Отримання трансфер-фактору антирабічного та його імунобіологічні властивості - Автореферат

Сказ залишається однією із найнебезпечніших антропозоонозних інфекцій і створює постійну епізоотичну та епідемічну напругу у багатьох регіонах України. У той же час, як свідчить аналіз сучасних даних щодо механізмів імунітету відносно різноманітних внутрішньоклітинних патогенів, з великою долею ймовірності можна апріорно стверджувати про важливість клітинного імунітету при сказі, збудник якого в процесі репродукції модифікує антигенний склад цитоплазми уражених клітин, що безперечно сприяє їх ранній ідентифікації та знешкодженню спеціалізованими клітинами, зокрема Т-лімфоцитами. Серед останніх добре зарекомендували себе препарати на основі трансфер-фактору. Враховуючи ряд суттєвих переваг трансфер-фактору над іншими імуномодуляторами, зокрема, оперативність створення ним активного імунітету, відсутність у його складі трансплантаційних антигенів, гіпоалергенність, безпечність застосування та низьку вартість, доцільним стає питання щодо отримання трансфер-фактору антирабічного та вивчення його імунобіологічних властивостей на предмет можливого використання в процесі розробки відповідних препаратів та їх застосування в практиці боротьби зі сказом. здійснити перенесення гіперчутливості сповільненого типу до збудника сказу від сенсибілізованих донорів (свиней) до інтактних ксеногенних реципієнтів (морських свинок та білих мишей) за допомогою трансфер-фактору антирабічного;Як тварин-донорів трансфер-фактору антирабічного використали свиней породи велика біла, масою тіла 80 - 90 кг, віком 7 - 8 міс., а як тварин-реципієнтів - білих нелінійних мишей масою 18 - 20 г та нелінійних морських свинок масою 250 - 300 г. Для імунізації свиней з метою отримання трансфер-фактору та вивчення реакцій клітинного та гуморального імунітету при введенні антирабічної вакцини застосовували інактивовану концентровану антирабічну культуральну вакцину КОКАВ, виготовлену із культури виробничого штаму вірусу сказу “Внуково-32”, виробництва НДІ поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН. При вивченні адювантних властивостей препарату трансфер-фактору за антирабічної імунізації лабораторних тварин застосовували вакцину антирабічну інактивовану суху культуральну із штаму “Щолково 51-К” серія № 2 (Херсонська державна біофабрика). Свиням другої групи вакцину вводили триразово - на першу, сьому та 21-у добу, а третьої групи (контроль) замість вакцини вводили стерильний апірогенний 0,85% розчин NACL. Забій тварин першої групи і відбір матеріалу для виготовлення діалізного екстракту лімфоцитів проводили на 7 добу після одноразового введення вакцини, другої - на 7 добу після третьої вакцинації, третьої - одночасно з тваринами другої групи.Максимального значення кількість В-лімфоцитів набула на сьому добу і становила 3,62 ± 0,369 Г/л, що вірогідно перевищувало показники до імунізації (Р <0,001) і аналогічні показники після одноразового введення вакцини (Р <0,01). Відносна концентрація ?-глобулінів у сироватці крові зростала і набула максимального значення на третю добу після введення вакцини, що на 12,82 % перевищувало показник до вакцинації (Р <0,001), залишаючись підвищеною на 7-та 21-у добу. Напередодні вакцинації у 25% досліджених тварин у сироватці крові спостерігалось формування ЦІК малих розмірів, у 50% - ЦІК середніх розмірів і у 25% тварин - великих розмірів, а, починаючи з першої доби після вакцинації, і протягом усього періоду досліджень у дослідних тварин спостерігалось переважне формування у сироватці крові нормальних ЦІК середніх або великих розмірів, що свідчить про ефективну і безпечну активацію імунної відповіді на введення антирабічної вакцини. Так, вже через пять діб після другого введення рабічного антигену у тварин, яким ТФ ввели за добу до першої вакцинації, фагоцитарна активність нейтрофілів підвищилася на 4,6 %, а після третього введення - на 10,6 % порівняно з такою перед початком досліду, а відносно показників четвертої та контрольної груп різниця становила відповідно 4,4 % і 8,4 % після другої вакцинації та відповідно 5,2 і 13,2 % після третього введення вакцини (Р <0,001). Слід зазначити, що кількість Т-лімфоцитів у периферійній крові тварин при введенні трансфер-фактору за добу до першої вакцинації (перша група) вірогідно переважала аналогічні показники свинок другої та третьої груп, яким трансфер-фактор вводили відповідно одночасно з вакциною та наступної добу після вакцинації (Р <0,001).Експериментально обґрунтовано отримання активних зразків трансфер-фактору антирабічного при імунізації свиней-донорів концентрованою культуральною антирабічною вакциною, визначено його імунобіологічну активність щодо модуляції факторів клітинного імунітету у ксеногенних реципієнтів та встановлено протективну дію трансфер-фактору у білих мишей при експериментальній рабічній інфекції. Встановлено, що зразки трансфер-фактору антирабічного, отримані із лімфоїдних органів при триразовому введенні свиням-донорам вакцини КОКАВ, за здатністю стимулювати провідні імунологічні показники, переважають аналогічні зразки при одноразов

