Оценка адгезии бактерий рубцовой жидкости к поверхности растительных субстратов - Статья

Перечень современных методов определения адгезии к растительному волокну включает: турбидиметрический анализ, удобный для оценки адгезии различных микроорганизмов к стандартному субстрату; люминесцентную микроскопию, позволяющую увидеть адгезированные одиночные клетки и целые микроколонии, но отличающаяся субъективностью и рутинностью; метод с использованием бактерий, меченных 14С или 3H; тест, основанный на определении белков бактерий присоединившихся к субстрату и т.д. В этой связи целью нашего исследования явилась сравнительная оценка адгезии микроорганизмов к поверхности растительных субстратов на примере бактерий жидкости рубца и рекомбинантного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10 с использованием люминесцентной микроскопии и биолюминометрии соответственно. В качестве объектов исследования применялись микроорганизмы (бактерии) рубцовой жидкости молодняка крупного рогатого скота и модельный микроорганизм - Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10, выпускаемый «НВО Иммунотех» как биосенсор Эколюм-11. При работе с рубцовой жидкостью последнюю центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, при этом в эксперименте использовался супернатант, содержащий только бактерии. Полученные данные выражали в виде биолюминесцентного индекса (БЛИ) в %, который рассчитывается по формуле: БЛИ = (1 - (К1·О2 )/ (К2·О2))·100 %, где БЛИ - биолюминесцентный индекс в %; К1 - интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в начале опыта; К2 - интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в конце экспозиции; О1 - интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в начале опыта; О2 - интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в конце экспозиции.

Для решения комплексных практических задач в новой образовательной системе, обучаемые должны быть готовы к научно-исследовательской деятельности, анализу получаемой лабораторной биологической информации и участию в подготовке научных отчетов, обзоров, публикаций, патентов, организации конференций, научно-производственной и проектной деятельности. Особая роль здесь должна принадлежать профессиональной мотивации.

Применительно к учебной деятельности магистров в системе вузовского образования под профессиональной мотивацией понимается совокупность факторов и процессов, которые, отражаясь в сознании, побуждают и направляют личность к изучению будущей профессиональной деятельности. Профессиональная мотивация выступает как внутренний движущий фактор развития профессионализма и личности, так как только на основе ее высокого уровня формирования, возможно эффективное развитие профессиональной образованности и культуры личности.

При этом под мотивами профессиональной деятельности понимается осознание актуальных потребностей личности (получение высшего образования, саморазвития, самопознания, профессионального развития, повышение социального статуса и т.д.), удовлетворяемых посредством выполнения учебных задач и побуждающих его к изучению будущей профессиональной деятельности. Ключевым моментом, по нашему мнению, является исследовательская деятельность магистра, направленная на закрепление и реализацию сформированных у него профессиональных компетенций.

Примером исследовательской деятельности в новой системе компетентностно-ориентированного образования является магистерская диссертация, написание которой осуществляется в рамках заданной тематики и включает в себя этапы: сбор и анализ литературных данных по изучаемому вопросу, отработка методик для реализации поставленных задач, выполнение экспериментальной части научно-исследовательской работы, математическая и статистическая обработка полученных результатов, и, наконец, собственно написание дипломной работы.

Так, в рамках поставленной перед нами задачи, была произведена количественная оценка адгезии бактерий рубцовой жидкости к поверхности растительных субстратов на модели рекомбинантного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10

Ключевая роль микроорганизмов рубцовой жидкости в пищеварении жвачных животных связана с расщеплением корма в преджелудках и синтезом собственного белка, что обеспечивает потребности макроорганизма в энергии и питательных веществах. При этом известно, что адгезия микрофлоры рубцовой жидкости является благоприятным фактором их жизнедеятельности, и тем самым влияет на интенсивность ферментативных процессов [1]. В то же время дополнительная обработка субстрата, способствующая повышению адгезии микроорганизмов, будет обеспечивать биотехнологическую эффективность [4].

