Оцінка протипухлинної активності кріоконсервованих клітин фетальної печінки в експериментальній моделі раку молочної залози - Автореферат

Їхнє використання як лікувального матеріалу обґрунтовано насамперед наявністю клітин стовбурового компартменту, а так само медіаторів з гістогенетичним і імуномодулюючим потенціалом, які продукуються стовбуровими і більш диференційованими елементами [Гольцев А.Н. и др., 1994, 1998, 2000; Le Blanc K. et al., 2003]. Прийнято вважати, що як і інші представники продуктів фетоплацентарного комплексу (ПФПК) КФП в організмі реципієнта відповідають “на запит ситуації”, виявляючи поліфункціональну відповідь у конкретних умовах розвитку тієї чи іншої патології [Гольцев А.Н. и др., 2000, 2006]. Як в експерименті, так і в клініці була доведена ефективність КФП при лікуванні захворювань аутоімунної природи, до яких відносять й онкопатологію [Храновська Н.М., 2001; Гольцев А.Н. и др., 2003, 2006]. Проте дотепер продовжується робота з оцінки впливу кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики ПФПК і зокрема КФП [Гольцев А.Н. и др., 2009; Петренко А.Ю. и др., 2009; Natan D. et al., 2009]. Оцінити особливості клінічної маніфестації розвитку РМЗ у мишей лінії С3Н на різних етапах онтогенетичного розвитку.Мишам С3Н дослідних груп у 6 місяців, тобто за 6-7 місяців до маніфестації клінічних ознак РМЗ, внутрішньовенно у 0,2 мл середовища вводили кріоконсервовані або нативні КФП (ККФП, НКФП): 1-й групі - ККФП у дозі 1х106 клітин/мишу (n=17); 2-й групі - НКФП у дозі 1х106 клітин/мишу (n=16); 3-й групі - ККФП у дозі 5х106 клітин/мишу (n=17); 4-й групі - НКФП у дозі 5х106 клітин/мишу (n=16). До груп порівняння увійшли миші лінії С3Н, яким замість КФП були введені клітини дорослої печінки (КДП) у дозі 1х106 клітин/мишу (5 група, n = 15) та дозі 5х106 клітин/мишу (6 група, n = 14). Усі маніпуляції з мишами проводили відповідно до положень “Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовувались для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). кріоконсервування імуномодулюючий фетальний Заморожування КФП здійснювали за різними програмами під захистом 7,5; 10 і 12,5%-го кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) за такими програмами: Швидкість охолодження 1 °С/хв до-25°С з наступним зануренням у рідкий азот [Цуцаева А.А., 1983]; До і після кріоконсервування оцінювали наступні показники КФП: життєздатність по пропідій йодиду (PI) [Nebe-von-Carona G. et al., 2000]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих азур-II-еозином в світовом мікроскопі ЛОМО-2; вміст стовбурових кровотворних клітин (СКК) і мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) методом цитофлуоріметрії на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur, з використанням моноклональних антитіл (МАТ) до CD34 і CD38, CD44 і CD73 (BD, США).Кожний з перерахованих медіаторів виробляється широким спектром КФП, у тому числі МСК, бластними клітинами (овальні клітини (ОК), гепатобласти). Проведені морфологічні і цитометричні дослідження інтактної суспензії ФП мишей лінії С57BL продемонстрували високу гетерогенність її клітинного складу з наявністю клітин еритроїдного ряду (75,42±5,87%), недиференційованих бластів (8,71±1,25%), гепатоцитів (7,21±0,53%), моноцитів (2,31±0,42%), лімфоцитів (1,21±0,01%), зрілих і незрілих гранулоцитів (8,71±1,98%), а так само кровотворних CD34 38-(0,04±0,003%) і мезенхімальних CD44 73 (5,25±0,36%) стовбурових клітин. При цьому слід підкреслити, що імунокоригуючий ефект КФП як у 13, так і 16 місяців визначався видом і дозою введенного матеріалу: більш виражену коригуючу дію мали кріоконсервовані КФП у дозі 5х106 клітин/мишу і нативні КФП у дозі 1х106 клітин/мишу. Необхідно відзначити коригуючий ефект КФП у відношенні Ia клітин, вміст яких у 13 місяців після використання кріоконсервованих КФП у дозі 5х106 клітин/мишу вірогідно не відрізнявся від контрольних значень (12,74±1,18%, при 12,51±1,14% в контролі, p>0,05). Імунокоригуючий ефект введених у дозі 5х106 клітин/мишу кріоконсервованих і у дозі 1х106 клітин/мишу нативних КФП утримувався до 16-го місяця, що свідчить про збереження функціональної активності трансплантованих клітин після кріоконсервування.Враховуючи вищесказане, у даній роботі проведена оцінка ефективності превентивного використання кріоконсервованих КФП на стан ІС, вміст СРК і клінічну маніфестацію пухлинного процесу у мишей лінії С3Н з генетично детермінованим розвитком РМЗ. При порівняльній оцінці впливу різних режимів кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики КФП визначені ті умови, які максимально забезпечували схоронність у гетерогенній популяції клітин з потенціалом протипухлинної активності. Комплексна оцінка стану ІС мишей лінії С3Н продемонструвала істотні зміни показників клітинної і гуморальної ланок імунітету та МФС, що збільшувалися в міру розвитку РМЗ. Встановлена здатність введених кріоконсервованих, так само як і нативних КФП коригувати ІС мишей лінії С3Н, в першу чергу вміст Т-регуляторних (T-reg) клітин, цитотоксичну активність селезінки, вміст ЦІК і функції клітин МФС.

