Підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини за допомогою CрG ДНК з Bacillus subtilis (експериментальні дослідження) - Автореферат

Традиційні підходи до лікування досить часто, на жаль, виявляються недостатньо ефективними і супроводжуються значними побічними ефектами, що спричиняє постійний пошук додаткових засобів і стратегій, спрямованих на більш ефективне лікування. Однак, низька імуногенність більшості антигенів пухлинних клітин, а також поява і накопичення в організмі онкологічного хворого низки порушень регуляторних і ефекторних систем імунобіологічного нагляду зумовлюють необхідність пошуку шляхів підвищення ефективності протипухлинних вакцин, яке здійснюється шляхом різноманітних модифікацій пухлинних антигенів, використання штучних генних конструкцій та різноманітних адювантів (Vogel F.R., 1995; MCCLUSKIE M.J., Weeratna R.D., 2001; Коростелев С.А., 2003; Berzofsky J.A. et al., 2004; Stevenson F.K., 2005). Саме цій проблемі присвячена дана робота, яка мала за мету розробку нового адюванта на основі ДНК бактеріального походження та дослідження його імунобіологічних і протипухлинних властивостей як при самостійному застосуванні, так і у поєднанні з протипухлинною глікопептидною вакциною. Кавецького НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, за темами: „Розробити нові підходи до підвищення ефективності протипухлинних вакцин” (2001-2003 рр., державний реєстраційний № 0101U000784); „Визначення ролі адювантів та імуномодуляторів в реалізації дії протипухлинних вакцин” (2004-2006 рр., державний реєстраційний № 0104U000589) та „Особливості функціонування онкогеному” (2002-2006 рр., державний реєстраційний № 0102U003228). Громашевського АМН України за темою: „Вивчити молекулярно-біологічні особливості збудників опортуністичних інфекцій бактеріальної природи, стійких до антибіотиків, у хворих на СНІД” (2002-2004 рр., державний реєстраційний № 0102U000571).Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: частота прищеплюваності пухлин; середня тривалість життя (СТЖ) мишей; обєм (у мм3) і маса (у г) пухлинного вузла; частота та інтенсивність метастазування; швидкість росту метастазів. У роботі було використано два штами бактерії Bacillus subtilis (B. subtilis 7025 і B. subtilis GP1-807-03), з культуральної рідини (КР) якої було ізольовано ДНК-вмісні фракції за стандартною схемою виділення плазмідної ДНК із застосуванням поліетиленгліколю 6000 з подальшою преципітацією у 70% етанолі (Маниатис Т. и соавт., 1984). За допомогою електрофорезу у ПААГ показано, що фракції ДНК, виділені з КР на 9-ту добу культивування обох штамів B. subtilis, є подібними і містять два найбільш виражені і постійні компоненти з величиною молекул 2650 та 3050 пар нуклеотидів (рис. Всі фракції ДНК, отримані з КР протягом 10 діб культивування B. subtilis GP1-807-03, виявились досить чутливими до дії НРАІІ, однак найбільша чутливість ізольованої бактеріальної ДНК до НРАІІ, а отже і збільшення вмісту неметильованих CG-динуклеотидів у її складі, спостерігалися на 7-9-ту добу культивування. На 2-гу добу після введення бактеріальної CPG ДНК клітинність перитонеального змиву досягала пікових значень - 35,5±4,5?106 клітин, а починаючи з 4-ї доби - починала знижуватись, досягаючи показників норми на 12-ту добу спостереження (7,5±0,7?106 клітин) (рис.Ідентифіковано, виділено та охарактеризовано позаклітинну ДНК з культуральної рідини Bacillus subtilis; визначено оптимальну тривалість культивування штаму B. subtilis GP1-807-03, яка сприяє максимальному виходу позаклітинної ДНК, збагаченої на залишки неметильованого цитозину. Показано, що введення експериментальним тваринам CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis, на відміну від ДНК хребетних, викликає зміни в лімфоїдних органах, які полягають у збільшенні їх маси та клітинності і мають транзиторний характер. CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis здатна підвищувати функціональну активність клітин-ефекторів неспецифічного імунітету (макрофагів і природних кілерних клітин) та індукувати інтерферони б і г при застосуванні in vitro та in vivo. Спектр імунологічних ефектів CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis включає активуючий вплив на клітинні і гуморальні реакції адаптивного імунітету: CPG ДНК підвищує гіперчутливість сповільненого типу на введення гетерологічного антигену, а також специфічну цитотоксичність сироватки крові мишей. На різних моделях пухлинного росту показано, що застосування CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis супроводжується протипухлинним та антиметастатичним ефектами, вираженість яких може залежати від штаму пухлини, режиму застосування і способу введення CPG ДНК.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Робота присвячена проблемі імунотерапії злоякісних новоутворень, а саме створенню нового адюванта на основі CPG ДНК бактеріального походження, експериментальному дослідженню його імуномодулюючих властивостей і протипухлинної та антиметастатичної ефективності при застосуванні окремо та у поєднанні з протипухлинною глікопептидною вакциною.