2. Основний зміст роботи

Дослідження імунітету тварин-донорів трансфер-фактору. На початку досліджень здійснили імунізацію свиней-донорів трансфер-фактору антирабічною вакциною. Дослідження реакцій клітинного імунітету за антирабічної імунізації показали, що більш виражена алергійна реакція спостерігалась у тварин, яким антирабічну вакцину КОКАВ вводили триразово. Товщина шкірної складки на 48-у годину після внутрішньошкірного введення алергену набула у них максимального значення та становила 1,72 ± 0,045 см і перевищувала аналогічний показник до вакцинації на 1,35 см та на 0,47 см - показники одноразово вакцинованих свиней (Р < 0,01). У всіх дослідних тварин потовщення шкірної складки супроводжувалося еритемою та локальною гіпертермією, які зникали через 96 - 120 годин.

Крім алергійної проби здійснили постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів (РІМЛ) периферійної крові. Середня маса спроектованих зон міграції лейкоцитів тварин контрольної групи становила 11,01 ± 0,969 мг, першої дослідної групи - 7,10 ± 0,592 мг, а індекс міграції (ІМ) після одноразового введення вакцини становив у присутності антигену 0,65 ± 0,086. Після третього введення вакцини середня маса спроектованих зон міграції лейкоцитів у свиней другої групи становила 6,28 ± 0,432 мг, а ІМ - 0,58 ± 0,063. Різниця за ІМ лейкоцитів після одноразової та триразової вакцинації була невірогідною. Отримані в РІМЛ показники сенсибілізації свиней-донорів ДЕЛ підтверджують дані алергійної проби та свідчать про перевагу її інтенсивності при триразовому введенні антирабічної вакцини.

Дослідження кількості лімфоцитів крові свиней показало їх збільшення вже на першу добу після вакцинації (Р 0,05), однак абсолютна їх кількість вірогідно перевищувала аналогічні показники однократно вакцинованих тварин. Максимального значення кількість В-лімфоцитів набула на сьому добу і становила 3,62 ± 0,369 Г/л, що вірогідно перевищувало показники до імунізації (Р < 0,001) і аналогічні показники після одноразового введення вакцини (Р < 0,01). Абсолютна кількість Т-теофілінрезистентних клітин (хелперів) на третю та сьому добу перевищував відповідно на 2,11 та 4,87 Г/л аналогічні показники після одноразової вакцинації (Р < 0,001).

Таблиця 1 Вміст лімфоцитів та їх популяцій в периферійній крові свиней після одноразового введення антирабічної вакцини

Клітини Строки дослідження після введення вакцини, діб

1 3 7 14 21

Лімфоцити, Г/л 8,73 ± 1,227 12,27 ± 1,135 5,58 ± 0,258 5,16 ± 0,155 5,08 ± 0,169

Т-лімфоцити % 46,33 ± 1,795 51,83 ± 1,067 56,88 ± 1,863 56,83 ± 1,344 55,67 ± 0,943

Т-лімфоцити, Г/л 4,03 ± 0,486 6,36 ± 0,580 3,28 ± 0,199 2,96 ± 0,158 2,83 ± 0,083

В-лімфоцити, % 17,33 ± 0,943 18,5 ± 1,258 22,83 ± 2,034 21,0 ± 1,915 20,17 ± 1,067

