Вплив дії кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю, 1,2 – пропандіолу, 2,3 – бутандіолу, 2-метоксіетанолу, композицій при низькотемпературній консервації сперми півнів на перебіг цитофізіологічних процесів у сперміях. Технологія кріоконсервації.
При низкой оригинальности работы "Підвищення життєздатності кріоконсервованих статевих клітин півнів", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
У теперішній час у селекційно - племінній роботі, при збереженні генофонду рідкісних порід курей використовують декілька технологій низькотемпературної консервації сперми півнів, які забезпечують одержання заплідненості яєць на рівні 60-90% (Артеменко О.Б., 2002; Hammerstedt R.H. Зазвичай, лише 30-50% сперміїв від їх загальної кількості зберігають здатність до запліднення після низькотемпературної консервації. Тому при використанні деконсервованої сперми півнів для одержання задовільних результатів за заплідненістю яєць потрібно вводити у статеві шляхи курей у 10-15 разів більше сперміїв, а також частіше (два рази на тиждень замість одного у 5-7 діб) проводити осіменіння (Каримов К.К., 1979; Курбатов и др., 1988; Lake P.E., 1986; Sexton T.J., 1981). Для досягнення цієї мети необхідно було провести більш глибокі дослідження цитофізіологічних процесів, що відбуваються у спермі поза межами організму і при її технологічній обробці для тривалого зберігання. Вивчити вплив дії кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю, 1,2 - пропандіолу, 2,3 - бутандіолу, 2-метоксіетанолу, а також їх композицій при низькотемпературній консервації сперми півнів на перебіг цитофізіологічних процесів у сперміях.Сперму одержували методом масажу абдомінальної області, для досліджень використовували розділені суміші еякулятів декількох півнів. Визначення кількості сперміїв з цілими і ушкодженими мембранами голівок (у відсотках) здійснювали за допомогою флуориметра згідно відомого метода (Терещенко А.В., 1988), з використанням флуорохрому етідіум броміду (2,7 - діаміно-10-етил-9-фенілфенантрідіум бромід). Оцінку якості сперми півнів за кількістю цілих та ушкоджених мембран голівок та акросом (у відсотках) визначали за допомогою експрес-методу (Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., 1987) з використанням суміші флуорохромів етідіум броміду та тіазинового червоного. При вивченні захисної дії та токсичності кріопротекторів на статеві клітини півнів сперму розбавляли середовищем з кріопротектором у співвідношенні 1:1, у якості контролю використовували кріопротектор диметилформамід (ДМФ). Експерименти проводились за принципом ізотермічності у двох напрямках: 1) кріопротектори вводили у складі середовища при температурах 5-10; 15-20; 25-30 та 35-40°С, нативну сперму доводили до тієї ж самої температури - одноразове розбавлення; 2) нативну сперму доводили до відповідної температури та розбавляли середовищем, яке мало таку ж саму температуру у діапазонах 5-10; 15-20; 25-30 та 35-40°С, потім охолоджували до 4°С та розбавляли вдруге середовищем, яке містить певний кріопротектор при температурі 4°С - дворазове розбавлення.При проведенні досліджень по відбору менш цитотоксичних кріозахисних сполук, визначенні їх оптимальної концентрації, співвідношення, температури та моменту введення, встановлено, що з вивчених 5 кріопротекторів та їх 27 композицій у різних співвідношеннях, більш перспективною за впливом на рухливість та морфологічну цілісність сперміїв є суміш кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю та 1,2 - пропандіолу у співвідношенні 1:1:1. Встановлено, що суміші двох та трьох кріопротекторів диметилформаміду з етиленгліколем та 1,2 - пропандіолом вірогідно менше пошкоджують спермії на етапі еквілібрації у порівнянні з використанням кожного з них окремо. Відмічено, що при використанні диметилформаміду основними морфо - функціональними пошкодженнями у сперміїв були круглі акросоми (70%), залами хвостової частини (20%), етиленгліколю - залами шийки (40%) та хвоста (40%). Використання сумішей кріопротекторів дозволило знизити рівень пошкоджень кожного з кріопротекторів на 20-30%, у порівнянні з групами, де був використаний окремо взятий кріопротектор. Відмічено, що показники загальної морфологічної цілісності сперміїв при дворазовому розбавленні на 15-30% вище, ніж при одноразовому розбавленні у всіх інтервалах температур (табл.