1. Ідентифіковано, виділено та охарактеризовано позаклітинну ДНК з культуральної рідини Bacillus subtilis; визначено оптимальну тривалість культивування штаму B. subtilis GP1-807-03, яка сприяє максимальному виходу позаклітинної ДНК, збагаченої на залишки неметильованого цитозину.

2. Показано, що введення експериментальним тваринам CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis, на відміну від ДНК хребетних, викликає зміни в лімфоїдних органах, які полягають у збільшенні їх маси та клітинності і мають транзиторний характер.

3. CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis здатна підвищувати функціональну активність клітин-ефекторів неспецифічного імунітету (макрофагів і природних кілерних клітин) та індукувати інтерферони б і г при застосуванні in vitro та in vivo.

4. Спектр імунологічних ефектів CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis включає активуючий вплив на клітинні і гуморальні реакції адаптивного імунітету: CPG ДНК підвищує гіперчутливість сповільненого типу на введення гетерологічного антигену, а також специфічну цитотоксичність сироватки крові мишей.

5. На різних моделях пухлинного росту показано, що застосування CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis супроводжується протипухлинним та антиметастатичним ефектами, вираженість яких може залежати від штаму пухлини, режиму застосування і способу введення CPG ДНК.

6. Експериментально доведена можливість використання CPG ДНК з культуральної рідини B. subtilis в якості адюванта для підвищення ефективності протипухлинної глікопептидної вакцини.

Автор висловлює щиру подяку д.м.н., проф. Сидорику, д.б.н. А.П. Бурлаці, д.м.н. Г.П. Потебні, к.б.н. В.В. Козак, к.б.н. Ю.В. Янішу (ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України); д.м.н. С.Л. Рибалко (Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського АМН України); к.б.н. І.П. Олексієнку (Національний аграрний університет України) за надання методичної та консультативної допомоги.

1. Shlyakhovenko V.A., Olishevsky S.V., Kozak V.V., Yanish Y.V., Rybalko S.L. Anticancer and immunostimulatory effects of nucleoprotein fraction of Bacillus subtilis 7025 culture medium filtrate // Experimental Oncology. 2003. V.25, № 2. Р. 119-123. (Здобувачем особисто проведено дослідження впливу нуклеопротеїдної фракції з фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis 7025 на цитолітичну активність природних кілерних клітин, здійснено аналіз і математичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).

2. Olishevsky S.V., Kozak V.V., Yanish Y.V., Shlyakhovenko V.A. Immunostimmulatory CPG DNA in cancer vaccinotherapy // Experimental Oncology. 2003. V.25, № 2. P. 83-92. (Здобувачем особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно можливостей застосування CPG ДНК в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).