Основний зміст роботи

Вплив умов заморожування-відігрівання на схоронність і морфофункціональні характеристики КФП. Можливість використання КФП як препарату клітинної та тканинної терапії в онкологічній практиці обґрунтована присутністю серед них клітинних популяцій і синтезованих ними біоактивних субстанцій, які потенційно мають антибластомну активність [Gibbs P. et al., 1998; Tower AM et al., 2009]. Здатність пригнічувати проліферативну активність пухлинних клітин виявляють онкостатин, фетуїн, б-фетопротеїн, 7-кетохолестерол та інші [Zhang Q.L. et al., 1997; Brounais B. et al., 2009; Tower AM et al., 2009]. Кожний з перерахованих медіаторів виробляється широким спектром КФП, у тому числі МСК, бластними клітинами (овальні клітини (ОК), гепатобласти). Особливе значення мають кровотворні стовбурові елементи ФП [Lepus C.M, et al., 2009]. Проведені морфологічні і цитометричні дослідження інтактної суспензії ФП мишей лінії С57BL продемонстрували високу гетерогенність її клітинного складу з наявністю клітин еритроїдного ряду (75,42±5,87%), недиференційованих бластів (8,71±1,25%), гепатоцитів (7,21±0,53%), моноцитів (2,31±0,42%), лімфоцитів (1,21±0,01%), зрілих і незрілих гранулоцитів (8,71±1,98%), а так само кровотворних CD34 38- (0,04±0,003%) і мезенхімальних CD44 73 (5,25±0,36%) стовбурових клітин.

Після кріоконсервування більш чутливими к факторам кріоконсервування були зрілі гранулоцити, моноцити, гепатоцити. При цьому оцінка морфофункціональних властивостей КФП при варіюванні швидкостями охолодження і концентрацією кріопротектора показала нерівнозначні зміни складу і стану КФП. У табл. 1 представлені результати інтегральної оцінки такого роду відхилень, виражених у вигляді сумарного ступеня відхилення (ССВ) показників від контролю (нативні КФП) [Гольцев А.Н. и др., 2003].

Таблиця 1 ССВ показників стану КФП 14-ї доби гестації після кріоконсервування за різними режимами

Показник ССВ Режим 1 Режим 2 Режим 3

Концентрація ДМСО, %

7,5 10 12,5 7,5 10 12,5 7,5 10 12,5

Клітинний склад* 1,35 1,23 1,66 1,34 1,24 1,33 1,62 1,31 1,23

Кількість ядерних клітин 0,50 0,10 0,28 0,24 0,21 0,51 0,44 0,20 0,20

Схоронність клітин 0,24 0,13 0,27 0,15 0,23 0,30 0,27 0,14 0,19

Клітини CD34 38- 0,10 0,16 0,36 0,15 0,15 0,38 0,07 0,39 0,32

Клітини CD44 73 0,85 0,42 0,86 0,56 0,70 0,70 0,67 0,58 0,56

КУОС 8 0,43 0,31 0,57 0,56 0,54 0,61 0,42 0,61 0,58

КУОС 14 0,38 0,31 0,60 0,48 0,44 0,68 0,36 0,48 0,45

УССВ 3,85±0,29 2,66±0,23 4,60±0,24 3,48±0,37 3,51±0,30 4,51±0,36 3,85±0,30 3,71±0,31 3,53±0,25

Примітки: кожна величина виражає ступінь відхилення від контрольного показника в умовних одиницях; *- відсотковий вміст кожної з оцінених популяцій клітин ФП;

Як показано, мінімальний ступінь відхилення від контролю, тобто кращий з показників ССВ, був отриманий при кріоконсервуванні КФП зі швидкістю 1 °С/хв до -25°С при концентрації ДМСО 10%. Саме цей режим був обраний для атестації протипухлинного потенціалу КФП.

