снижалось абсолютное и относительное содержание CD3 CD19- относительно 1-х суток (53,27±1,98% и 58,44±2,16%, соответственно, 1,33±0,15·109/л и 1,41±0,15·109/л, соответственно), относительное содержание CD3 CD4 (40,33±1,65% и 42,76±1,73%, соответственно), абсолютного и относительного содержания CD3 CD8 (9,17±0,4% и 13,16±0,62%, соответственно, 0,22±0,2·109/л и 0,32±0,04·109/л, соответственно), наблюдалось увеличение иммунорегуляторного индекса (4,67±0,24 и 3,53±0,22, соответственно) (р<0,05).

Анализ функционального состояния клеток иммунной системы показал, что у новорожденных с МАС по сравнению со здоровыми новорожденными достоверно повышалось абсолютное и относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры ранней активации CD3 CD25 и CD3 CD69 (табл. 1).

Установлено достоверное снижение CD4 CD25 и CD16 CD25 . Такое снижение регуляторных Т- клеток CD4 CD25 приводит к осложненному течению воспалительного процесса инфекционной природы.

Известно, что лимфоциты в интактном состоянии не экспрессируют CD69 , но появляются после активации в течение 1-2 часов (Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Горшкова Р.П. и соавт., 2009). По нашим данным у новорожденных с МАС уровень экспрессии CD3 CD69 достигал значений, многократно (в 17 раз) превышающий уровни здоровых новорожденных.

Процентное содержание пролиферирующих клеток, несущих на своей поверхности трансферриновые рецепторы CD71 , имело достоверно высокий уровень у новорожденных детей с МАС. Аналогичные данные получены и по содержанию HLA-DR , характеризующих поздние этапы активации лимфоцитов.

Как показали наши исследования, на 3-5 сутки у новорожденных с МАС регистрировалась достоверно повышенная, по сравнению с 1-ми сутками, абсолютная и относительная экспрессия молекул активации CD3 CD25 , CD3 CD69 , CD3 CD71 , CD3 HLA-DR .

Таблица 1

Показатели функциональной активности лимфоцитов у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

CD3 CD25 % 3,96±0,23* 4,9±0,18** 4,84±0,14*** 1,37±0,12

CD3 CD25 109/л 0,09±0,01* 0,12±0,01** 0,14±0,01*** 0,05±0,004

CD4 CD25 % 1,1±0,12* - - 2,76±0,08

CD16 CD25 % 0,51±0,1* - - 1,57±0,09

CD16 CD25 109/л 0,01±0,002* - - 0,02±0,001

CD3 CD69 % 2,48±0,41* 5,63±0,33** 4,12±0,23*** 0,14±0,02

CD3 CD69 109/л 0,05±0,01* 0,14±0,02** 0,12±0,01*** 0,005±0,001

CD3 CD71 % 3,34±0,57* 7,07±0,43** 4,78±0,24*** 0,22±0,02

CD3 CD71 109/л 0,01±0,003* 0,004±0,001** 0,01±0,001 0,18±0,03

CD3 CDHLA-DR % 9,54±0,7* 17,46±0,87** 13,86±0,58*** 3,4±0,18

CD3 HLA-DR 109/л 0,23±0,03* 0,44±0,05** 0,41±0,03*** 0,11±0,01

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

Однако, и на 20-ые сутки заболевания, по сравнению с первыми сутками, активация лимфоцитов периферической крови оставалась статистически обоснованно высокой.

Учитывая важное значение процессов апоптоза в поддержании гомеостаза, нами было проанализировано содержание лимфоцитов, экспрессирующих Fas рецептор CD95 , как маркер поздней активации, характеризующий готовность клеток к апоптозу (табл. 2).

Оказалось, что как абсолютное, так и относительное содержание CD3 CD95 - клеток было повышено у новорожденных с МАС. У новорожденных с МАС на 3-5 сутки по сравнению с 1-ми сутками, отмечалось достоверное усиление экспрессии Fas-антигена как в абсолютном, так и относительном содержании. На 20-е сутки заболевания по сравнению с 1-ми сутками достоверных различий обнаружено не было.