Внаслідок проведених досліджень по вивченню цитофізіологічних процесів, які відбуваються у спермі півнів при використанні нового захисного середовища, нової кріопротекторної суміші, удосконалених прийомів підготовки статевих клітин до заморожування, суттєво підвищена результативність технології низькотемпературної консервації сперми півнів. Комплексне застосування розроблених нами технічних рішень забезпечує одержання у розмороженій спермі не менш 64,5% життєздатних сперміїв, що на 14,5 - 30,0% більше, ніж досягається в інших відомих технологіях кріоконсервації сперми півнів. Це середовище забезпечує високу життєздатність сперми півнів до заморожування, а також має високу кріозахисну активність при додаванні до неї кріопротектора в оптимальній концентрації. При розробці нової кріопротекторної суміші встановлено, що диметилформамід викликає в основному пошкодження акросом сперміїв півнів, 1,2 - пропандіол та 2,3 бутандіол - мембран голівок сперміїв, етиленгліколь - шийок і хвостів сперміїв, 2-метоксіетанол - морфо-функціональні ушкодження хвостів. Після цього сперму необхідно ще раз розбавити у співвідн
План
Основний зміст роботи
Вывод
При проведенні досліджень по відбору менш цитотоксичних кріозахисних сполук, визначенні їх оптимальної концентрації, співвідношення, температури та моменту введення, встановлено, що з вивчених 5 кріопротекторів та їх 27 композицій у різних співвідношеннях, більш перспективною за впливом на рухливість та морфологічну цілісність сперміїв є суміш кріопротекторів диметилформаміду, етиленгліколю та 1,2 - пропандіолу у співвідношенні 1:1:1.
Встановлено, що суміші двох та трьох кріопротекторів диметилформаміду з етиленгліколем та 1,2 - пропандіолом вірогідно менше пошкоджують спермії на етапі еквілібрації у порівнянні з використанням кожного з них окремо. При цьому до 70-75% клітин залишаються морфологічно цілими, деякі результати цих експериментів надані у табл. 1.
Крім того, спермії мали більш високу рухливість та живучість у присутності вивчених сумішей, у тому числі при 10% кінцевій концентрації (ДМФ ЕГ 1,2 - ПД (1:1:1) - 170±6%), у порівнянні з контролем (ДМФ - 75±7%).
Таблиця 1. Дія концентрації кріопротекторів та їх сумішей на життєздатність сперміїв півнів
Група Кріопротектори та їх суміші Співвідношення Концентрація, % Кількість морфологічно цілих клітин, %, п = 12 Рухливість, бали, п = 9
до заморожування після заморожування-відтавання до заморожування після заморожування-відтавання
Вивчено вплив кріопротекторів та їх сумішей на різні органели сперміїв півнів. Відмічено, що при використанні диметилформаміду основними морфо - функціональними пошкодженнями у сперміїв були круглі акросоми (70%), залами хвостової частини (20%), етиленгліколю - залами шийки (40%) та хвоста (40%). Набряк голівок, порушення цілісності їх мембран у значній мірі (60-70%) спостерігаються при використанні 2,3 - бутандіолу й 1,2 - пропандіолу. Потовщення у межах хвоста, залами та закручування хвостів (70%) здебільшого спостерігаються при використанні 2-метоксиетанолу. Використання сумішей кріопротекторів дозволило знизити рівень пошкоджень кожного з кріопротекторів на 20-30%, у порівнянні з групами, де був використаний окремо взятий кріопротектор. Це підтверджує перспективність використання та подальшого вивчення сумішей кріопротекторів у процесі кріоконсервації сперми птиць та півнів зокрема.
З метою оптимізації умов підготовки сперми до заморожування проведені дослідження по визначенню впливу температури розбавлення сперми середовищем та введення у неї кріопротектора на різні органели сперміїв, а також на загальну морфологічну цілісність рухливість і живучість (табл. 2).