В-лімфоцити, Г/л 1,51 ± 0,199 2,27 ± 0,224 1,32 ± 0,145 1,08 ± 0,079 1,13 ± 0,068

О-лімфоцити, % 36,33 ± 2,285 29,67 ± 1,599 20,33 ± 2,981 22,17 ± 2,734 24,17 ± 1,067

О-лімфоцити, Г/л 3,20 ± 0,590 3,65 ± 0,438 1,28 ± 0,291 1,14 ± 0,153 1,23 ± 0,068

Т-теофілінрезистентні, % 33,50 ± 0,957 40,17 ± 1,067 43,83 ± 1,344 42,17 ± 1,863 33,5 ± 0,957

Т-теофілінрезистентні, Г/л 2,91 ± 0,3428 4,93 ± 0,443 2,53 ± 0,182 2,14 ± 0,085 1,70 ± 0,093

Т-теофілінчутливі, % 12,67 ± 1,374 11,67 ± 0,745 13,0 ± 2,160 14,67 ± 1,106 22,0 ± 1,414

Т- теофілінчутливі, Г/л 1,10 ± 0,1846 1,43 ± 0,169 0,75 ± 0,123 0,76 ± 0,046 1,12 ± 0,054

Вміст загального білку в сироватці крові є одним із факторів, що відображає неспецифічну резистентність організму. Наші дослідження показали, що вірогідне збільшення рівня загального білку в сироватці крові свиней спостерігалося на третю добу після вакцинації (Р < 0,001). При цьому концентрація загального білку на третю добу перевищувала відповідний показник перед введенням препарату на 7,16 г/л. На 7- та 21- у добу вміст загального білку у сироватці крові залишався підвищеним, а різниця була вірогідною порівняно з відповідним показником перед введенням вакцини (Р < 0,01). Відносна концентрація ?-глобулінів у сироватці крові зростала і набула максимального значення на третю добу після введення вакцини, що на 12,82 % перевищувало показник до вакцинації (Р < 0,001), залишаючись підвищеною на 7- та 21-у добу.

Час обліку результатів дослідження, діб

Вміст антирабічних антитіл у сироватці крові свиней другої групи на 28-у добу після введення вакцини у розведенні сироваток 1 : 5 становив 14,5 ± 0,48 МО/мл і вірогідно перевищував аналогічний показник тварин першої групи на 5,1 МО/мл (Р < 0,01). При розведенні сироваток 1 : 10 даний показник перевищував аналогічний у одноразово вакцинованих тварин на 3,1 МО/мл і складав 7,8 МО/мл, а при розведенні 1 : 20 - на 1 МО/мл і становив 3,5 МО/мл (Р < 0,001).

Таким чином, триразове введення свиням антирабічної вакцини КОКАВ призводить до більш інтенсивної антитілопродукції, ніж одноразове.

Вивчення формування циркулюючих імунних комплексів під впливом антирабічної вакцини здійснювали з метою додаткового вивчення гуморальної ланки імунної відповіді вакцинованих свиней. Встановлено, що максимальне підвищення рівня ЦІК було на третю добу після вакцинації і становило 2,66 ± 0,05 мг/мл (табл. 2). Рівень ЦІК залишався підвищеним впродовж усього періоду досліджень. Напередодні вакцинації у 25% досліджених тварин у сироватці крові спостерігалось формування ЦІК малих розмірів, у 50% - ЦІК середніх розмірів і у 25% тварин - великих розмірів, а, починаючи з першої доби після вакцинації, і протягом усього періоду досліджень у дослідних тварин спостерігалось переважне формування у сироватці крові нормальних ЦІК середніх або великих розмірів, що свідчить про ефективну і безпечну активацію імунної відповіді на введення антирабічної вакцини.