При исследовании реализации программированной клеточной гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте у новорожденных нами было установлено, что у новорожденных с МАС по сравнению с контролем статистически достоверно увеличено содержание лимфоцитов периферической крови, находящихся в состоянии раннего Annexin V и позднего Annexin V PI апоптоза.

Как показали наши исследования, на 3-5 сутки происходило достоверное повышение лимфоцитов, находящихся на ранней и поздней стадии апоптоза.

Таблица 2

Показатели апоптоза лимфоцитов у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

CD3 CD95 % 8,2±0,6* 12,38±0,75** 7,97±0,45 2,27±0,18

CD3 CD95 109/л 0,2±0,02* 0,31±0,04** 0,23±0,02 0,08±0,01

Annexin V % 12,71±1,16* 17,48±1,17** 9,12±0,46*** 3,87±0,13

Annexin V PI % 1,23±0,21* 1,79±0,23** 0,79±0,07*** 0,15±0,01

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

Следует заключить, что на 20- сутки динамического наблюдения количество лимфоцитов в раннем и позднем апоптозе достоверно снижалось, но, не достигая нормальных значений, что делало новорожденных уязвимыми в плане инфекционных осложнений.

Важным информативным показателем состояния иммунной системы новорожденного в периоде адаптации является уровень продукции цитокинов, которые, являясь связующим звеном между иммунной системой, гемостазом, гемопоэзом и ангиогенезом, выступают в роли регуляторов всех основных этапов жизнедеятельности (Кузник Б.И., 2004; Александрова Ю. Н., 2007). Баланс про - и противовоспалительных цитокинов может быть ключевым моментом, обусловливающим клиническое состояние ребенка (Володин Н.Н., 2004).

При анализе профиля цитокинов нами было установлено, что содержание IL-1?, IL-6, IL-8, TNF-? у здоровых новорожденных при физиологическом течении родов низкое (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о повышении продукции IL-1?, IL-6, IL-8, TNF-? у новорожденных с МАС и в большей степени изменения касались уровней IL-6, IL-8. Уровень IL-6, IL-8 в плазме крови коррелировал с тяжестью состояния новорожденного ребенка с МАС.

Выявленные нарушения свидетельствуют о существенном вкладе провоспалительных цитокинов в патогенез мекониальной аспирации.

Изучение содержания IFN-? и IFN-? у новорожденных с МАС выявило разнонаправленный характер изменений - содержание IFN-? в сыворотке крови достоверно превышало показатели, характерные для группы здоровых новорожденных, в то время как содержание IFN-? было достоверно ниже по сравнению со здоровыми.

Обнаруженный низкий уровень IFN-? у новорожденных с МАС, по-видимому, свидетельствует о неполноценности этого защитного механизма и служит одной из причин частого возникновения тяжелого течения перинатальных инфекций, что свидетельствует в свою очередь о необходимости сочетания проводимого лечения с коррекцией функционирования системы интерферонов.

Содержание провоспалительных цитокинов у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

IL-1? пг/мл 4,62±1,04* 9,24±1,4** 8,09±1,1*** 1,79±0,46

IL-6 пг/мл 126,13±13,01* 169,77±15,54** 56,95±6,19*** 5,26±0,95

IL-8 пг/мл 384,44±59,32* 458,02±65,76** 157,67±66,9*** 14,07±2,12

TNF-? пг/мл 18,25±5,66* 46,62±8,8** 28,49±3,42*** 8,98±1,17

IFN- ? пг/мл 4,35±1,02* 5,16±0,73 5,43±0,75 11,28±0,4

IFN- ? пг/мл 27,26±7,05* 11,82±2,44** 8,75±1,48*** 3,95±1,21

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

В процессе динамического наблюдения за новорожденными с МАС, установлено, что сывороточные уровни провоспалительных цитокинов IL-1?, IL-6, IL-8, TNF-? достоверно повышались к 3-5 суткам, а к 20-м суткам заболевания происходило достоверное снижение IL-6, IL-8, TNF-? по сравнению с 1-ми сутками. Примечательно, что содержание IL-1? не снижалось к 20-ым суткам заболевания, а оставалось на достоверно высоком уровне по сравнению с 1-ми сутками наблюдения.

