Оценка специфичности противотуберкулезных моноклональных антител в двусайтовом иммуноферментном анализе - Статья

Например, для быстрой идентификации Mycobacterium tuberculosis complex применяются иммунохроматографические тесты для выявления антигена MPT64 в микробиологических посевах на селективных жидких средах Мидлбрюка, в BACTEC MGIT 960 [9, С. Определение липоарабиноманнана B (LAM B) в биологических жидкостях больных туберкулезом также основано на МАТ [10, С. Например, антиген 38КДА (Psts1) входит в суперсемейство АТФ-связывающих кассетных субстрат-связывающих транспортеров, куда входят 15 различных белков [7, С. В связи с этим, выявление моноантигенов в таких сложных агрегированных комплексах как клеточная стенка микобактерий не всегда возможно, особенно в случае исследования образцов без предварительной пробоподготовки, содержащих нативный неразрушенный материал микобактерий. В исследовании были использованы антимикобактериальные моноклональные антитела, полученные прежде против цельных клеток M.tuberculosis H37Rv: 1D4 (IGG1, k), реагирующие с антигеном 7КДА; 2F9 (IGG2b, l), направленные против антигена 10КДА (CFP10); 2E11A3 (IGG2a, l), против 19КДА (Rv0009, PPIASEНа Рисунке 1 представлен иммуноблоттинг со всеми исследуемыми МАТ и антимикобактериальными иммуноглобулинами кролика. Как видно из приведенного рисунка, не все МАТ реагировали с денатурированными антигенами цельных клеток. В Таблице 1 приведены данные двусайтового иммуноферментного анализа МАТ и цельных клеток микобактерий (Таблица 1). Справа приведены молекулярные массы белков маркеров и расфракционированные в редуцирующих условиях в 12,5% ПААГ цельные клетки M.tuberculosis H37Rv. Таблица 1 - Концентрация исследуемых антигенов микобактерий (мкг/мл), реагирующих с МАТ в двусайтовом ИФАИз полученных данных видно, что МАТ распознают антигены, входящие в мультипротеиновые комплексы и мембранные комплексы, представленные не только в M. tuberculosis, но и в других нетуберкулезных микобактериях.

Моноклональные антитела давно и активно используются в диагностике туберкулеза. Например, для быстрой идентификации Mycobacterium tuberculosis complex применяются иммунохроматографические тесты для выявления антигена MPT64 в микробиологических посевах на селективных жидких средах Мидлбрюка, в BACTEC MGIT 960 [9, С. 902]. Определение липоарабиноманнана B (LAM B) в биологических жидкостях больных туберкулезом также основано на МАТ [10, С. 2280], и на их основе создан коммерческий тест. Однако, диагностическая чувствительность выявления LAM B в моче не высока и составляет по разным источникам от 25% до 95%, а специфичность до 97% [11, С. 150], [1, С. 735].

Учитывая, что микобактерии - это живой организм, следует помнить, что в большинстве случаев нативные микобактериальные белки входят в состав мультипротеиновых комплексов. Например, антиген 38КДА (Psts1) входит в суперсемейство АТФ-связывающих кассетных субстрат-связывающих транспортеров, куда входят 15 различных белков [7, С. 78]. Кроме того, в этот комплекс ABC-транспортера входят 38 белков, относящихся к мембрансвязанному домену и еще 45 к нуклеотидсвязывающему домену [3, С. 450].

Имеются и другие не менее сложные комплексы. Так в клеточной стенке микобактерий существует 7 поровых систем для секреции белков как наружу, так и в состав внешнего слоя микобактериальной клеточной стенки, которая, как известно, представляет единый липидогликопептидогликановый комплекс [5, С. 3]. Наиболее показательны PE-PPE белки, осуществляющие как метаболические функции клеточной стенки, так и являющиеся фактором вирулентости патогенных микобактерий. Из 38 известных в этом семействе белков только 7 секретируются, остальные локализуются во внешних и внутренних слоях клеточной стенки [6, С. 905]. В связи с этим, выявление моноантигенов в таких сложных агрегированных комплексах как клеточная стенка микобактерий не всегда возможно, особенно в случае исследования образцов без предварительной пробоподготовки, содержащих нативный неразрушенный материал микобактерий.

