Оценка активации МАР-киназ и транскрипционных факторов у моллюсков (Helix), обладающих разной способностью к обучению - Автореферат

Применение блокаторов вышележащих протеинкиназ показало, что активация данных ТФ связана с МАРК/ERK каскадом (Гринкевич, Васильев, 1999; Гринкевич и др., 2001). В связи с этим представлялось необходимым провести комплексные исследования экспрессии и активации МАР-киназ ERK в ЦНС Helix при обучении. Введение нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к выработке условных оборонительных рефлексов предотвращает активацию МАРК/ERK. Впервые, при помощи микрохимического варианта метода Вестерн блот проведен анализ экспрессии и активации MAPK/ERK в отдельных идентифицированных нейронах при обучении. Анализ активации МАРК/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения показал, что через 10 мин после обучения в этом ганглии происходит значительная активация МАРК/ERK каскада, что отражается в увеличении содержания фосфо-форм МАРК/ERK по сравнению с контролем (рис.Таким образом, недостаток активации МАРК/ERK в ЦНС, через нарушение экспрессии генов, необходимых для формирования долговременных механизмов пластичности, может определять неспособность ювенильных животных к выработке оборонительных рефлексов. Анализ активации транскрипционного фактора Elk-1 при формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии в париетовисцеральном ганглии Helix, у животных с нормальной и нарушенной способностью к обучению. Как отмечалось выше, МАР-киназы осуществляют регуляцию экспрессии генов через фосфорилирование (активацию) ряда транскрипционных факторов, в том числе, связывающихся с регуляторным элементом SRE (Dash et al, 2005). У ювенильных животных с незрелыми механизмами формирования условных оборонительных рефлексов спектр ТФ, связывающихся с элементом SRE, отличен от взрослых, и активация не происходит (Гринкевич и др., 2002). Поэтому представлялось актуальным провести сравнительные исследования активации транскрипционных факторов Elk-1 у животных с разной способностью к обучению (наивных животных; животных, которым вводили нейротоксин 5,7-диокситриптамина (5,7-ДОТ), а также у ювенильных животных).В последние годы широко исследуется роль внутриклеточных регуляторных каскадов и нижележащих транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, продукты которых непосредственно вовлекаются в пластические перестройки. Полученные нами данные о значительной и избирательной индукции MAPK/ERK в отдельных областях ЦНС и отдельных идентифицированных нейронах Helix, свидетельствуют о важной роли MAPK/ERK каскада в механизмах пластичности. Подтверждением специфичности связи активации MAP-киназы ERK с обучением являются наши данные об отсутствии активации MAPK/ERK каскада у животных с дисфункцией серотонинэргических терминалей (введение нейротоксина 5,7-ДОТ), неспособных к формированию оборонительных рефлексов, у животных, которым вводили ингибитор MAP-киназ ERK PD 98095, а также ювенильных животных.При выработке условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии наблюдается активация МАРК/ERK каскада. Разные сроки формирования данного рефлекса характеризуются разным уровнем активации МАР-киназ ERK. Значительные различия в активации МАРК/ERK каскада при обучении наблюдаются также в функционально-отличных идентифицированных нейронах Helix. Максимальная активация MAPK/ERK наблюдается в нейронах процеребрума, анализирующих информацию о запахах (условный стимул), и командных нейронах оборонительного поведения ППА(2/3) (основное пластическое звено данного рефлекса).

Относительное содержание фосфо-ERK к ERK (Вестерн блот анализ). Значения нормализованы относительно наивных взрослых животных.

В современной нейробиологии большое внимание уделяется изучению механизмов пластичности, лежащих в основе формирования долговременных механизмов обучения и памяти. В последние годы широко исследуется роль внутриклеточных регуляторных каскадов и нижележащих транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, продукты которых непосредственно вовлекаются в пластические перестройки. Таким образом, комплексные исследования регуляции активации MAPK/ERK каскада, проведенные на простой нервной системе моллюска Helix являются актуальными.