Как показали наши исследования, концентрация IFN- ? достоверно снижалась в динамике наблюдения.

Таким образом, сохраняющаяся высокая концентрация провоспалительных цитокинов является неблагоприятным фактором, отражающим активность и тяжесть патологического процесса.

Нами было установлено, что TGF-? был достоверно повышен в группе новорожденных с МАС по сравнению с аналогичным показателем группы контроля, который в противовес провоспалительным цитокинам, супрессирует иммунный ответ путем деактивации моноцитов (табл. 4). В динамике наблюдения отмечено его достоверное снижение.

Нами впервые обнаружено достоверное снижение хемокина RANTES у новорожденных с МАС по сравнению со здоровыми новорожденными, что свидетельствует о его низкой активности при респираторной патологии, обусловленной МАС. Сниженная секреция RANTES, возможно отражает дисфункцию эндотелиальных клеток. Вместе с тем, у этих детей отмечено достоверное повышение данного хемокина во все сроки динамического наблюдения.

Таблица 4

Содержание TGF-?, RANTES, GM-CSF, NO у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

TGF-? пг/мл 11526,34±1174,23* 8116±816** 5522,57±368,17*** 2754,21±161,33

RANTES пг/мл 12326,37±1418,95* 16440±1402,11* 22054,28±1586,79*** 35486±2045,85

GM-CSF пг/мл 0,06±0,03* 0,04±0,02** 1±0,08*** 2,23±0,16

NO ммоль/л 8,81±0,82* 5,33±0,46** 13,54±0,59*** 18,52±0,68

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

Анализ содержания ростового GM-CSF показал, что у новорожденных с МАС отмечалось достоверное снижение данного ростового фактора по сравнению с группой здоровых новорожденных. Значительное снижение содержания GM-CSF в сыворотке крови у новорожденных с МАС коррелирует с высокими значениями апоптоза лимфоцитов (rs= 0,64, p=0,03).

Анализируя содержание оксида азота (NO), нам удалось установить, что у новорожденных с МАС по сравнению с группой здоровых новорожденных выявлено достоверное снижение NO в сыворотке крови. По-видимому, в условиях системного воспаления без присоединения инфекционного процесса, не происходит повышение синтеза индуцибельной NO-синтазы, и соответственно не возрастает уровень NO в крови.

В динамике наблюдения отмечается достоверное снижение GM-CSF и NO на 3-5 сутки и достоверное повышение на 20-ые сутки наблюдения относительно первых суток.

В настоящее время изучение механизмов врожденного иммунитета стало одной из главных задач клинической иммунологии (Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А. Сидорович И.Г., 2002; Lewis D.B., 2001). К системе врожденного иммунитета относят рецепторы семейства TLR (Taylor М.E. et al., 1990; Меджидов Р., Джаневей Ч., 2004). Экспрессируемые фагоцитами рецепторы семейства TLR способствуют вовлечению в процесс элиминации инфекции приобретенного звена иммунитета (Малиновская В.В., Дмитриева Е.В., Паршина О.И. и соавт., 2009). Паттерны, распознаваемые TLR, описаны у многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, ряда оболочечных вирусов, некоторых грибов и отдельных простейших (Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А. Сидорович И.Г., 2002; Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С. и соавт., 2008).

У новорожденных с МАС выявляется статистически обоснованное снижение экспрессии CD14 , TLR-2 (CD14 CD282 ) и TLR-4 (CD14 CD284 ) в сравнении со здоровыми новорожденными, а также на 3-5-е и 20-е сутки динамического наблюдения (табл. 5).

Следствием снижения уровня экспрессии на моноцитах рецепторов, распознающих патоген, может стать отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов, персистенция инфекции и хронизация процесса.

Таким образом, снижение экспрессии и функции TLR у новорожденных с МАС способствует усугублению иммунной дисфункции, на фоне которой могут, присоединятся инфекционно-воспалительными заболеваниями (Sabroe I., Read R.C., Whyte M.K.B. et al., 2003).