Таблиця 2 Концентрація ЦІК у сироватці крові свиней під впливом антирабічної вакцини, г/л

Показник Термін дослідження

До вакцинації після вакцинації, діб

1 2 3 7 21

Концентрація ЦІК, г/л 1,68 ± 0,24 2,13 ± 0,21 2,12 ± 0,02 2,66 ± 0,05 2,08 ± 0,18 2,31 ± 0,71

Р - > 0,01 > 0,01 0,01 < 0,01

Амінокислотний аналіз зразків ТФ антирабічного. Загальний вміст амінокислот у препараті, отриманому із селезінки та лімфатичних вузлів одноразово вакцинованих донорів, складав 241,5 мг/100 мл. Серед визначених амінокислот найбільше було глютаміну - 28,8, дещо менше проліну - 26,1 та лейцину - 21,4 мг/100мл. Помітно менше лізину - 19,7, аланіну - 19,1 та серину - 19,5 мг/100 мл. Вміст гліцину та аспарагіну становив відповідно 13,6 та 10,7 мг/100 мл. У найменшій кількості виявлені цистин та аргінін - відповідно 3,4 та 4,9 мг/ 100 мл.

Вплив ТФ на оксидативну реакцію нейтрофілів. Відзначено стимулюючий вплив трансфер-фактору антирабічного та Комбіферону на оксидативну реакцію нейтрофілів периферійної крові кроля (табл. 3). Встановлено, що найвища концентрація Н2О2 відзначалася у пробах, де клітини інкубували з трансфер-фактором антирабічним нерозведеним, у дозі 50 мкл на лунку і становила 300 ММ, а оптична щільність вмісту при ? = 620 нм складала 1,290 ± 0,075 оптичних одиниць, що вірогідно перевищувало показники контрольних проб (Р < 0,001).Оптимальним для стимуляції оксидативної реакції поліморфонуклеарних лейкоцитів виявилося розведення Комбіферону 1 : 100, у якому концентрація ІФН-? та ІФН-? складала відповідно 1 х 104 та 1 х 103 МО/мл. Комбіноване застосування обох цитокінів дещо слабше стимулювало продукцію пероксиду водню у досліджуваних пробах, хоча концентрація Н2О2 теж перевищувала відповідні показники контрольних проб на 91,86 ММ/мл (Р < 0,01).

Таблиця 3 Вплив трансфер-фактору антирабічного та препарату Комбіферон на оксидативну реакцію поліморфонуклеарних лейкоцитів кроля

Проба Препарат Доза на лунку, мкл Оптична щільність вмісту, ? = 620нм Концентрація пероксиду водню, 1 ТФ антирабічний нерозведений 50 1,290 ± 0,075 300

2 ТФ антирабічний Комбіферон активністю 1х104 25 25 1,189 ± 0,114 276,51

3 Комбіферон активністю 1х105 МО 50 0,642 ± 0,053 149,30

4 Комбіферон 1х104 МО 50 1,243 ± 0,130 289,07

5 Комбіферон 1х103 МО 50 1,038 ± 0,013 241,40

6 Контроль без препаратів цитокінів - 0,794 ± 0,109 184,65

7 Контроль - пероксид водню з концентрацією 10ММ/мл без пероксидази та клітинної суспензії - 0,043 ± 0,002 10

Вплив трансфер-фактору антирабічного на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів мишей. Дослідження показало стимулюючий вплив ТФ на фагоцитарну активність клітин системи мононуклеарних фагоцитів (СМФ). Кількість фагоцитуючих макрофагів була значно вищою у мишей, яким вводили трансфер-фактор антирабічний, дещо меншою при використанні Комбіферону, але вірогідно перевищувала показник контрольної групи (Р 0,05) (табл. 4).

Вплив трансфер-фактору на фагоцитарну активність нейтрофілів.

Встановлено, що введення антигену та ТФ антирабічного суттєво посилює in vivo фагоцитарну активність нейтрофілів у морських свинок (табл. 5). Так, вже через пять діб після другого введення рабічного антигену у тварин, яким ТФ ввели за добу до першої вакцинації, фагоцитарна активність нейтрофілів підвищилася на 4,6 %, а після третього введення - на 10,6 % порівняно з такою перед початком досліду, а відносно показників четвертої та контрольної груп різниця становила відповідно 4,4 % і 8,4 % після другої вакцинації та відповідно 5,2 і 13,2 % після третього введення вакцини (Р < 0,001). Тенденція до активації фагоцитозу поліморфонуклеарів спостерігалася у всіх групах тварин, яким вводили трансфер-фактор як після другого введеня вакцини, так і після третього.