Таким образом, целью этого исследования было изучить возможность использования антимикобактериальных МАТ для специфического выявления нативных антигенов туберкулезных микобактерий в двусайтовом иммуноферментном анализе.

Материал и методы

В экспериментах применяли культуру M.tuberculosis H37Rv, а также нетуберкулезные микобактерии из коллекции ФГБНУ «ЦНИИ туберкулеза», Москва. Для получения бактерий культуру микобактерий выращивали в синтетической среде Сотона в течение 28 дней при 37ОС. 3-х кратно отмывали в PBS, ресуспендировали в небольшом объеме PBS и далее в суспензиях определяли концентрацию белка методом Брэдфорда [2, С. 250].

В исследовании были использованы антимикобактериальные моноклональные антитела, полученные прежде против цельных клеток M.tuberculosis H37Rv: 1D4 (IGG1, k), реагирующие с антигеном 7КДА; 2F9 (IGG2b, l), направленные против антигена 10КДА (CFP10); 2E11A3 (IGG2a, l), против 19КДА (Rv0009, PPIASE A, rotamase A); 1C10G10 (IGG1, k), против 20-23КДА (MPT83); 1A5 (IGG2a, l) против 24КДА; 2C2G7C6 (IGG2b, l) против 23КДА; 1D2 (IGG2b, k) против 25КДА; 2E8C2 (IGG2a, k) против 25-26КДА; 1B7 (IGG1, k) против 25-26КДА; 1F2A7(IGG2a, l) против 38КДА (PSTS-1); 1A6 (IGG2a, k) против 30КДА (ESAT6); 2F5 (IGG1, k) против полисахаридного антигена на белках с мол.массой более 30КДА; 1G4 (IGG2b, k) и 1C1 (IGG2b, k) против 38, 39, 40КДА; 1F1 (IGG2b, k) против 58, 100КДА. Кроме того, в исследовании были применены МАТ, полученные против иммуноглобулинов кролика 1C9E1 (IGG2a, k). Все МАТ созданы методом гибридомной технологии, и их специфичность в основном была в пределах M.tuberculosis complex.

Гибридомы, продуцирующие МАТ, выращивали in vitro в культуральной среде, содержащей аффинноочищенную на белках A и G фетальную сыворотку, не содержащую иммуноглобулинов крупного рогатого скота. Это позволяло очищать иммуноглобулины МАТ на этих же сорбентах с белками A и G. Для очистки фетальной сыворотки и МАТ из супернатантов культуральных жидкостей использовали иммуноаффинную хроматографию на колонках с сефарозой, ковалентносвязанной с белками A, G или L в FPLC (Pharmacia, Швеция). Эффлюаты МАТ диализовали против физраствора забуференного фосфатами (PBS), концентрировали ультрафильтрацией, после диализа добавляли 0,02% азид натрия в качестве консерванта. МАТ против иммуноглобулинов кролика 1C9E1 ковалентно конъюгировали с пероксидазой хрена методом Наканэ-Уилсона [13, С. 171].

Гипериммунную кроличью антисыворотку получали многократной иммунизацией животных цельными клетками M.tuberculosis H37Rv в неполном адъюванте Фрейнда. Очистку кроличьих иммуноглобулинов проводили на сорбенте Sepharose-CL6B с ковалентно связанными антигенами ультразвукового дезинтеграта M.tuberculosis H37Rv. Истощение полученных антимикобактериальных иммуноглобулинов от перекрестных реакций производили на сорбенте Sepharose-CL6B с ковалентно связанными иммуноглобулинами мыши. Полученный препарат концентрировали иммунофильтрацией и добавляли 0,02% азид натрия.

Спектр и активность МАТ и антимикобактериальных иммуноглобулинов кролика (АС) проверяли в иммуноблоттинге на расфракционированном в редуцирующих условиях в диск-электрофорезе в 12,5% ПААГ цельноклеточном препарате M.tuberculosis H37Rv.

Специфичность МАТ и связывающихся с ними антигенов оценивали в двусайтовом иммуноферментном анализе.