Оценка адгезии бактерий рубцовой жидкости к поверхности растительных субстратов относится к числу недостаточно исследованных и актуальна, прежде всего, с позиции выявления механизмов информационного обеспечения управления качеством кормления и их воздействия на повышение эффективности пищевой промышленности.

В этой связи актуален вопрос разработки объективных методов количественной оценки адгезивной активности микроорганизмов, позволяющих выявить степень микробной адгезии к различным субстратам и определяющие ее факторы.

Перечень современных методов определения адгезии к растительному волокну включает: турбидиметрический анализ, удобный для оценки адгезии различных микроорганизмов к стандартному субстрату; люминесцентную микроскопию, позволяющую увидеть адгезированные одиночные клетки и целые микроколонии, но отличающаяся субъективностью и рутинностью; метод с использованием бактерий, меченных 14С или 3H; тест, основанный на определении белков бактерий присоединившихся к субстрату и т.д. [6].

Наряду с преимуществами (высокой чувствительностью, объективностью) современные методы обладают целым рядом недостатков, в том числе необходимостью использования радиоактивных веществ; относительно высокой стоимостью и, как правило, сложностью и малодоступностью для воспроизведения в условиях практических лабораторий. К тому же методы, которые позволяли бы выявить адгезию на различных субстратах с использованием модельных микроорганизмов, в литературе не встречаются.

Известно, что тесты, основанные на использовании биолюминесценции, обладают высокой чувствительностью и экспрессивностью [2]. В этой связи целью нашего исследования явилась сравнительная оценка адгезии микроорганизмов к поверхности растительных субстратов на примере бактерий жидкости рубца и рекомбинантного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10 с использованием люминесцентной микроскопии и биолюминометрии соответственно.

В работе изложена концепция инновационно-ориентированной организационной структуры оценки адгезии микроорганизмов рубцовой жидкости крупного рогатого скота (КРС) Оренбургской области. Работа представляет интерес для специалистов в области микробиологии и биологии, аспирантов, студентов вузов, а также для научных работников, участвующих в инновационных процессах.

Материалы и методы исследования

При проведении исследования в качестве субстрата использовались пшеничные отруби, которые в нативном состоянии подвергали различным видам обработки: экструзионная, ультразвуковая и сверхвысокие частоты. Непосредственно перед проведением эксперимента исследуемые образцы измельчали с помощью лабораторной мельницы (d=1мм).

В качестве объектов исследования применялись микроорганизмы (бактерии) рубцовой жидкости молодняка крупного рогатого скота и модельный микроорганизм - Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10, выпускаемый «НВО Иммунотех» как биосенсор Эколюм-11.

Пробы рубцовой жидкости отбирали у фистульного бычка через 3 часа после кормления (пик рубцового пищеварения), которые затем фильтровали через 4 слоя стерильной марли. При работе с рубцовой жидкостью последнюю центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, при этом в эксперименте использовался супернатант, содержащий только бактерии.

Согласно инструкции биосенсор восстанавливали из лиофилизированного состояния охлажденной дистиллированной водой и выдерживали в течение 0,5 ч при 4 ОС для реактивации биолюминесценции. Для эксперимента использовалась взвесь суточной культуры E. coli K12 TG1 в LB-бульоне. Биомассу стандартизировали по оптической плотности при 540 нм на спектрофотометре «СФ-46» до значений 0,5.

На первом этапе работы был проведен количественный учет адгезированных на кормовых частицах микроорганизмов рубцовой жидкости с помощью люминесцентной микроскопии, используя ранее разработанную нами методику [3]. Далее были проведены исследования, направленные на разработку метода количественного учета микроорганизмов, адгезированных к частицам растительных субстратов, с использованием биолюминометра.

При регистрации биолюминесценции использовался микропланшетный люминометр LM-01T c термостатом, разработанный в Институте биофизики СО РАН совместно со специальным конструкторским технологическим бюро «Наука» (г. Красноярск).