В нашем исследовании у новорожденных с МАС отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3-CD16 56 ) (в 3,7 раза) и T-NK(CD3 CD16 56 ) (в 4,1 раза) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных, а также на 3-5-е сутки по сравнению с первыми сутками.

Таблица 5

Показатели врожденного иммунитета у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

CD14 % 74,35±1,89* 65,53±1,46** 65,51±1,43*** 89,55±0,45

CD14 CD282 % 54,98±0,78* 53,58±0,69** 53,3±0,83*** 78±0,67

CD14 CD282 109/л 0,53±0,1* 0,36±0,06** 0,56±0,1 0,78±0,03

CD14 CD284 % 44,11±0,98* 43,1±0,8** 42,89±0,7*** 65,05±0,7

CD14 CD284 109/л 0,42±0,07* 0,29±0,04** 0,45±0,08 0,65±0,02

CD3-CD16 56 % 1,98±0,22* 1,48±0,14** 2,09±0,14 7,44±0,31

CD3-CD16 56 109/л 0,05±0,01* 0,04±0,01 0,06±0,01 0,25±0,01

CD3 CD16 56 % 0,61±0,04* 0,37±0,03** 0,54±0,06 2,52±0,06

CD3 CD16 56 109/л 0,014±0,002* 0,01±0,001 0,02±0,002 0,08±0,002

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

В целом, дефицит натуральных киллеров свидетельствует об участии этих клеток в иммунопатологических процессах у новорожденных с МАС, низкой резистентности иммунной системы новорожденного к инфекции, в первую очередь вирусной.

Важнейшими рецепторами поверхностной мембраны моноцитов являются Fc- рецепторы, способные связывать иммунные комплексы и тем самым облегчать фагоцитоз патогенных агентов, которые соединились со специфическими антителами против их антигенов.

Анализ экспрессии CD14 CD64 и CD14 CD35 показал, что у новорожденных с МАС отмечалось достоверное снижение абсолютного и относительного содержания данных рецепторов, CD14 CD35 в 2,9 раза, а CD14 CD64 в 1,4 раза, что свидетельствует о неэффективном хемотаксисе и фагоцитозе (табл. 6).

Важную роль в иммунной регуляции играют молекулы межклеточного взаимодействия - молекулы адгезии, обеспечивающие клеткам способность к миграции, что способствует более эффективному взаимодействию с клетками-мишенями.

Показатели функциональной активности моноцитов у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