Оцінка стану ЛГПК мишей лінії С3Н. Отримані результати показали, що розвиток РМЗ супроводжується багатопрофільними змінами якісних і кількісних характеристик ЛГПК. Так, у мишей лінії С3Н, яких не лікували, віком 13 місяців на тлі лейкоцитозу ((5,05±0,43)х106 кл/мл при (2,84±0,15)х106кл/мл у контролі, р<0,05) відзначалося підвищення в порівнянні з контролем ШОЕ (2,94±0,27 і 2,00±0,17 мм/годину відповідно, р<0,05). До 16-го місяця у мишей С3Н відзначалася тенденція до збільшення в порівнянні з 13-м місяцем виразності цих показників: кількість лейкоцитів - (6,04±0,54) х106 кл/мл; ШОЕ - 3,27±0,28 мм/годину. Оцінка стану ІС у 13 і 16 місяців виявила істотні зміни показників клітинної і гуморальної ланки, МФС з перевагою ознак імуносупресії.

При гістологічному дослідженні структури органів ЛГПК мишей лінії С3Н в 13 місяців було виявлено гіпоплазію тимусу, мієлоїдну гіперплазію КМ, інфільтрацію пухлинними клітинами селезінки і ЛВ. У легенях спостерігали осередки метастазування, а в МЗ - внутрішньопротоковий кріброзний рак. В 16 місяців у мишей що вижили спостерігали ознаки бластомної та плазмоцитарної реакцій цих органів. В селезінці, крім того, було відзначено появу колоній медулярного крововиливу.

Оцінка коригуючого ефекту превентивно введених КФП на стан ЛГПК мишей С3Н. Превентивна терапія РМЗ, так само як і в роботах [Vaage J. et al. 1995, Lala P.K. et al., 1997] проводилась у 6 місяців, коли починають виявлятися СРК (CD44hi - 0,01±0,001%, CD44 24- - 0,35±0,024%, а CD133 - 15,41±1,39%). Отримані дані показали, що превентивне введення КФП мишам лінії С3Н незалежно від віку сприяло поліпшенню багатьох показників стану ЛГПК. Для КФП була характерна здатність в обидва терміни дослідження знижувати лейкоцитоз, ШОЕ, підвищувати кількість еритроцитів і гемоглобіну. Була відзначена явна динаміка відновлення структури органів ЛГПК: у тимусі - часточкова будова з чітко позначеною корковою та мозковою зонами, у КМ - зниження мієлоїдної гіперплазії. У ЛВ виявлялися фолікули коркової зони, спостерігалося відновлення паракортикальної зони; у селезінці відновлювалися структури білої пульпи, у легенях не відмічалось крововиливів, а також були відсутні ознаки розростання пухлинних клітин.

Спостерігалося також відновлення фагоцитарної активності клітин МФС. Особливо важливим можна вважати установлений факт зниження вмісту T-reg (CD4 25 ), а так само істотне підвищення кількості Т-лімфоцитів (CD3 ), що корелювало зі зниженням атрофії тимуса і зниженням вмісту ЦІК.

При цьому слід підкреслити, що імунокоригуючий ефект КФП як у 13, так і 16 місяців визначався видом і дозою введенного матеріалу: більш виражену коригуючу дію мали кріоконсервовані КФП у дозі 5х106 клітин/мишу і нативні КФП у дозі 1х106 клітин/мишу. Необхідно відзначити коригуючий ефект КФП у відношенні Ia клітин, вміст яких у 13 місяців після використання кріоконсервованих КФП у дозі 5х106 клітин/мишу вірогідно не відрізнявся від контрольних значень (12,74±1,18%, при 12,51±1,14% в контролі, p>0,05).

Імунокоригуючий ефект введених у дозі 5х106 клітин/мишу кріоконсервованих і у дозі 1х106 клітин/мишу нативних КФП утримувався до 16-го місяця, що свідчить про збереження функціональної активності трансплантованих клітин після кріоконсервування. Особливу значимість має коригуюча активність КФП відносно цитотоксичної активності НК клітин.