В процессе разработки способа количественного учета адгезированных микроорганизмов к частицам трофических субстратов с помощью микропланшетного люминометра для получения взвеси частиц одного размера проводилась их отмывка физиологическим раствором при режиме 1500 об/мин. Для инкубации использовалась взвесь суточной культуры E. coli K12 TG1 в LB-бульоне (0,5 оптической плотности). Взвесь биосенсора смешивали с полученным осадком частиц субстрата в соотношении 1:10. Полученную смесь выдерживали при 38°С в течение 30 мин в условиях периодического перемешивания.

Затем проводили центрифугирование опытной смеси при 1500 об/мин для разделения адгезированных и неадгезированных микроорганизмов. В осадке получили частицы со связавшимися микроорганизмами, а в супернантанте - неадгезированные бактерии. Супернатант раскапывали по 250 мкл в лунки планшета, который помещали в биолюминометр для измерения светимости бактерий в супернатанте в течение 20 мин. В качестве контроля использовалась взвесь модельного микроорганизма без внесения субстрата, которая также подвергалась инкубированию.

Полученные данные выражали в виде биолюминесцентного индекса (БЛИ) в %, который рассчитывается по формуле: БЛИ = (1 - (К1·О2 )/ (К2·О2))·100 %, где БЛИ - биолюминесцентный индекс в %; К1 - интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в начале опыта; К2 - интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в конце экспозиции; О1 - интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в начале опыта; О2 - интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в конце экспозиции.

Полученные результаты были статистически обработаны с применением общепринятых методик при помощи пакета статистического анализа «STATISTICA 6».

Результаты и их обсуждение

На первом этапе с помощью люминесцентного микроскопа была проведена количественная оценка адгезионной активности бактерий рубца к частицам пшеничных отрубей, подвергшихся экструзии, обработке ультразвуком и сверхвысокими частотами. В качестве контроля использовались пшеничные отруби, не подвергавшиеся обработке.

На основании полученных данных установлено, что обработка корма увеличивает адгезию микроорганизмов из содержимого рубца крупного рогатого скота к растительному субстрату. К частицам пшеничных отрубей адгезировалось 15,8±0,73 бактерий. При обработке исследуемых образцов ультразвуком количество адгезированных бактерий на частицу субстрата было выше контроля на 12 %, при обработке токами сверхвысокой частоты - на 19,1 % (р<0,01) и при использовании горячей экструзией - на 33,1 % (р<0,001) соответственно.

По предварительным результатам получено, что наиболее выраженная адгезия бактерий к субстрату происходит при экструзионной обработке и обработке токами сверхвысокой частоты. Это связано с особенностями воздействия гидробаротермической обработки на химическую и физическую структуру корма.

В ходе горячей экструзии имеет место увеличение удельной поверхности продукта на 20 %, кроме того, образуются разрывы молекулярных цепочек крахмала, белков [5], в результате чего открываются дополнительные места связывания микроорганизмов с субстратом, увеличивается гидрофобность поверхности, что повышает способность к адгезии микроорганизмов [7].

Следует отметить, что люминесцентная микроскопия позволяет четко визуализировать объект (но не его отдельные структуры), удобна для прямого подсчета микроорганизмов и не требует высоких затрат на реактивы. Однако, этот метод не всегда удобен в использовании, его недостатками являются субъективность в оценке результатов исследования, рутинность, кроме того, мы столкнулись со сложностью разделения эндогенной микрофлоры отрубей от бактерий рубцовой жидкости.

В ходе выполнения работы с помощью биолюминометра была также дана количественная оценка адгезионной активности бактерий к частицам кормовых субстратов подвергнутым обработке ультразвуком, токами сверхвысокой частоты и экструзией. В качестве контроля использовались пшеничные отруби без обработки.

Количество адгезированных бактерий к частицам пшеничных отрубей не подвергавшихся обработке составило 35±1,86 % (рисунок 1). Отмечено, что при обработке исследуемых образцов ультразвуком количество адгезированных бактерий на частицу субстрата было выше контроля на 3,23 %, при обработке токами сверхвысокой частоты - на 9,68 % и при использовании горячей экструзией - на 16,13 % (р<0,01) соответственно.

