Отримання штамів Brevibacterium з підвищеними рівнями синтезу лізину та треоніну - Автореферат

Дисертаційна робота виконана в ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» в рамках відомчих тематик відділу промислової та харчової біотехнології «Розробити наукові основи біотехнологічного процесу одержання харчової добавки - лізину» (2003-2005) № державної реєстрації 0103U005800; «Розроблення наукових основ біотехнології незамінних амінокислот; Створення генетично модифікованого (ГМ) штаму продуценту лізину Brevibacterium sp.» (2007-2011) № державної реєстрації 0107U000443; «Розроблення наукових основ біотехнології незамінних амінокислот треоніну та триптофану» (2009-2013) № державної реєстрації 0109U0000471. Встановлено після дії УФ-опромінення здатність до надсинтезу лізину та треоніну штамами Brevibacterium sp. Філогенетичний аналіз гена 16S РРНК вихідних та мутантних штамів-продуцентів лізину та треоніну дозволив встановити, що гомологія нуклеотидних послідовностей гена 16S РРНК вихідного штаму-продуценту лізину Brevibacterium sp. За допомогою фізичного (УФ) мутагенезу отримано перспективні стабільні мутантні штами-продуценти лізину та треоніну, що поповнюють Колекцію штамів мікроорганізмів та ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біотехнології Державної установи «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України». Комплекс проведених досліджень дозволив збільшити продукування треоніну штамом B. flavum ІМВ В-7446 (C. glutamicum) та лізину штамом Brevibacterium sp.Отримано нові штами-продуценти лізину та треоніну Brevibacterium sp. Встановлено, що продуценти лізину Brevibacterium sp. Е531 розщеплювались на два типи колоній (без пігменту та пігментовані), а продуцент треоніну B. flavum ТН7 утворював тільки пігментовані (жовті) колонії. Виявлено, що клони зберігали ауксотрофність за лейцином та набували залежності до треоніну, метіоніну, триптофану і ізолейцину. Е531, B. flavum ТН7 за допомогою УФ опромінення та отримано стійкі мутантні штами-продуценти лізину та треоніну Brevibacterium sp.

Отримано нові штами-продуценти лізину та треоніну Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 та B. flavum IMB B-7446, відповідно. Вивчено їх біологічні особливості та визначено біосинтетичну здатність до підвищеного синтезу цільових амінокислот при оптимальних умовах культивування.

1. Проведено клоновий аналіз штамів-продуцентів лізину та треоніну. Встановлено, що продуценти лізину Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531 розщеплювались на два типи колоній (без пігменту та пігментовані), а продуцент треоніну B. flavum ТН7 утворював тільки пігментовані (жовті) колонії.

2. Визначена ауксотрофність клонів з найбільшою продуктивністю за цільовими амінокислотами. Виявлено, що клони зберігали ауксотрофність за лейцином та набували залежності до треоніну, метіоніну, триптофану і ізолейцину. Продуцент треоніну B. flavum ТН7 був ауксотрофом за серином та лейцином.

3. Здійснено мутагенез штамів Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531, B. flavum ТН7 за допомогою УФ опромінення та отримано стійкі мутантні штами-продуценти лізину та треоніну Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 та B. flavum ІМВ В-7446, відповідно.

4. Здійснено хімічний мутагенез штамів Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. Е531, B. flavum ТН7 та Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 за допомогою NTG. Кількість лізину та треоніну, що синтезували отримані за допомогою хімічного мутагенезу штами, не перевищувала їх кількість у вихідних штамів. Отримані рожеві колонії Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 “поверталися” до початкового жовтого забарвлення, що свідчить про нестабільні мутації.

5. При проведенні порівняльного аналізу гена 16S РРНК мутантних штамів з вихідними штамами та штамами з бази даних “GENBANK” встановлено, що гомологія Brevibacterium sp. 90 та Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 складає 98%, а штами B. flavum TH7 та B. flavum IMB B-7446 відносяться до виду C. glutamicum.

6. Показано, що оптимізація умов культивування (РН 7,0, Т=31±1°С, кількість кисню 3,0-4,0 ГО2/дм3/год, термін культивування 72 год, джерела вуглеводів - сахароза або меляса (8%), джерела азоту - сірчанокислий амоній (4%), ростові фактори - біотин, кукурудзяний або дріжджовий екстракт) штаму Brevibacterium sp. ІМВ В-7447 підвищила синтез лізину у 8 разів порівняно з вихідним штамом.

7. Показано, що оптимізація умов культивування (РН 7,0, температура 32±1°С, кількість посівного матеріалу 20%, кількість кисню 11,0 ГО2/дм3/год, термін культивування 72 год, джерела вуглеводів - сахароза або меляса, джерела азоту - сірчанокислий амоній, концентрації ростових факторів (г/дм3): проліну - 0,8; тіаміну - 0,002; біотину - 2,0х10-4; дріжджового екстракту - 1,0, концентрації ізолейцину та метіоніну - 0,4 г/дм3 кожної амінокислоти) штаму B. flavum ІМВ В-7446 підвищила синтез треоніну в 6 разів порівняно з вихідним штамом.

1. Threonine synthesis of Brevibacterium flavum mutant strain / G. S. Andriiash, G. M. Zabolotna, A. F. Tkachenko, Ya. B. Blume, S. M. Shulga // Threonine: Food Sources, Functions and Health Benefits / [G. S. Andriiash, G. M. Zabolotna, A. F. Tkachenko, Ya. B. Blume, S. M. Shulga], 2015. - (Nova). - P. 1-26. (Дисертантка разом із співавторами виконала експериментальну частину, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні розділу).