Вплив превентивного використання кріоконсервованих КФП на кількісні і якісні характеристики СРК при розвитку РМЗ. Встановлено, що у них, навіть без клінічної маніфестації пухлини, вірогідно в порівнянні з контролем підвищувався вміст CD44hi, CD44 24- і CD133 клітин в МЗ. Поряд з цим встановлена чітка залежність експансії СРК у мишей лінії С3Н від поширеності пухлинного процесу. Оцінка ефективності проведеного лікування виявила виражений ефект на вміст СРК при використанні КФП незалежно від виду і дози. Проте найбільш близьке до контрольних значень вмісту особливо інвазивних СРК із маркерами CD44hi і CD44 24- клітин було досягнуто при використанні кріоконсервованих КФП у дозі 5х106 клітин/мишу і нативних - у дозі 1х106 клітин/мишу. При цьому різний характер зміни вмісту інших субпопуляцій клітин (CD133 , CD44 24 , CD44-24 ) у залежності від дози і виду біоматеріалу може вказувати на різний механізм впливу на СРК, що виявляють КФП у кожному конкретному випадку. Доказом специфічного ефекту КФП є той факт, що введення КДП не викликало подібних змін. Слід відзначити, що дослідження вмісту СРК у хворих на РМЗ тварин у динаміці може бути використане в загальній оцінці ефективності терапії і прогнозуванні перебігу захворювання.

Вплив превентивного введення кріоконсервованих КФП на характер клінічної маніфестації РМЗ. Закономірності зміни вмісту СРК під дією введених КФП корелювали зі зниженням частоти розвитку пухлини і виживаностю мишей лінії С3Н (табл.2).

Таблиця 2 Частота розвитку РМЗ і виживаність мишей лінії С3Н

Група мишей Період спостереження, місяці

13 16

Частота розвитку РМЗ, % Виживаність тварин, % Частота розвитку РМЗ, % Виживаність тварин, %

С3Н 73,42±5,37 83,35±5,69 75,31±2,54 31,47±4,73

С3Н ККФП 1х106 50,62±4,271,2,3 90,04±2,49 - 57,54±3,971,2,3

С3Н НКФП 1х106 36,48±2,431,3 100 - 70,46±2,001,3

С3Н ККФП 5х106 43,65±2,491,2 100 - 81,65±3,381,2

С3Н НКФП 5х106 58,57±3,841 87,53±3,62 - 67,53±1,761

С3Н КДП 1х106 69,52±6,83 58,35±2,43 75,31±2,54 45,07±1,11

С3Н КДП 5х106 65,20±5,59 66,72±5,73 66,74±3,34 37,51±3,12

Примітки: ступінь вірогідності розходження (р<0,05) у порівнянні: з 1 - мишами, яких не лікували; 2 - кріоконсервованого матеріалу з нативним відповідною дозою; 3 - матеріалу в дозі 1х106 клітин/мишу з матеріалом у дозі 5х106 клітин/мишу в кожній групі препаратів (нативні і кріоконсервовані).

Максимальне зниження частоти розвитку пухлини в 13 місяців, так само як і максимальна виживаність тварин у 16 місяців спостерігалися при використанні нативних КФП у меншій дозі 1х106 клітин/мишу, тоді як кріоконсервованих КФП - у дозі 5х106клітин/мишу.Експериментальне обґрунтування можливості використання кріоконсервованих препаратів фетального походження при лікуванні патологій неопластичного генезу є однією з важливих задач сучасної медицини. Враховуючи вищесказане, у даній роботі проведена оцінка ефективності превентивного використання кріоконсервованих КФП на стан ІС, вміст СРК і клінічну маніфестацію пухлинного процесу у мишей лінії С3Н з генетично детермінованим розвитком РМЗ.

1. При порівняльній оцінці впливу різних режимів кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики КФП визначені ті умови, які максимально забезпечували схоронність у гетерогенній популяції клітин з потенціалом протипухлинної активності.

2. Комплексна оцінка стану ІС мишей лінії С3Н продемонструвала істотні зміни показників клітинної і гуморальної ланок імунітету та МФС, що збільшувалися в міру розвитку РМЗ. Порушення стану ІС супроводжувалися змінами структури органів ЛГПК, які характеризуються гіпоплазією лімфоїдної тканини та гіперплазією ретикулярних елементів.