CD14 CD11b % 17,48±0,96* 13,81±0,77** 14,39±0,97 42,44±1,11

CD14 CD11b 109/л 0,1±0,02* 0,07±0,01 0,09±0,01 0,42±0,02

CD14 CD11с % 16,95±0,94* 13,76±1,04** 14,69±0,86 30,15±0,55

CD14 CD11с 109/л 0,1±0,02* 0,07±0,01 0,09±0,01 0,3±0,01

CD14 CD54 % 8,58±1,14* 8,36±0,82 9,49±0,8 32,63±0,87

CD14 CD54 109/л 0,05±0,01* 0,05±0,01 0,06±0,01 0,32±0,01

CD14 CD64 % 29,36±1,99* 25,91±1,24 26,86±1,49 41,81±0,82

CD14 CD64 109/л 0,15±0,03* 0,13±0,03 0,18±0,04 0,42±0,02

CD14 CD35 % 12,35±1,47* 11,59±0,98 12,67±1,32 36,63±0,61

CD14 CD35 109/л 0,07±0,01* 0,05±0,01 0,08±0,02 0,36±0,01

CD14 CD69 % 22,43±0,64* 29±0,67** 24,12±0,63 15,47±0,66

CD14 CD69 109/л 0,13±0,02* 0,16±0,03** 0,16±0,02 0,15±0,01

CD14 CD71 % 23,55±0,83* 30,01±0,94** 24,52±0,98 17,47±0,37

CD14 CD71 109/л 0,14±0,02* 0,17±0,03 0,16±0,02 0,18±0,01

CD14 HLA-DR % 64,68±0,82* 46,35±1,36** 51,67±0,78*** 86,07±0,92

CD14 CD16 % 7,24±0,17* 11,05±0,33** 11,84±0,31** 5,51±0,15

CD14 CD16 109/л 0,06±0,01 0,07±0,01 0,09±0,01 0,06±0,003

CD16 CD11b % 1,82±0,19* - - 4,41±0,08

CD16 CD11b 109/л 0,02±0,01* - - 0,04±0,002

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Анализируя полученные данные, нами было установлено, что у новорожденных с МАС в периферической крови достоверно снижено содержание моноцитов, экспрессирующих маркеры адгезии CD14 CD11b , CD14 CD11c , CD14 CD54 , в том числе и на естественных киллерах CD16 CD11b по сравнению с группой контроля.

К 3-5-м суткам было достоверно снижено содержание CD14 CD11b , CD14 CD11c по сравнению с 1-ми сутками наблюдения. Снижение адгезионных свойств моноцитов связано со снижением их функциональной активности.

У новорожденных с МАС по сравнению со здоровыми новорожденными, была достоверно снижена экспрессия HLA-DR на моноцитах, а также на 3-5-е и 20-е сутки по сравнению с 1-ми сутками наблюдения, что свидетельствовало о дезактивации моноцитов.

При снижении экспрессии CD14 HLA-DR увеличивается риск развития и хронизации инфекционно-воспалительных процессов.

Изучая экспрессию CD14 CD95 , мы наблюдали достоверное повышение относительного количества моноцитов, экспрессирующих этот рецептор по сравнению с группой здоровых детей (табл. 7). Так, на 3-5-е сутки динамического наблюдения по сравнению с 1-ми сутками, было выявлено достоверное увеличение экспрессии CD14 CD95 , что свидетельствовало о высокой готовности моноцитов к апоптозу.

Кроме того, по результатам аннексинового теста повышалось количество моноцитов вступивших в ранний и поздний апоптоз (Annexin V и Annexin V PI ) по сравнению с группой контроля, а также на 3-5-е сутки динамического наблюдения.

Показатели апоптоза моноцитов у новорожденных детей с МАС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=155 n=155 n=155 n=38

CD14 CD95 % 26,56±0,8* 40,86±0,89** 28,78±0,71 17,5±0,44

CD14 CD95 109/л 0,21±0,02 0,23±0,02 0,23±0,02 0,18±0,01

Annexin V % 21,45±0,71* 30,92±0,91** 19,39±0,42 13,24±0,27

Annexin V PI % 2,34±0,11* 3,9±0,17** 2,02±0,05 0,97±0,06

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Таким образом, выраженная гибель циркулирующих моноцитов у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации может являться лабораторным критерием развития количественных и функциональных нарушений в системе иммунитета.

Для новорожденных с МАС оказалось характерным достоверное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов по показателям фагоцитарного индекса (Фи) (43,71±1,05% против 79,65±0,69% и 24,23±1,81% против 70,05±0,92%) и фагоцитарного числа (Фч) (4,6±0,16% против 10,6±0,22% и 3,12±0,27% против 10,01±0,19%), которое сочеталось со снижением кислородзависимого (НСТ-тест) механизма микробицидности (р<0,05).

При анализе динамики показателей иммунной системы нами было установлено, что у новорожденных с МАС в динамике наблюдения не происходит нормализации большинства параметров врожденного и адаптивного иммунитета. Специфические изменения в дыхательной системе сочетаются с дисфункцией иммунной системы. Обнаруженная диссоциация иммунного ответа, по-видимому, отражает функциональную незрелость самой иммунной системы, но, с другой стороны, диктует новый подход при решении вопроса о целесообразности проведения и выбора средств иммунотропной терапии.

Нами были проведены исследования иммунного статуса у 12-ти новорожденных с МАС, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных.