Таким образом, к экструдированным субстратам адгезия микроорганизмов была также выше, чем к образцам без обработки. Это согласуется с ранее полученными данными.

Для сравнительной оценки методов подсчета адгезированных микроорганизмов полученные данные были приведены к общему знаменателю путем пересчета результатов опыта к значению контроля, взятого за 100 % для каждого способа в отдельности (рис. 1). При этом результаты исследования между адгезией модельного микроорганизма, измеренной планшетным люминометром, и бактерий рубцовой жидкости, подсчитанной с помощью люминесцентного микроскопа имели высокую сходимость (r=0,73, Р<0,01).

Это позволяет сделать предположение о взаимозаменяемости указанных методов для количественной оценки адгезивной активности микроорганизмов. Однако разница между абсолютными значениями адгезии микроорганизмов рубцовой жидкости в опыте в сравнении с контролем была выше, чем при использовании модельного микроорганизма, что, видимо, связано с видовым разнообразием микроорганизмов рубцовой жидкости и соответственно с их более широкими трофическими возможностями, определяющими специфическую адгезию.

Рис. 1 - Количественная оценка адгезированных бактерий к частицам обработанных кормовых субстратов, измеренная с помощью планшетного биолюминометра и люминесцентного микроскопа; на оси ординат количество адгезированных бактерий по отношению к контролю, %

Стоит отметить преимущества использования люминометрии в целом: экспрессивность, техническая простота метода, возможность оценки жизнеспособности биосенсора в зависимости от исследуемого субстрата, - и в применении к поставленной задаче: исключение работы с рубцовой жидкостью и соответственно содержания подопытного животного.

Таким образом, в ходе проведенного исследование было установлено, что обработка корма увеличивает адгезию микроорганизмов из содержимого рубца крупного рогатого скота к растительному субстрату; наиболее выраженная адгезия бактерий к субстрату происходит при экструзионной обработке и обработке токами сверхвысокой частоты. Полученные данные позволяют сделать предположение о взаимозаменяемости метода подсчета микроорганизмов, адгезированных на частицах субстрата рубцовой жидкости, с помощью люминесцентного микроскопа и метода подсчета с использованием планшетного биолюминометра. животноводство биолюминометрия микроорганизм

1. Грушкин, А.Г. О морфофункциональных особенностях микробиоты рубца жвачных животных и роли целлюлозолитических бактерий в рубцовом пищеварении / А.Г. Грушкин, Н.С. Шевелев // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. - 2008. - Т. 2, № 2. - С. 12-19.

2. Дерябин, Д.Г. Бактериальная биолюминесценция. Фундаментальные и прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин / Оренбург: Наука, 2009. - 248 с.

3. Кондакова, К.С. Влияние различных видов обработки кормовых средств и добавок, содержащих микро-, наночастицы металлов на способность бактерий рубца к адгезии / К.С. Кондакова, Е.В. Япрынцева, Е.А. Дроздова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2012. - № 1. - С. 245-247.

4. Кондакова, К.С. Изучение зависимости переваримости минерально-растительных комплексов от степени адгезии микроорганизмов к поверхности частиц пищи / К.С. Кондакова, Е.В. Япрынцева, Е.А. Дроздова, Н.В. Мищенко // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2011. - № 12. - С. 338-340.

5. Полищук, В.Ю. Проектирование экструдеров для отраслей АПК / В.Ю. Полищук, В.Г. Коротков, Т.М Зубкова / Екатеринбург: УРО РАН, 2003. - 202 с.

6. Miron, J. Invited Review: Adhesion mechanisms of rumen cellulolytic bacteria / J. Miron, D. Ben-Ghedali, M. Morrison // Journal of Dairy Science. - 2001. - Vol. 84, Issue 6. - P. 1294-1309.

7. Pringle, J.H. Influence of substratum wettability on attachment of freshwater bacteria to solid surfaces / J.H. Pringle, M. Fletcher // Appl. Environ. Microbiol.. - 1983. - Vol. 45, № 3. - P. 811-817.

Размещено на .ru