Таблиця 2. Дія температури розбавлення на життєздатність сперміїв півнів
Група Температура розбавлення,°С Показник живучості при 4°С, ум. од., п = 3 Кількість сперміїв з морфологічно цілою структурою тіла, %, п =12 цілими мембранами голівок, %, п = 9
Захисне середовище містить кріопротектор ДМФ у кінцевій концентрації 7%
За показниками загальної морфологічної цілісності та збереженістю мембран голівок сперміїв одноразове розбавлення у всіх інтервалах температур ефективніше при використанні суміші трьох кріопротекторів. Обґрунтована необхідність використання одноразового розбавлення при низьких температурах, а саме від 5 до 10°С. Дворазове розбавлення, коли кріопротектор додається при 4°С, слід використовувати при температурах: 15-20, 25-30°С. Відмічено, що показники загальної морфологічної цілісності сперміїв при дворазовому розбавленні на 15-30% вище, ніж при одноразовому розбавленні у всіх інтервалах температур (табл. 3).
Визначено, що як при одноразовому, так і при дворазовому розбавленні в інтервалі температур від 5 до 10°С, основними пошкодженнями є закручування та залами хвостів сперміїв. З підвищенням температури розбавлення від 15 до 30°С в основному пошкоджуються голівки сперміїв. При одноразовому розбавленні при температурах 35-40°С в основному пошкоджується рушійний апарат сперміїв. При використанні ДМФ у якості кріопротектора при дворазовому розбавленні спостерігається великий процент пошкодження акросом сперміїв, які приймають круглу форму. Це відмічається у всіх інтервалах температур, процент акросомальних пошкоджень збільшується з підвищенням температури.
Таблиця 3. Залежність життєздатності сперміїв півнів від температури розбавлення сперми з введенням у неї кріопротектора при 4°С
Група Температура розбавлення,°С Показник живучості при 4°С, ум. од., п = 3 Кількість сперміїв з морфологічно цілою структурою тіла, %, п = 9 цілими мембранами голівок, %, п = 9
Проведені дослідження підтвердили та обґрунтували застосування дворазового розбавлення сперми при 20-25°С та введенні кріопротектора при температурі 4°С.
Внаслідок проведених нами досліджень по вивченню впливу солей натрію на спермії півнів було визначено, що найкраща збереженість сперміїв спостерігається у розчинах сульфату, ацетату та глутамату натрію.
У процесі роботи розроблено і вивчено вплив 20 експериментальних середовищ у порівнянні зі стандартним середовищем ІП на цитофізіологічні процеси, які відбуваються у спермі півнів при її розбавленні.
Вивчено вплив різних хімічних речовин, які входять до складу середовищ та їх співвідношення на органели сперміїв. Внаслідок проведених досліджень, встановлено, що присутність у середовищі сульфату натрію призводить до збільшення пошкоджень акросом сперміїв, у порівнянні з глутаматом натрію, але позитивно впливає на морфо-функціональну збереженість хвостів. Знаходження у середовищі сульфату цинку сприяє збільшенню кількості сперміїв з неушкодженими акросомами, але негативно впливає на цілісність хвостів. Присутність у середовищі сульфату магнію сприяє збереженню акросом і цілісності мембран голівок, ацетату натрію викликає порушення морфо-функціональної цілісності хвостів, ацетату магнію негативно впливає на мембрани голівок, оксиду ванадію (V) сприяє зменшенню кількості пошкоджених мембран голівок сперміїв, але викликає пошкодження акросом сперміїв півнів. Власне іони Mn2 позитивно впливають на збереженість акросом та рухливість сперміїв, а Mg2 лише на їх рухливість. При введенні до складу середовища полівінілпірролідону та протамін сульфату зменшується кількість клітин з пошкодженими мембранами голівок.
На підставі одержаних результатів розроблено середовище «Д», такого складу (г/100 мл Н2O): глутамат натрію - 1,90, фруктоза - 0,50, інозит - 0,25, ацетат магнію - 0,07, ацетат калію - 0,50, полівінілпірролідон (М.м. 12000) - 0,20, протамін сульфат - 0,028, V2O5 - 0,07, MNSO4 - 0,07. Осмотичність 365МОСМОЛЬ; РН 6,7.