3. Показано, що при генетично детермінованому розвитку РМЗ вже на ранніх етапах онтогенезу в ній виявляються клітини з ознаками СРК, що експресують маркер CD44hi. В міру розвитку патології вміст СРК істотно підвищувався та виявлявся не тільки в самій пухлині, але й у тканинах МЗ поза осередку злоякісного росту.

4. Доведено можливість превентивного лікування генетично детермінованого РМЗ кріоконсервованими КФП. Встановлена здатність введених кріоконсервованих, так само як і нативних КФП коригувати ІС мишей лінії С3Н, в першу чергу вміст Т-регуляторних (T-reg) клітин, цитотоксичну активність селезінки, вміст ЦІК і функції клітин МФС.

5. Встановлена залежність прояву лікувального ефекту від дози і виду КФП, які вводили. Корекція ІС мишей у 13 місяців була більш властива нативним КФП у дозі 1х106 клітин/мишу, тоді як у віці 16 місяців - кріоконсервованим КФП, введеним у дозі 5х106клітин/мишу.

6. Використання КФП знижувало кількість найбільш інвазивних СРК із фенотипом CD44hi і CD44 24-, що корелювало зі ступенем активації клітин із протипухлинною активністю (НК клітин): максимально виражений ефект виявляли кріоконсервовані КФП в дозі 5х106 клітин/мишу і нативні в дозі 1х106 клітин/мишу.

7. Мінімальна частота розвитку РМЗ і максимальна виживаність мишей лінії С3Н, яких превентивно лікували введенням КФП, корелювала зі ступенем інгібіції експансії СРК і, в першу чергу, CD44hi клітин.

1. Бондарович Н.А. Состояние иммунной системы мышей с генетически детерминированным развитием рака молочной железы после применения криоконсервированных клеток фетальной печени / Н.А. Бондарович, М.В. Останков, М.А. Сироус, Л.В. Останкова, А.Н. Гольцев // Вестник ХНУ, серия: Биология. - 2006. - Т.4, №748. - С.110 -120.

2. Бондарович Н.А. Использование клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.А. Сироус, К.А. Гольцев, М.В. Останков, А.Н. Гольцев // Світ медицини та біології. - 2007. - №1. - С.40 - 46.

3. Останков М.В. Характер изменения структурно-функциональных характеристик клеток фетальной печени после криоконсервирования в зависимости от их сроков гестации / М.В. Останков, Н.А. Бондарович, И.В.Рассоха, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №3. - С. 302-305.

4. Бондарович Н.А. Определение содержания CD44 CD24- клеток как дополнительный критерий оценки эффективности превентивной терапии онкопатологии в эксперименте / Н.А. Бондарович, К.А. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т.18, №1. - С. 5-9.

5. Бондарович Н.А. Применение клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы при развитии рака молочной железы / Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.В. Останков, М.А. Сироус // Зб. наукових статей „Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики”. - 2009. - Т. 2. - Вип. XXII. - C. 23 - 26.

6. Бондарович Н.А. Модулирующее влияние клеток эмбриональной печени на показатели иммунной системы мышей с онкопатологией в разные возрастные периоды их индивидуального развития / Н.А. Бондарович, О.В. Якимович, М.В. Останков, М.А. Сироус // Сучасні проблеми експериментальної онкології: VI конференція молодих онкологів України, 4-5 груд. 2003р.: тези допов. - Київ, 2003. - С.9.

7. Гольцев А.М. Вплив клітин ембріональної печінки на стан лімфогемопоетичної системи при онкопатології / А.М. Гольцев, М.О. Бондарович, М.В. Останков, О.Д. Луценко, К.А. Гольцев // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т.3, №2, Ч.2. - С. 366-368.

8. Бондарович М.О. Трансплантація КЕП як метод імунотерапії при раку молочної залози / М.О. Бондарович, А.М. Гольцев, О.М. Шатнєва // Молодь і поступ біології: I міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів, 11-14 квіт. 2005р.: тези допов. - Львів, 2005. - С.142.

9. Бондарович Н.А. Возможные пути коррекции возрастных нарушений структуры и функции лимфогемопоэтического комплекса у мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, А.Н. Гольцев // Проблемы старения и долголетия: IV Національний конгрес геронтологів і геріатрів України, 11-13 жовт. 2005р.: тези допов. - Київ, 2005. - С.11 - 12.