Для этого иммуноглобулины антимикобактериальных МАТ наносили на поверхность планшетов для ИФА, инкубировали в течение ночи при ЧОС, отмывали PBS - 0,001% Tween 20 (PBST), далее титровали цельноклеточную суспензию M. tuberculosis H37Rv в качестве стандарта и добавляли цельные клетки других нетуберкулезных микобактерий.

После инкубации и тщательной отмывки PBS-T наносили антимикобактериальные иммуноглобулины кролика.

Детекцию связанных в тройной комплекс МАТ-АГ-АС иммуноглобулинов кролика проводили с помощью иммунопероксидазных конъюгатов МАТ 1C9E1 против IGG кролика. Реакцию проявляли с помощью ТМБ, спектрофотометрировали при 450нм и определяли концентрацию в исследуемых образцах по стандартам.

На Рисунке 1 представлен иммуноблоттинг со всеми исследуемыми МАТ и антимикобактериальными иммуноглобулинами кролика. Как видно из приведенного рисунка, не все МАТ реагировали с денатурированными антигенами цельных клеток.

В Таблице 1 приведены данные двусайтового иммуноферментного анализа МАТ и цельных клеток микобактерий (Таблица 1).

Рис. 1 - Иммуноблоттинг антимикобактериальных МАТ с антигенами

Справа приведены молекулярные массы белков маркеров и расфракционированные в редуцирующих условиях в 12,5% ПААГ цельные клетки M.tuberculosis H37Rv. МАТ: 1- 1D4, 2- 2F9, 3- 1C10G10, 4- 1A5, 5-2C2G7C6, 6-1D2, 7- 2E8C2, 8-1B7, 9- 1A6, 10- 1F2A7, 11- 1F1, 12- 1G4, 13- 1C1, 14- 2F5, 15- антимикобактериальные иммуноглобулины кролика

Таблица 1 - Концентрация исследуемых антигенов микобактерий (мкг/мл), реагирующих с МАТ в двусайтовом ИФА

Как видно из представленной таблицы, большинство МАТ не были специфичны только в отношении M.tuberculosis и реагировали с нетуберкулезными микобактериями.

Обсуждение моноклональный антитело туберкулезный микобактерия

Для исследования были взяты МАТ против различных по молекулярной массе, специфичности и свойствам антигенов микобактерий.

Так микобактериальные белки 6КДА (ESAT-6) и 10КДА (CFP10) секретируются в раннюю фазу роста вирулентных микобактерий. Кроме того, ESAT-6 в экзосомах (мембранных везикулах), активно вырабатываемых вирулентными микобактериями. Оба белка секретируются через микобактериальную систему секреции Type VII или ESX-5 (early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) system) [5, P. 3].

Белок 19КДА (Rv009) - железо-регулируемая пептидил-пропил цис-транс изомераза A (ротомаза А), которая идентифицируется масс-спектрометрией в культуральных фильтратах, мембранной фракции и в цельноклеточных лизатах M. tuberculosis H37Rv - аналогичен белкам нетуберкулезных микобактерий. Белок необходим для in vitro роста на холестерине [12, P. 504]. Липогликопротеин MPT/MPB-83 присутствует в клеточной стенке и культуральных фильтратах M. tuberculosis и M. bovis и является агонистом TLR2, т.е. MPB83 можно рассматривать как фактор вирулентности микобактерий [4, P. 94]. Антиген 38КДА (PSTS-1) - известный фосфатсвязывающий белок микобактерий, входящий в состав ABC-транспортера клеточной стенки микобактерий. Он вызывает сильный специфический антительный ответ на самых ранних этапах заболевания туберкулезом у человека. 38КДА входит в комплекс из PSTA2, PSTB2, PSTC1 и PSTS2, относящихся к фосфатным пермеазам и, по-видимому, распознается МАТ 1G4 и 1С1. Аналогичные белки имеются у всех микобактерий.Из полученных данных видно, что МАТ распознают антигены, входящие в мультипротеиновые комплексы и мембранные комплексы, представленные не только в M. tuberculosis, но и в других нетуберкулезных микобактериях. Это прежде всего указывает на то, что антимикобактериальные иммуноглобулины кролика имеют перекрестные реакции с многими микобактериями, а также на то, что нативные антигены микобактерий входят в сложные биологические комплексы, выполняющие метаболические и катаболические функции, сходные у разных бактерий.