Таблиця 4 Вплив трансфер-фактору антирабічного та Комбіферону на кількість перитонеальних макрофагів у мишей

Введений імуномодулятор Вміст перитонеальних макрофагів окремих субкласів, % молоді клітини Зрілі (в стадії каріопікнозу) фагоцитуючі макрофаги макрофаги з підвищеною фагоцитарною активністю

Трансфер-фактор антирабічний 5,0 ± 1,41 34,0 ± 6,2 28,6 ± 2,80 32,4 ± 5,50

Комбіферон активністю 1х106 МО 4,8 ± 0,75 39,6 ± 2,42 21,8 ± 1,94 33,8 ± 2,40

Еритроцити кроля 16,4 ± 2,73 51,2 ± 1,17 14,4 ± 3,26 18,0 ± 2,00

0,9% розчин NACL 14,2 ± 1,47 50,0 ± 2,10 19,0 ± 0,89 15,8 ± 2,32

Таблиця 5 Вплив препарату ТФ антирабічного на фагоцитарну активність нейтрофілів морських свинок

Фагоцитарна активність, % Фагоцитарний індекс, M ± m

Група до імунізації ч/з 5 діб після другої вакцинації ч/з пять діб після третьої вакцинації до імунізації ч/з пять діб після другої вакцинації ч/з 5 діб після третьої вакцинації

1 34,4 ± 0,68 39,0 ± 0,32 45,0 ± 0,45 6,9 ± 0,32 8,6 ± 0,17 9,6 ± 0,07

2 33,2 ± 0,86 36,2 ± 0,58 43,2 ± 0,37 6,6 ± 0,31 8,1 ± 0,11 9,3 ± 0,13

3 33,2 ± 0,86 35,8 ± 0,37 40,2 ± 0,58 6,6 ± 0,28 7,2 ± 0,11 8,9 ± 0,13

4 32,4 ± 1,20 34,6 ± 0,59 39,8 ± 0,58 6,4 ± 0,35 6,9 ± 0,22 9,1 ± 0,04

5 32,4 ± 0,81 31,6 ± 0,59 31,8 ± 0,58 6,3 ± 0,25 6,0 ± 0,16 6,1 ± 0,12

Підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів корелювало із збільшенням абсолютної кількості лейкоцитів у крові імунізованих тварин, що було особливо вираженим у тварин першої та другої груп.

Адювантні властивості трансфер-фактору. У досліді по вивченню адювантних властивостей трансфер-фактору встановлено, що введення ТФ морським свинкам одночасно з антирабічною вакциною та за добу до чи після вакцинації спричиняло підвищенню кількості еритроцитів та вмісту гемоглобіну крові. За цими показниками тварини, імунізовані лише рабічним антигеном суттєво не відрізнялися від контрольних аналогів. Абсолютна кількість лімфоцитів у крові морських свинок, імунізованих антирабічною вакциною, при введенні у різний термін трансфер-фактору проявляла тенденцією до зростання після ревакцинації як по відношенню до контрольних тварин, так і по відношенню до вакцинованих КАВ, а також до показників, одержаних до вакцинації. Така ж тенденція спостерігалася і після третього введення вакцини. Вміст лімфоцитів у крові тварин, яким вводили ТФ за добу до першого введення вакцини, був вищим порівняно з контрольними тваринами на 28,9 % і на 20,3 % порівняно з тваринами четвертої групи, яким вводили лише вакцину (Р < 0,001). Цей показник був вищим також у тварин другої та третьої дослідних груп порівняно з показниками, отриманими при дослідженні тварин четвертої та контрольної груп (Р < 0,01) (табл. 6).

Таблиця 6 Динаміка змін загальної кількості Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій під впливом антирабічного ТФ та вакцини КАВ у морських свинок, Г/л

Т-лімфоцити Т-теофілінрезистентні Т-теофілінчутливі

Група до вакцинації після вакцинації до вакцинації через 5 діб після вакцинації До вакцинації Після вакцинації

2-ї 3-ї 2-ї 3-ї 2-ї 3-ї

1 1,61 ± 0,058 2,41 ± 0,045 2,52 ± 0.032 1,20 ± 0,042 2,08 ± 0,074 2,23 ± 0,019 0,41 ± 0,031 0,34 ± 0,040 0,30 ± 0,046