Общеизвестно, что одним из важных механизмов регулирования иммунной системы является апоптоз. Ассоциированный с мембраной клетки Fas-рецептор (CD95) является ключевой молекулой, опосредующей апоптоз, а Fas-опосредованный апоптоз лимфоцитов является важнейшим механизмом регуляции иммунного гомеостаза (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Выявленное нами достоверное увеличение содержания CD95 - лимфоцитов и моноцитов периферической крови иллюстрировало повышенную готовность CD3 CD95 и CD14 CD95 к апоптозу у новорожденных с МАС, осложненных сепсисом (табл. 8).

Число клеток, экспрессирующих CD95 , достоверно увеличивалось по мере утяжеления процесса на 3-5-е сутки наблюдения.

Нами установлено, что у новорожденных с МАС по сравнению с группой здоровых новорожденных, достоверно увеличено содержание лимфоцитов и моноцитов периферической крови, находящихся в состоянии раннего Annexin V и позднего Annexin V PI апоптоза. Высокий уровень экспрессии Annexin V и Annexin V PI на лимфоцитах и моноцитах коррелировал с низким содержанием GM-CSF (rs=0,52, p=0,04).

Таким образом, в условиях чрезмерной гибели лимфоцитов и моноцитов, иммунная система не может выполнять свою главную функцию осуществления иммунологического надзора, что приводит к развитию гнойно-септических осложнений и усугубляет синдром полиорганной недостаточности.

Обнаруженная закономерность позволила нам предложить для клинической практики новый способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных детей с МАС, основанный на определении уровня экспрессии Annexin V на моноцитах в периферической крови. (Патент на изобретение «Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС» №2374646 от 27.11. 2009 г). Уровень экспрессии Annexin V на моноцитах равный 17,4% или более позволяет диагностировать у новорожденных с респираторными нарушениями септическое осложнение с чувствительностью 90,91% и специфичностью 89,55%.

Таблица 8

Показатели апоптоза лимфоцитов и моноцитов у новорожденных детей с МАС, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Показатель 1-е сутки 3-5-е сутки 20-е сутки (исход заболевания) Здоровые n=12 n=12 n=12 n=38

CD3 CD95 % 6,55±1,69* 12,82±2,15** 11,4±2,9*** 2,27±0,18

CD3 CD95 109/л 0,22±0,12* 0,36±0,16 0,35±0,12 0,08±0,01

CD14 CD95 % 24,72±2,93* 47,07±3,17** 28,37±1,99 17,5±0,44

CD14 CD95 109/л 0,25±0,07 0,42±0,21 0,38±0,14 0,18±0,01

Annexin V % (лф) 10,13±2* 20,33±3,29** 14,66±4,85*** 3,87±0,13

Annexin V PI % (лф) 0,73±0,33* 2,09±0,69** 1,44±0,76*** 0,15±0,01

Annexin V % (мн) 24,13±2,35* 40,9±3,19** 19,97±1,33*** 13,24±0,27

Annexin V PI % (мн) 2,26±0,27* 5,1±0,74** 2,1±0,18 0,97±0,06

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода p<0,05 (критерий Вилкоксона).

Основная задача системы врожденного иммунитета - обнаружение инфекционного агента с помощью патогенраспознающих рецепторов. Анализируя содержание TLR нам удалось установить, у новорожденных с МАС осложненных бактериальным сепсисом выявлено достоверное снижение экспрессии TLR-2 (CD282 ) и CD14 на моноцитах периферической крови по сравнению со здоровыми новорожденными (табл. 9).

В процессе динамического наблюдения на 3-5-е сутки происходило достоверное увеличение экспрессии TLR-2 (CD282 ) по сравнению с 1-ми сутками, но при этом происходило достоверное снижение экспрессии CD14 . На 20-е сутки заболевания наблюдалось незначительное снижение экспрессии TLR-2 (CD282 ) по сравнению с 3-5-ми сутками и увеличение экспрессии CD14 по сравнению с 3-5-ми сутками. Интересно отметить, что по TLR-4 (CD284 ) значимых отличий между 1-ми, 3-5-ми сутками и 20-ми сутками не получено, уровень экспрессии соответствовал возрастной норме.

Таким образом, при