Полученные нами данные о значительной и избирательной индукции MAPK/ERK в отдельных областях ЦНС и отдельных идентифицированных нейронах Helix, свидетельствуют о важной роли MAPK/ERK каскада в механизмах пластичности. Подтверждением специфичности связи активации MAP-киназы ERK с обучением являются наши данные об отсутствии активации MAPK/ERK каскада у животных с дисфункцией серотонинэргических терминалей (введение нейротоксина 5,7-ДОТ), неспособных к формированию оборонительных рефлексов, у животных, которым вводили ингибитор MAP-киназ ERK PD 98095, а также ювенильных животных. Кроме того, результаты введения 5,7-ДОТ позволяют сделать вывод о важной роли серотонина в индукции активации MAPK/ERK каскада. Этот вывод также подтверждают наши данные по отсутствию активации MAP-киназы ERK у ювенильных животных, подвергнутых обучению, так как в настоящее время неспособность ювенильных животных к формированию ассоциативных и неассоциативных форм оборонительных рефлексов связывают с незрелостью серотонинэргической системы. Однако остается неизвестным, с пресинаптическим, или постсинаптическим звеном трансдукции серотонинового сигнала связаны эти явления. Дальнейшие сравнительные исследования состава и содержания серотониновых рецепторов в ЦНС взрослых и ювенильных животных, начатые нами, представляются перспективными.

Известно, что мишенями MAPK/ERK являются транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов через регуляторные элементы SRE, CRE и нижележащие транскрипционные факторы семейства AP-1, и активация этих факторов происходит при обучении Helix (Гринкевич, 2001). Таким образом, низкий уровень активации MAPK/ERK у 5,7-ДОТ-обработанных и ювенильных животных, через нарушение экспрессии нижележащих генов может лежать в основе неспособности животных к формированию долговременных форм оборонительных рефлексов.1. В ЦНС виноградной улитки экспрессируется МАР-киназа ERK2 с ММ 42 КДА. При выработке условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии наблюдается активация МАРК/ERK каскада. Разные сроки формирования данного рефлекса характеризуются разным уровнем активации МАР-киназ ERK. Причем, в ганглиях (париетовисцеральном, церебральном и педальном), играющих разную роль в формировании этого рефлекса, степень активации МАРК/ERK каскада различна.

2. Значительные различия в активации МАРК/ERK каскада при обучении наблюдаются также в функционально-отличных идентифицированных нейронах Helix. Максимальная активация MAPK/ERK наблюдается в нейронах процеребрума, анализирующих информацию о запахах (условный стимул), и командных нейронах оборонительного поведения ППА(2/3) (основное пластическое звено данного рефлекса). При этом инкубация ЦНС с модуляторным медиатором серотонином вызывает однонаправленную с обучением активацию МАРК/ERK в исследуемых нейронах Helix.

3. Введение нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к данной форме обучения, приводит к значительному снижению активации МАР-киназ ERK на ранних стадиях обучения, что свидетельствует о важной роли серотонина в индукции этого каскада.

4. Активация МАРК/ERK каскада спустя 4 часа после обучения наблюдается во всех ганглиях, как у нативных, так и у 5,7-ДОТ-обработанных животных, что, вероятно, связано с включением неспецифических адаптивных процессов в ответ на сенситизирующий безусловный стимул.

5. У ювенильных животных с незрелыми механизмами условных оборонительных рефлексов отмечается драматично низкий уровень фосфорилирования и соответственно активации МАРК/ERK по сравнению с взрослыми, в то время как уровень экспрессии этих киназ сравним. В отличие от взрослых животных обучение не индуцирует МАРК/ERK каскад в ЦНС ювенильных улиток спустя 10 мин и 1 час после процедуры обучения.

6. Серотонин-индуцируемый MAPK/ERK каскад играет существенную роль в формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у моллюска Helix lucorum.

Статьи: 1. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Гудзик К.А., Гринкевич В.В., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации транскрипционного фактора семейств ELK-1 в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Доклады Академии Наук. 2004.-Т. 397, №2.- С. 275-278.

2. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации МАР/ERK в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Российский физиологический журнал им. Сеченова, 2006.- T.92 , №5.- С. 536-545. [Переведено. Comparative analysis of the activation of MAP/ERK kinases in the CNS of animals with different learning abilities. Neurosci Behav Physiol. 2007.- 37(7).-P.715-20]

3. Grinkevich L.N., Lisachev P.D., Kharchenko O.A., Vasil"ev G.V., Expression of MAP/ERK kinase cascade corresponds to the ability to develop food aversion in terrestrial snail at different stages of ontogenesis, Brain Res. 2008.- №1187.-P.12-19.

Тезисы: 1. Гринкевич Л.Н, Лисачев П.Д., Васильев Г.В., Гудзик К.А., Харченко О.А. Регуляция экспрессии генов в нейронах центральной нервной системы HELIX при обучении. // Тез. докл. III съезда ВОГИС. Генетика в ХХІ веке: современное состояние и перспективы развития. Москва, 2004.- С. 381.

2. Харченко О.А., Баранова К.А. Дисфункция серотониновых терминалей нейронов ЦНС взрослых улиток нарушает способность к формированию условных оборонительных рефлексов через ингибирование МАР/ERK киназного регуляторного каскада. // Тез. докл. всероссийской конференции молодых исследователей, «Физиология и медицина». Вестник молодых ученых. 2005.- С. 130.

3. Харченко О.А., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Гринкевич Л.Н. Роль серотонина в формировании условного оборонительного рефлекса у Helix (молекулярно-генетические аспекты). // Тез. докл. I Съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс. 2005.- С. 46-47.

4. Харченко О.А., Баранова К.А., Лисачев П.Д, Гринкевич Л.Н. Серотонин-индуцированная активация МАР/ERK киназного регуляторного каскада лежит в основе формированию условных оборонительных рефлексов пищевой аверзии у HELIX. // Тез. докл. международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПБ, 2005.- С. 97-98.

5. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Роль МАР/ERK киназного каскада в регуляции экспрессии генов при обучении (онтогенетические аспекты). // Тезисы международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПБ, 2005.- С. 26-27.

6. Харченко О.А., Баранова К.А. Ключевая роль серотонина в индукции MAP/ERK киназного каскада и способности к обучению у Helix. // Тез. докл. X Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2006.- С. 171.

7. Харченко О.А., Воробьева О.В. Серотонин индуцирует митогенактивируемый (MAP/ERK) киназный каскад в командных нейронах оборонительного поведения у Helix. // Тез. докл. 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». СПБ, 2007.- С. 485-486.

8. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Роль митоген-активируемых каскадов в формировании механизмов пластичности. // Тез. докл. ХХ Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007. С. 31.

9. Харченко О.А., Гринкевич Л.Н. Формирование условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у Helix (роль серотонина). // Тез. докл. конференции молодых ученых, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды».СПБ, 2007.-С.79.

10. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Внутриклеточная сигнализация в механизмах формирования долговременной памяти. // Тез. докл. II Съезда Общества клеточной биологии. СПБ, 2007. С. 735.

11. Харченко О.А., Воробьева О.В., Гринкевич Л.Н. Формирование условного рефлекса пищевой аверзии сопровождается разной степенью активации MAP/ERK-киназного каскада в идентифицированных нейронах HELIX. // Тез. докл. конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», посвященной 100-летию со дня рождения М. Е. Лобашева. СПБ, 2007.- С. 94-95.

12. Kharchenko O.A., Grinkevich L.N. Activation of serotonin-indused MAP/ERK regulatory cascade in different ganglia and identified neurons of Helix CNS during learning. // PENS/Hertie winter school, «The design of neuronal Networks: Contributions from Invertebrates». Obergurgl, Austria, 2008.

Работа проводилась при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 02-04-49731 и № 08-04-01325.

Размещено на .ru