2 1,51 ± 0,037 2,15 ± 0,035 2,28 ± 0,024 1,08 ± 0,042 1,77 ± 0,059 1,93 ± 0,018 0,42 ± 0,044 0,38 ± 0,044 0,35 ± 0,026

3 1,48 ± 0,048 2,01 ± 0,019 2,06 ± 0,029 1,07 ± 0,056 1,60 ± 0,039 1,68 ± 0,032 0,41± 0,047 0,41 ± 0,039 0,38 ± 0,025

4 1,32 ± 0,087 1,55 ± 0,069 1,75 ± 0,269 0,97 ± 0,056 1,31 ± 0,041 1,39 ± 0,050 0,35 ± 0,051 0,25 ± 0,042 0,36 ± 0,042

5 1,52 ± 0,071 1,40 ± 0,023 1,39 ± 0,017 1,04 ± 0,052 0,97 ± 0,038 0,98 ± 0,026 0,48 ± 0,041 0,43 ± 0,046 0,41 ± 0,034

Слід зазначити, що кількість Т-лімфоцитів у периферійній крові тварин при введенні трансфер-фактору за добу до першої вакцинації (перша група) вірогідно переважала аналогічні показники свинок другої та третьої груп, яким трансфер-фактор вводили відповідно одночасно з вакциною та наступної добу після вакцинації (Р < 0,001). За абсолютною кількістю Т-теофілінрезистентних клітин у крові тварини першої, другої та третьої груп, яким вводили зразки трансфер-фактору, вірогідно переважали аналогів четвертої групи, яким проводили інєкцію лише вакцини (Р < 0,001). За кількістю Т-теофілінчутливих клітин у крові тварин дослідних і контрольної груп не виявлено її чіткої залежності від досліджуваного фактора.

Вплив трансфер-фактору та антирабічної вакцини на бластоутворення лімфоцитів. Інтенсивність бластоутворення у досліджуваних морських свинок змінювалася залежно від схеми імунізації і кратності застосування антирабічної вакцини КОКАВ та тестованих зразків трансфер-фактору і була найвищою за триразового сумісного введення. Так, після одночасного введення КОКАВ та ТФС-1 (зразку із селезінки одноразово вакцинованих свиней) спостерігалося значне збільшення кількості лімфобластів порівняно з відповідними показниками свинок перших трьох груп. Різниця між показниками кількості лімфобластів у тварин четвертої групи у присутності антигену порівняно з відповідними показниками першої групи склала 8,38 %, другої - 8,8 %, і з показниками контролю - 13,58 % (Р < 0,001), а у присутності ФГА - відповідно 4,08; 1,66; 3,58 %. Триразове комбіноване введення КОКАВ з ТФС-1 призвело до подальшого зростання відносного вмісту лімфобластів.

Слід відзначити суттєве зростання бластоутворення у морських свинок четвертої групи порівняно з аналогами перших трьох груп, в яких рабічний антиген та трансфер-фактор вводилися триразово не в комбінації один з одним (Р < 0,001).

Кількість бластів, що сформувалися у досліджуваних пробах крові свинок пятої групи після трикратного комбінованого введення КОКАВ і ТФС-3 переважала відповідні показники у контролі в присутності антигену на 23,18 %, а у присутності ФГА - на 13,9 %, а порівняно з триразовим введенням лише вакцини КОКАВ - відповідно на 11,92 % та 10,64 %. Дані показники у свинок пятої дослідної групи вірогідно переважали відповідні показники тварин третьої групи, яким триразово вводили лише ТФС-3 (Р < 0,001). Суттєвих відмінностей щодо впливу ТФС-1 та ТФС-3 на формування бластів при їх комбінованому застосуванні з КОКАВ за трикратною схемою введення не відзначено як у присутності рабічного антигену, так і ФГА.

Таким чином, результати досліду свідчать про те, що комбінований стимулюючий механізм ТФ антирабічного - з одного боку полягає у неспецифічному посиленні проліферації у відповідь на фітогемаглютинін, з іншого - у специфічній стимуляції лімфоцитів, сенсибілізованих рабічним антигеном, про що свідчить зростання кількості бластів у присутності специфічного антигену, а не лише ФГА.