Интересен антиген, выявляемый МАТ 1B7, поскольку он определяется только на цельных клетках M. tuberculosis, но идентифицировать его в иммуноблоттинге невозможно, т.к. эпитоп, распознаваемый МАТ 1B7, конформационный.

Таким образом, исследование микобактериальных антигенов в «гетеросэндвиче» МАТ-АГ-АС позволяет быстро проверить специфичность как самих МАТ, так и нативных АГ цельных клеток микобактерий, с которыми они реагируют.

1. Balcha T.T. Detection of lipoarabinomannan in urine for identification of active tuberculosis among HIV-positive adults in Ethiopian health centres / T.T. Balcha, N. Winqvist, E. Sturegard, S. Skogmar and others // Trop Med Int Health. - 2014. - Vol. 19. - №6. - P. 734-742.

2. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. - 1976 - Vol.7. - №72. - P. 248-254.

3. Braibant M.M. The ATP binding cassette (ABC) transport systems of Mycobacterium tuberculosis / M.M. Braibant, J.P. Gilot // FEMS Microbiology Reviews. - 2000. - Vol. 24. - P. 449-467.

4. Chambers M.A. Antibody bound to the surface antigen MPB83 of Mycobacterium bovis enhances survival against high dose and low dose challenge / M.A. Chambers, D. Gavier-Widen, R.G. Hewinson // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2004. -Vol. 41. - P. 93-100.

5. Chiaradia L. Dissecting the mycobacterial cell envelope and defining the composition of the native mycomembrane / L. Chiaradia, C. Lefebvre, J. Parra, J. Marcoux and others // Sci Rep. - 2017. - Vol.7. - №1. - P.1-12.

6. Fishbein S. Phylogeny to function: PE/PPE protein evolution and impact on Mycobacterium tuberculosis pathogenicity / S. Fishbein, N. van Wyk, R.M. Warren, S.L. Sampson // Mol Microbiol. - 2015. - Vol.96. - №5. - P.901-916.

7. Hwang W.H. Expression, purification and improved antigenicity of the Mycobacterium tuberculosis PSTS1 antigen for serodiagnosis / W.H. Hwang, W.K. Lee, S.W. Ryoo, K.Y. Yoo and others // Protein Expr Purif. - 2014. - Vol.95. - P.77-83.

8. Ivanyi J. Significance of antigen and epitope specificity in tuberculosis / J. Ivanyi, T.H. Ottenhoff // Front Immunol. - 2014. - Vol. 23. - №5. - P.524.

9. Maurya A.K. Evaluation of an immunochromatographic test for discrimination between Mycobacterium tuberculosis complex & non tuberculous mycobacteria in clinical isolates from extra-pulmonary tuberculosis./ A.K. Maurya, V.L. Nag, S. Kant, R.A. Kushwaha and others // Indian J Med Res. - 2012. - Vol.135. - №6. - P.901-906.

10. Pereira Arias-Bouda L.M. Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples / L.M. Pereira Arias-Bouda, L.N. Nguyen, L.M. Ho, S. Kuijper and others // J Clin Microbiol. - 2000. - Vol.38. - №6. - P.2278-83.

11. Shah M. Diagnostic accuracy of a urine lipoarabinomannan test for tuberculosis in hospitalized patients in a High HIV prevalence setting / M. Shah, E. Variava, C.B. Holmes, A. Coppin and others // J Acquir Immune Defic Syndr. - 2009. - Vol.52. - №2. - P.145-151.

12. de Souza G.A. Bacterial proteins with cleaved or uncleaved signal peptides of the general secretory pathway / G.A. de Souza, N.A. Leversen, H. Malen, H.G. Wiker // J Proteomics. - 2011. - Vol.75. - №2. - P.502-510.

13. Wilson M.B. The covalent coupling of proteins to periodate-oxidized sephadex: a new approach to immunoadsorbent preparation / M.B. Wilson, P.K. Nakane // J Immunol Methods. - 1976. - Vol.12. - №1-2. - P.171-181.

Размещено на .ru