10. Бондарович Н.А. Морфофункциональная характеристика лимфогемопоэтической ткани мышей линии С3Н до и после применения криоконсервированных продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №4. - С.725.

11. Бондарович Н.А. Изменение лимфогемопоэтического комплекса у мышей с ускоренным старением и возможные пути его коррекции / Н.А Бондарович, М.В. Останков, К.А. Гольцев, М.А. Сироус, О.М. Шатнева // Актуальні проблеми геронтології та геріатрії: наукова конференція молодих вчених з міжнародною участю, 27 січ. 2006 р.: тези допов. - Київ, 2006. - С.24 - 25.

12. Бондарович Н.А. Оценка иммунокорригирующего эффекта криоконсервированных клеток фетальной печени у мышей линии С3Н / Н.А. Бондарович, М.А. Сироус, Е.Е. Ямпольская, К.А. Гольцев, М.В. Останков // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: VII міжнародна конференція молодих онкологів, 2-3 лют. 2006 р.: тези допов.-Київ, 2006.- С.15.

13. Бондарович Н.А. Изменение состояния лимфогемопоэтической системы при развитии рака молочной железы и возможные пути ее коррекции / Н.А. Бондарович, Л.В. Останкова, М.В. Останков, М.А. Сироус, К.А. Гольцев // Медицина третього тисячоліття: міжвузівська конференція молодих вчених, 17-18 січ. 2006 р.: тези допов. - Харків, 2006. - С. 5- 6.

14. Бондарович Н.А. Состояние лимфогемопоэтического комплекса у мышей линии С3Н/HELAC и возможные пути его коррекции / Н.А. Бондарович, М.В. Останков, М.А. Сироус, К.А. Гольцев // Хист. - 2006. - Вип. 8. - С.34.

15. Гольцев А.М. Стан лімфогемопоетичної системи тварин на різних етапах онкопроцесу / А.М. Гольцев, М.О. Бондарович, Л.В. Останкова, Т.Г. Дубрава, Ю.О. Козлова // Другий зізд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовт. 2007р.: тези допов. - Київ, 2007. - С.212.

16. Гольцев А.Н. Экспериментальное обоснование целесообразности использования криоконсервированных клеток фетальной печени для коррекции иммунной системы при развитии рака молочной железы / А.Н. Гольцев, Н.А. Бондарович, М.В. Останков, О.В. Сафранчук, М.А.Сироус // Імунологія та алергологія.- 2007. - №3. - С.96.

17. Бондарович М. Вплив клітин фетальної печінки на стан імунного статусу мишей лінії С3Н / М. Бондарович, К. Гольцев, О. Сафранчук, Є. Порожан // Молодь та поступ біології: III Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів, 23-27 квіт. 2007 р. - Львів, 2007. - С. 336.

18. Бондарович Н.А. Обоснование применения клеток фетальной печени в лечении рака молочной железы / Н.А. Бондарович, Е.А. Порожан, К.А. Гольцев, М.В. Останков, А.Н. Гольцев // Лекарственные средства и биологически активные соединения: Международная научная конференция, 11-12 окт. 2007 р.: тези. допов. - Гродно, 2007. - С.15 - 16.

19. Бондарович Н.А. Особенности возрастных характеристик иммунного статуса при развитии РМЖ и возможные пути его коррекции / Н.А. Бондарович // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: IX Міжнародна конференція молодих онкологів, 23-24 квіт. 2008 р.: тези допов. - Київ, 2008. - С.28.

20. Бондарович Н.А. Исследование содержания стволовых раковых клеток как дополнительный критерий оценки эффективности превентивной терапии онкопатологии криоконсервированными клетками фетальной печени / Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.А. Сироус // Холод в биологии и медицине: Ежегодная конференция молодых ученых, 28-29 мая 2009 р.: тези допов. - Харків, 2009. - С.20.

21. Goltsev A.N. Modifying effect of cryopreservation on anti-tumor activity of FLCS / A.N. Goltsev, N.A. Bondarovich, O.V. Safranchuk, M.V. Ostankov // Application of cryopreservation from human tissue Engineering to plant genebank integration: conference of cryobyology, 7-9 sept. 2009 y.: abstracts of reports.- Hanover, 2009.- P.39.

22. Гольцев А.Н. Модифицирующий эффект криоконсервирования на противоопухолевую и иммуномодулирующую активность КФП / А.Н. Гольцев, Н.А. Бондарович, О.В. Сафранчук, М.В. Останков // Імунологія та алергологія. - 2009. - №2-3. - С.146.