Вплив ТФ антирабічного на Е-розеткоутворення у Т-лімфоцитів. Дослідження по відновленню Е-розеткоутворення Т-лімфоцитами після їх обробки трипсином показало, що зразки ДЕЛ, виділені із клітин донорів, яким КОКАВ вводили триразово, певною мірою відрізнялися за здатністю до стимуляції розеткоутворення. Найактивнішим виявився зразок із селезінки ТФС-3 (табл. 7).

Таблиця 7 Вміст розеткоутворючих клітин під впливом ТФ антирабічного %.

Зразок ТФ Лімфоцити Вміст Е-РУК після інкубації із ЗРАЗКОМТФ розведення препарату нерозведений : 10 : 100 : 1000

ТФС-1 нетрипсинізовані 67,45 ± 1,891 58,52 ± 1,059 51,45 ± 1,237 45,38 ± 0,847 трипсинізовані 36,90 ± 2,007 32,10 ± 2,228 23,12 ± 1,336 17,30 ± 0,748

ТФС-3 нетрипсинізовані 70,60 ± 2,148 61,40 ± 2,058 51,40 ± 1,237 46,80 ± 1,337 трипсинізовані 38,55 ± 1,301 32,48 ± 1,513 24,57 ± 1,415 14,15 ± 1,009

ТФЛ/в-1 нетрипсинізовані 54,93 ± 0,884 45,17 ± 0,941 45,48 ± 1,180 45,02 ± 0,847 трипсинізовані 28,87 ± 1,579 20,80 ± 0,933 13,13 ± 0,921 6,75 ± 0,373

ТФЛ/в-3 нетрипсинізовані 61,83 ± 1,662 56,03 ± 1,212 48,05 ± 0,920 44,05 ± 0,804 трипсинізовані 39,93 ± 1,110 34,17 ± 1,306 22,12 ± 1,348 12,78 ± 0,706

Рабіфарм нетрипсинізовані 69,38 ± 1,332 66,63 ± 1,565 48,85 ± 2,277 45,02 ± 1,206 трипсинізовані 41,35 ± 1,238 32,30 ± 1,318 26,72 ± 1,239 15,55 ± 0,873 до трипсинізації (контроль 1) 45,33 ± 1,106 після трипсинізації (контроль 2) 6,00 ± 0,117

Здатність відновлювати кількість Е-РУК після трипсинізації відзначалась у всіх досліджуваних зразків ДЕЛ. Навіть у розведенні 1 : 1000 зразки ТФС-1, ТФС-3, ТФЛ/в-3 спричиняли вірогідне підвищення вмісту розеткоутворюючих клітин після інкубації оброблених трипсином лімфоцитів порівняно з контролем (Р < 0,01). Зразок ТФ л/в-1 виявився найменш активним. Вже в розведенні 1 : 10 він не викликав збільшення кількості Е-РУК у нетрипсинізованих пробах, а у розведенні 1 : 1000 - не підвищував кількості Е-РУК і в трипсинізованих пробах.

Перенесення гіперчутливості сповільненого типу до збудника сказу досліджуваними зразками трансфер-фактору. Здійснюючи порівняльне вивчення інтенсивності реакцій гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) методом шкірної проби на білих мишах при введенні антигеноспецифічних препаратів трансфер-фактору та ДЕЛ, отриманих від невакцинованих проти сказу донорів, було встановлено, що максимальне потовщення складки плюсневого мякушу правої кінцівки, куди вводили алерген, спостерігалося на 72-у годину від постановки шкірної проби (табл. 8).

Таблиця 8 Результати постановки алергійної шкірної проби на білих мишах, сенсибілізованих препаратами ДЕЛ (товщина шкірної складки, мм)