2. Шульга С. М. Інтенсифікація біосинтезу треоніну штамом Brevibacterium flavum TH-7/ С. М. Шульга, О. О. Тігунова, А. Ф. Ткаченко, Н. Є. Бейко, С. І. Прийомов, Г. С. Андріяш // Біотехнологія. - 2011. - №5. - С. 97-103. (Дисертантка разом із співавторами виконала експериментальну частину, брала участь в написанні статті).

3. Андріяш Г. С. Ауксотрофність продуцентів лізину / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, С. М. Шульга. // Біотехнологія. - 2012. - №1. - С. 70-77. (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

4. Андріяш Г. С. Мутантні штами мікроорганізмів-продуцентів лізину та треоніну / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, С. М. Шульга. // Biotechnol. Acta. - 2014. - №3. - С. 95-101. (Дисертантка разом із співавторами приймала участь у проведенні експерименту, опрацювала дані, брала участь в написанні статті).

5. Андріяш Г. С. Філогенетичний аналіз штамів-продуцентів лізину порівнянням послідовностей гена 16S РРНК / Г. С.Андріяш, Г. М. Заболотна, В. С. Бондаренко, С. М. Шульга. // Biotechnol. Acta. - 2014. - №6. - С. 40-45. (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

6. Андріяш Г. С. Характеристика штаму Brevibacterium flavum ІМВ В-7446 та оптимізація біосинтезу треоніну / Г. М. Заболотна, А. Ф. Ткаченко, C. М. Шульга // Мікробіологія і біотехнологія. - 2015. - №2. - С. 68-78. (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

7. Андріяш Г. С. Регулювання та шляхи інтенсифікації біосинтезу лізину / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, С. М. Шульга. // Мікробіологія і біотехнологія. - 2012. - №4. - С. 6-17. (Дисертантка разом із співавторами проаналізувала літературу та підготувала статтю).

8. Андрияш А.С. Способ извлечения L-лизина из культуральной жидкости продуцента / Шульга С.М., Лужков А.М. // Тезисы докладов IV Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2007. - С. 41.

9. Andriiash G. S. Method of lysine extraction from the culture fluid of producent / G. S. Andriiash, S. M. Shulga, A. I. Chomenko // Materials III International Conference “BIOMICROWORLD 2009” (2-4 December, Lisbon, Portugal). - Lisbon, 2009. - Р. 416.

10. Андрияш А. С. Создание генетически модифицированного штамма продуцента лизина / А. С. Андрияш, С. М. Шульга, Г. М. Заболотная // Тезисы докладов V Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009. - С. 433-434.

11. Андрияш А.С. Ауксотрофность промышленных продуцентов лизина / Андрияш А. С., Бейко Н. Е., Заболотная Г. М., Тигунова Е. А., Ткаченко А. Ф., Шульга С. М. // Тезисы докладов VI Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2011. - С. 375-376.

12. Андріяш Г. С. Промислові продуценти лізину - ауксотрофні мутанти / Г. С. Андріяш, Н. Е. Бейко, Г. М. Заболотна, А. Ф. Ткаченко, О. О. Тігунова, С. М. Шульга // Труды первой конф. молодых ученых «Биология растений и биотехнология» ИПБГ НАН Украины. - Белая Церковь, 2011. - С. 92.

13. Andriiash G. Study of strains Brevibacterium as producer of lysine / G. Andriiash, G. Zabolotna, S. Shulga // Abstracts of 15th European Congress on Biotechnology (Istanbul, Turkey), «New biotechnology». - Istanbul, 2012. - V. 29. - Issue S. - P. S57.

14. Shulga S. Tryptophan production by Corynebacterium glutamicum / S. Shulga, A. Tkachenko, N. Beyko, A. Khomenko, G. Andriiash // Abstracts of 15th European Congress on Biotechnology (Istanbul, Turkey), «New biotechnology». - Istanbul. - 2012. - V. 29. - Issue S. - P. S63.

15. Андріяш Г. С. Селекційне вдосконалення штамів-продуцентів лізину Brevibacterium за допомогою УФ-опромінення / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, С. М. Шульга // Матеріали ХІІ конференції молодих вчених «Наукові, прикладні та освітні аспекти фізіології, генетики, біотехнології рослин і мікроорганізмів» (Київ, 15-16 листопада, 2012 р.). - Київ, 2012. - С. 218-219.

16. Андрияш А. С. Получение высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислот / А. С. Андрияш, Г. М. Заболотная, С. М. Шульга // Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва, 2013. - С. 293.

17. Андріяш Г. С. Порівняльний аналіз ауксотрофних мутантів-продуцентів незамінних амінокислот лізину та треоніну / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, О. Ю. Кваско, С. М. Шульга // Біотехнологія XXI століття: Тези доповідей VII Всеукраїнської науково-практичної конференції, присвяченої 115 річниці заснування НТУУ «КПІ» - Київ, 2013. - С. 15.

18. Андріяш Г. С. Мутантні штами-продуценти амінокислот аспартатної родини / Андріяш Г. С. // Друга конференція молодих учених «Біологія рослин та біотехнологія», 23-24 грудня 2013 р. - Київ, 2013. - С. 55.

19. Андріяш Г. С. NTG мутагенез продуцентів лізину / Г. С. Андріяш, Г. М. Заболотна, С. М. Шульга // VIII Всеукраїнської науково-практичної конференції «Біотехнологія XXI століття» присвяченій 200 річниці з дня народження Т. Г. Шевченка, 25 квітня 2014 р. - Київ, 2014. - С. 14.

Размещено на .ru