3. Olishevsky S., Kozak V., Yanish Yu., Potebnya G., Lisovenko G., Olixienko I., Mazur O., Rybalko S., Shlyakhovenko V. Characteristics of extracellular DNA containing unmethylated CPG motifs isolated from Bacillus subtilis culture medium filtrate // Experimental Oncology. 2004. V.26, № 4. P. 265-270. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, підготовлено зразки ДНК до проведення електрофорезу і проведено рестрикційний аналіз ДНК; здійснено аналіз та узагальнення результатів дослідження).

4. Olishevsky S., Shlyakhovenko V., Kozak V., Yanish Yu. Response of different organs of immune system of mice upon administration bacterial CPG DNA // Experimental Oncology. 2005. V.27, № 4. Р. 290-297. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту і виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин і визначення клітинності лімфоїдних органів, аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).

5. Олішевський С.В., Яніш Ю.В., Козак В.В., Шляховенко В.О. Вплив бактеріальної CPG ДНК на електрокінетичний потенціал клітин імунної системи мишей // Доповіді НАН України. 2005. № 11. С. 178-182. Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин та отримання імунокомпетентних клітин з лімфоїдних органів, підготовлено роботу до друку).

6. Olishevsky S, Burlaka A, Sidorik E, Shlyakhovenko V, Garpenko Yu, Kozak V. Modulation of ROS/NO production by murine peritoneal macrophages in response to bacterial CPG DNA stimulation. Exp. Oncol. 2006. V.28, № 2. Р. 114-120. (Здобувачем особисто проведено виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин, отримання імунокомпетентних клітин з лімфоїдних органів, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено роботу до друку).

7. Олішевський С.В., Козак В.В., Яніш Ю.В., Артамонова А.Б., Шляховенко В.О. Зміни в органах імуногенезу мишей, викликані бактеріальною ДНК, збагаченою неметильованими CG-динуклеотидами // Доповіді НАН України. 2006. № 3. С. 175-181. (Здобувачем особисто проведено планування схеми експерименту, виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, здійснено імунізацію тварин та визначення клітинності лімфоїдних органів, аналіз і математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).

8. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С.Л., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующая CPG ДНК: перспективы клинического применения в онкологии // Онкология. 2006. Т. 8, № 2. С. 209-217. (Здобувачем особисто підібрано і проаналізовано наукову літературу стосовно можливостей застосування CPG ДНК в імунотерапії злоякісних новоутворень, підготовлено роботу до друку).

9. Деклараційний патент на корисну модель В61Н15/00, А61К31/00, А61К35/74 № 11972. A. Україна. “Інгібітор вірусу імунодефіциту людини першого типу - бактеріальна неметильована CPG ДНК” / Рибалко С.Л., Олішевський С.В., Козак В.В., Яніш Ю.В., Завелевич М.П., Шляховенко В.О., Максименко О.В. (Україна); № 2005 07062; Заявл. 15.07.2005; Опубл. 16.01.2006: Бюл. № 1. (Здобувачем особисто проведено виділення бактеріальної ДНК з культуральної рідини B. subtilis, аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено матеріал до патентування).

10. Олішевський С.В., Шляховенко В.О., Козак В.В., Яніш Ю.В., Рибалко С.Л. Дослідження протипухлинних та імуномодулювальних властивостей нуклеопротеїдної фракції фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis 7025 // Матер. наук.-практ. конф. „Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти”, Київ (Україна), 2003 / Онкологія, 2003. Т. 5, № 2. С. 177-178.

11. Olishevsky S.V., Shlyakhovenko V.O., Kozak V.V., Yanish Y.V., Rybalko S.L. Research of immunobiological characteristics of bacterial DNA from cultural medium filtrate of Bacillus subtilis 7025 // Abstract book of Conference for young scientists, PHD students and students of molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics, NAS of Ukraine, Kyiv (Ukraine), 2003. P. 188.

12. Олішевський С.В., Шляховенко В.О., Козак В.В., Яніш Ю.В., Мазур О.В., Артамонова Г.Б. CPG ДНК мікробного походження: імуномодулюючі властивості та можливе застосування в імунотерапії пухлин // Матер. VI конф. молодих онкологів України „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, Київ (Україна), 2003. С. 45.

