Особливості взаємодії деяких білків ссавців з мелітином і ліпофорином комах - Автореферат

При повторному попаданні отрути його антигени взаємодіють з IGE на поверхні гладких клітин, викликаючи вивільнення гістаміну, що призводить в кінцевому підсумку до розвитку системних реакцій на бджолину отруту. З іншого боку, за останній час одержано дані про те, що основний пептидний компонент отрути бджоли - мелітин - здатний взаємодіяти з IGG, не виступаючи як антиген (Єфетов К.О., Троїцький Г.В., 1993; Єфетов К.О., 1994), а також із сироватковим альбуміном (Ажицький Д.Г., Ажицький Г.Ю., Борисенко С.Н., 1995; Ажицький Д.Г., 1996). В наших експериментах ми досліджували взаємодію мелітину з IGG і С1q, а також шукали звуязок між наявністю такої взаємодії і виникненням псевдоалергічних реакцій на бджолину отруту. Таким чином, взаємодія сироваткових білків із мелітином із отрути бджоли вивчалась в двох напрямках: 1) досліджувалась можлива роль цих білків в молекулярних механізмах розвитку системних реакцій на бджолину отруту; 2) досліджувалась захисна роль цих білків за літичної дії бджолиної отрути на форменні елементи крові. Мета - вивчити взаємодію білків сироватки крові ссавців з мелітином і ліпофорином комах для зясування нових аспектів патогенної дії бджолиної отрути і розробки нових підходів в імуносистематиці.Дослідження проводилось в кілька етапів із відмиванням планшету між етапами: 1) досліджувана суміш білок:мелітин; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IGG1 M2F9 до мелітину; 4) овечі антитіла до IGG миші, конуюговані з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш (2, 2"-азино-ди-[3-етил-бензтиазолін сульфонат (6)] і пероксид водню в цитрат-NAOH буферному розчині, РН 4,0). Дослідження проводили в кілька етапів із відмиванням планшету між етапами: 1) поліклональний IGG людини; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IGG1 2F11 до IGG людини; 4) овечі антитіла до IGG миші, конуюговані з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш. Дослідження проводили в кілька етапів з відмиванням планшету між етапами: 1) С1q субкомпонент комплементу людини; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) мелітин; 4) моноклональні антитіла миші IGG1 2F11; 5) овечі антитіла до IGG миші, конуюговані з пероксидазою хріну; 6) субстратна суміш. Для вивчення впливу мелітину на взаємодію мишиних моноклональних антитіл з С1q на четвертому етапі замість моноклональних антитіл вносили сироватку крові миші в розведенні 1:800 в ЗФР. Дослідження проводили в кілька етапів з відмиванням планшету між етапами: 1) гемолімфа певного виду, розведена в 500 разів; 2) 1%-ний бичачий сироватковий альбумін; 3) моноклональні антитіла миші IGG Z1C3; 4) овечі антитіла до IGG миші, які конуюгували з пероксидазою хріну; 5) субстратна суміш.За допомогою іонообмінної хроматографії на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М створено нову модифікацію методики розділення папаїнових фрагментів поліклональних імуноглобулінів G людини. Одержано чисті препарати імуноглобулінів і папаїнових фрагментів імуноглобулінів, які використано для вивчення їх взаємодії з мелітином із отрути бджоли. Показано, що мелітин взаємодіє з поліклональними IGG сироватки крові та їх папаїновими фрагментами. За допомогою твердофазного імуноферментного аналізу продемонстровано, що мелітин впливає на специфічну взаємодію антиімуноглобулінових антитіл зі своїми антигенами. Мелітин взаємодіє з Clq субкомпонентом комплементу, що призводить до значного підсилення реакції Clq з IGG, яку можна зареєструвати методом імуноферментного аналізу.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. За допомогою іонообмінної хроматографії на колонці з ДЕАЕ-трисакрилом М створено нову модифікацію методики розділення папаїнових фрагментів поліклональних імуноглобулінів G людини. Одержано чисті препарати імуноглобулінів і папаїнових фрагментів імуноглобулінів, які використано для вивчення їх взаємодії з мелітином із отрути бджоли.