Група Введений зразок До введення Після алергопроби, годин

24 48 72 96 120

1 ТФС1 1,46 ± 0,055 2,42 ± 0,037 2,62 ± 0,088 2,63 ± 0,064 2,36 ± 0,094 1,77 ± 0,055

2 ТФЛ/в 1 2,21 ± 0,057 2,33 ± 0,071 2,19 ± 0,052 1,94 ± 0,097 1,60 ± 0,094

3 ТФС 3 2,80 ± 0,042 2,96 ± 0,099 3,13 ± 0,069 2,58 ± 0,079 1,83 ± 0,127

4 ТФ л/в 3 2,89 ± 0,042 2,94 ± 0,072 2,99 ± 0,079 2,45 ± 0,077 1,77 ± 0,063

5 Рабіфарм 2,46 ± 0,051 2,65 ± 0,085 2,82 ± 0,104 2,23 ± 0,057 1,66 ± 0,056

6 ДЕЛ не спец. 1,79 ± 0,041 1,81 ± 0,032 1,84 ± 0,042 1,74 ± 0,037 1,59 ± 0,046

У тварин третьої групи товщина шкірної складки перевищувала цей показник у контролі на 1,57 мм та на 1,29 мм - відповідні показники у тварин, сенсибілізованих неспецифічним ДЕЛ (Р < 0,001). Менше потовщення спостерігалося на правій кінцівці мишей, оброблених зразком із лімфатичних вузлів одноразово вакцинованих свиней, і становило 2,19 ± 0,052 мм. ДЕЛ із лімфоїдних органів невакцинованих свиней не викликав суттєвого потовщення мякушу під час алергопроби, що підтверджує антигеноспецифічну активність зразків, виділених від вакцинованих свиней. На 96 - 120-у годину з моменту постановки алергопроби товщина плюсневого мякушу правої кінцівки всіх дослідних тварин зменшилася.

У РІМЛ встановлено, що найактивніше пригнічення міграції спостерігалося при обробці клітин нерозведеним ТФ та послідуючою інкубацією з рабічним антигеном. Порівнюючи здатність тестованих зразків ДЕЛ щодо сенсибілізації спленоцитів in vitro до збудника сказу, встановлено, що найактивнішим виявився зразок, отриманий із селезінки одноразово вакцинованих свиней (ТФС-1). Індекс міграції сенсибілізованих даним зразком тест-клітин при контакті з специфічним антигеном становив 43,81 %, що було вірогідно меншим за показники контролю (Р < 0,001).

Менш активними виявилися ДЕЛ із клітин лімфатичних вузлів одноразово (ТФЛ/в-1) та триразово (ТФЛ/в-3) вакцинованих свиней (ІМ становили 49,24 та 53,66 % відповідно). При обробці тест-клітин розведеннями зразків антигеноспецифічного трансфер-фактору більшими, ніж 1 : 2, пригнічення міграції лейкоцитів виявилося невірогідним (Р > 0,05). Без повторного контакту з рабічним антигеном, пригнічення міграції клітин, інкубованих з ТФ, не спостерігалося. Отже, отримані дані вказують на чіткий прояв антигеноспецифічної індукції препаратами ТФ клітинного імунітету у ксеногенних реципієнтів.

Протективна активність трансфер-фактору антирабічного. Встановлено, що при одноразовому внутрішньомязовому введенні мишам ТФ, виділеного із селезінок триразово вакцинованих донорів, за добу до зараження вірулентним штамом вірусу сказу CVS, а також одночасно із зараженням спостерігався виразний захисний ефект тестованого зразку. Так, при введенні ТФ у дозі 100 мкл (еквівалентно діалізату 4 х 107 кл) індекс захисту склав 50 %, а при введенні 40 мкл (еквівалентно діалізату 2,5 х 107 кл) - 16,7... 32,4 %. При цьому вищим він був у тварин, яким препарат вводили за добу до зараження. Усі миші, яким ввели неспецифічний ДЕЛ та тварини контрольної групи, загинули. При внутрішньомязовому введенні ТФ, виділеного з лімфоїдних органів одноразово вакцинованих свиней, у дозі 200 мкл (еквівалентно діалізату 8 х 107 кл) послідовно за 7, 5, 3 та 1 добу до зараження, виживало 83,3 % інфікованих вірусом сказу мишей, що на 50 % перевищувало індекс захисту (ІЗ) тварин, яким ТФ вводили щоденно протягом семи діб до зараження. Слід відзначити, що чотирикратне превентивно-терапевтичне введення ТФ на 3-у і 1-у добу до та на 1-у та 3-у добу після зараження призвело до попередження загибелі 5 із 6 інфікованих мишей (ІЗ становив 83,3 %).

Аналіз отриманих даних показав, що захисний ефект досліджуваних зразків ТФ антирабічного спостерігався як за профілактичного, так і за лікувального його введення. Оптимальним виявилося багатократне введення з інтервалом у дві доби. Застосування ТФ пізніше третьої доби після зараження було неефективним.