Вивчено вплив глутамату натрію на збереженість сперміїв півнів у двох концентраціях, які найчастіше використовуються у поживних середовищах - 1,9 та 2,8%. Визначено, що найкраща збереженість сперміїв спостерігається при розбавленні сперми середовищем ІП-1 (48,33±6,75), та середовищем «Д» (42,33±4,02), які містять глутамат натрію у концентрації 1,9%, у порівнянні з середовищем ІП (26,50±5,54).
На заключному етапі ми вивчали вплив кращих експериментальних кріозахисних середовищ, ступеня розбавлення сперми, кріопротекторів та їх сумішей на запліднюючу здатність сперміїв, які підтвердили перспективність їх використання для підвищення збереженості сперміїв у процесі кріоконсервації. Це дозволило вірогідно підвищити життєздатність сперміїв півнів до 64,5%, у порівнянні з контролем.
Встановлено, що дворазове розбавлення сперми середовищем у співвідношенні 1:1:2 дозволяє не тільки підвищити збереженість сперміїв після заморожування-відтавання, у порівнянні з дворазовим розбавленням у співвідношенні 1:1:1, але і збільшити кількість спермодоз, що має велике значення при нестачі нативного матеріалу нечисленних та зникаючих порід курей.
При визначенні цитофізіолгічного стану й запліднюючої здатності сперми півнів особливо важливим є обєктивна оцінка її якості. Згідно одержаних результатів ні рухливість, ні живучість, ні визначення цілісності мембран голівок не дають обєктивної інформації про фізіологічний стан і запліднюючу здатність статевих клітин півнів.
Розроблений нами метод оцінки якості нативної та кріоконсервованої сперми півнів згідно одержаних даних більш корелює з заплідненістю яєць, ніж інші існуючи методи. Для здійснення розробленого нами метода на предметне скло наносили 3?l сперми півнів, яка була розбавлена захисним середовищем для сперми півнів у співвідношенні 1:1, додавали 12?l барвника (робочий розчин складається з суміші родаміну С - 0,05% та малахітового зеленого - 0,08%, який приготовлений на аналогічному захисному середовищі для сперми півнів), витримували протягом 1 хвилини мазок та висушували. Оцінку цілісності сперміїв проводили під мікроскопом при збільшенні 90?15 з масляною імерсією. Підраховували 100 сперміїв і фіксували процентне співвідношення цілих і пошкоджених, а також відмічали пошкодження, які найчастіше зустрічаються.
При цьому забарвленні акросоми мали малиново-червоний колір, голівки синьо-зелений, середня частина та хвости теж малиново-червоний колір. Ця методика дозволяє визначити практично всі морфологічні пошкодження сперміїв, які впливають на їх запліднюючу здатність: порушення форми акросоми, її злам; здуття голівки, безформові, гігантські та карликові форми голівок, вигнуті та здуті у середній частині; залами хвоста, спіральне або петлеподібне закручування хвоста, відсутність його, присутність цитоплазматичної краплини і таке інше. При цьому цей метод достатньо простий у використанні, не потребує спеціального обладнання, дозволяє робити зразки в умовах птахоферм, дозволяє накопичувати та архівувати зразки.
Таким чином, нами вперше вивчено вплив 27 композицій кріопротекторів на морфо-функціональну цілісність статевих клітин півнів та їх кріозахисна активність у процесі кріоконсервації. Визначені перспективні речовини та їх суміші для використання їх у якості кріопротекторів при заморожуванні сперми півнів. Розроблено і вивчено вплив 20 експериментальних середовищ на збереженість морфо - функціональної цілісності різних органел статевих клітин півнів. Визначена та обґрунтована оптимальна температура та ступінь розбавлення сперми й введення у неї кріопротектора. На підставі одержаних результатів удосконалена технологія кріоконсервування сперми півнів, яка дозволяє збільшити кількість життєздатних сперміїв до 64,5% після кріоконсервації.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