13. Olishevsky S., Yanish Yu., Mazur O., Kozak V., Olexienko I., Shlyakhovenko V. Bacillus subtilis can excrete DNA containing unmethylated CPG motifs with potent immunostimulatory activity // Abstract book of First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Lviv (Ukraine), 2004. P. 294.

14. Олишевский С.В., Мазур О.В. ДНК, содержащая неметилированные CPG мотивы, как адъювант для активации противоопухолевого иммунного ответа у мышей // Матер. V Української конф. молодих вчених, присвяченої памяті академіка В.В. Фролькіса, Київ (Україна), 2004. С. 134-135.

15. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Мазур О.В., Шляховенко В.А. Иммуностимулирующие нуклеотидные последовательности бактериального и грибного происхождения, содержащие неметилированные CPG-мотивы, и их возможное применение в экспериментальной иммунотерапии опухолей // Матер. 8-й Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых “Биология - наука ХХІ века”, Пущино (Россия), 2004. С. 125.

16. Олішевський С.В. Бактеріальна CPG ДНК: вплив на клітини імунної системи Мишей // Матер. Першої Міжнар. конф. студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології”, Львів (Україна), 2005. С. 195-196.

17. Олишевский С.В., Шляховенко В.А., Козак В.В., Яниш Ю.В., Мазур О.В., Рыбалко С.Л., Кот Л.Н. Иммуностимулирующая CPG ДНК как один из новых перспективных подходов к иммунотерапии злокачественных новообразований // Матер. ІІІ съезда онкологов и радиологов СНГ, Т.1, Минск (Беларусь), 2004. С. 344-345.

18. Олішевський С.В., Козак В.В., Яніш Ю.В., Рибалко С.Л., Дружина М.О., Мазур О.В., Шляховенко В.О. Бактеріальна CPG ДНК - ефективний імуноадювант в експериментальній вакцинотерапії злоякісних пухлин // Матер. І Всеукраїнської наук.-практ. конф. „Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та погляд в майбутнє”, Київ (Україна), 2004. С. 33-34.

19. Олішевський С.В., Козак В.В., Яніш Ю.В., Рибалко С.Л., Мазур О.В., Артамонова А.Б., Шляховенко В.О. CPG ДНК природного походження: нові можливості, нові перспективи // Матер. міжнар. форуму „Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля”, Київ (Україна), 2005. С. 152-154.

20. Olishevsky S., Kozak V., Yanish Yu., Rybalko S., Mazur O., Shlyakhovenko V. Bacterial CPG DNA as effective cancer vaccine adjuvant // Abstract book of 16th European Students` Conference Charite, Berlin (Germany), 2005. P. 356.

21. Олишевский С.В. Перспективы применения ДНК, обогащенной неметилированными CPG-мотивами, в иммунотерапии рака // Матер. междунар. школы-конф. молодых ученых “Системная биология и биоинженерия”, Москва (Россия), 2005. С. 152-153.

22. Олишевский С.В., Шляховенко В.А. Поиск новых иммуноадъювантов и изучение их эффективности в иммунотерапии злокачественных опухолей // Матер. ІІ наук.-практ. конф. молодих вчених та спеціалістів „Актуальні проблеми фармакології та токсикології”, Київ (Україна), 2005. С. 44.

23. Олишевский С.В. Повышение эффективности применения противоопухолевой гликопептидной аутовакцины с помощью бактериальной CPG ДНК // Матер. VII конф. молодих онкологів України „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, Київ (Україна), 2006. С. 63.

24. Олішевський С.В., Шляховенко В.О., Мазур О.В., Козак Ю.В., Яніш Ю.В. Протипухлинні вакцини та адюванти: експериментальні дослідження і перспективи застосування в клінічній практиці. Матер. ХІ зїзду онкологів України, Судак (Україна), 2006. С. 33.