2. Показано, що мелітин взаємодіє з поліклональними IGG сироватки крові та їх папаїновими фрагментами. Результати експериментів свідчать про те, що мелітин звуязується переважно з Fc-фрагментом молекули IGG.

3. За допомогою твердофазного імуноферментного аналізу продемонстровано, що мелітин впливає на специфічну взаємодію антиімуноглобулінових антитіл зі своїми антигенами. При цьому не виявлено неспецифічної взаємодії імуноглобулінів під впливом мелітину.

4. Мелітин взаємодіє з Clq субкомпонентом комплементу, що призводить до значного підсилення реакції Clq з IGG, яку можна зареєструвати методом імуноферментного аналізу. Показано залежність підсилення мелітином специфічних IGG (антиген)-IGG (антитіло) і Clq-IGG взаємодій від РН та іонної сили буферного розчину. Висловлено припущення про значення підсилення мелітином вказаних взаємодій у виникненні у людини системних реакцій на бджолину отруту.

5. Показано, що сироватковий альбумін інгібує мелітин-індукований лізис еритроцитів, a IGG і Clq не проявляють значного інгібуючого ефекту. Разом з тим, сироватковий альбумін також активує витік гемоглобіну із еритроцитів (проінкубованих 10-11 днів при 4°С) під впливом сублітичних концентрацій мелітину. Це свідчить про наявність принаймні двох незалежних механізмів дії мелітину на еритроцитарну мембрану.

6. Одержані нами мишині моноклональні антитіла до ліпофорину гемолімфи імаго Zygaena minos з різною інтенсивністю взаємодіють з ліпофоринами різних видів роду Zygaena, що звуязано з відмінностями в структурі антигенної детермінанти, яка виявляється у цих ліпофоринів.

7. За результатами вивчення антигенної специфічності одержаних моноклональних антитіл створено оригінальний метод побудови філогенетичних дерев з використанням імунохімічних критеріїв. Застосування даного методу імуносистематики дозволило запропонувати внесення змін в сучасну систематику роду Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae).

1. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Получение моноклональных антител к липофорину гемолимфы Zygaena minos ([Denis & Schiffermьller], 1775) (Lepidoptera, Zygaenidae) // Таврический медикобиологический вестник. - 1998. - № 1-2. - С. 12-15.

2. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Изучение филогенетических взаимоотношений видов рода Zygaena Fabricius, 1775 (Lepidoptera, Zygaenidae) c помощью моноклональных антител к липофорину // Таврический медикобиологический вестник. - 1998. - № 3-4. - С. 44-48.

3. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Изменение антигенсвязывающей функции антител в присутствии мелиттина из яда пчелы (Apis mellifera L.) // Таврический медикобиологический вестник. - 2001. - № 1-2.- С. 108-114.

4. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Усиление взаимодействия IGG c C1q в присутствии мелиттина как возможная причина анафилаксии при действии пчелиного яда // Укр.биохим.журн. - 2001. - Т.73, № 5. - С. 49-54.

5. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Методика очистки моноклональных иммуноглобулинов на ДЭАЭ-Трисакриле М // Идеи И. И. Мечникова и развитие современного естествознания: Тез. докл. Междужнар. науч. конф., посвященной 150-летию со дня рожд. И. И. Мечникова. - Харьков. - 1995. - С. 110-111.

6. Ефетов К. А., Ширяев Н. В. Очистка миеломных парапротеинов методом ионообменной хроматографии // Тез. докл. II съезда онкологов стран СНГ (Онкология 2000). - Киев: Экспериментальная онкология. - 2000. - Vol. 22, Suppl. - N 227.

7. Efetov K. A., Shiryayev N. V. Monoclonal antibodies to lipophorin of Zygaena minos ([Denis & Schiffermьller], 1775) (Lepidoptera: Zygaenidae) // Abstracts of X th European Congress of Lepidopterology. - Miraflores de la Sierra (Madrid, Spain). - 1996. - P. 76.