Особливості субклітинної локалізації протеїнкіназ S6K1 та S6K2 у тиреоцитах щурів в умовах культури клітин in vitro - Автореферат

Внутрішньоклітинна передача сигналу у фолікулярному епітелії щитовидної залози опосередковується різними сигнальними шляхами, основним з яких є фосфатидилінозитол-3’кіназний (РІ3К) сигнальний каскад, оскільки саме він залучений до регуляції функції щитовидної залози гіпофізарним тиреотропним гормоном (ТТГ) та інсуліном (Suh et al., 2003). Порушення функції щитовидної залози може зумовлювати як гіпо-так і гіпертиреоз. Була відзначена надекспресія цих кіназ у папілярних карциномах щитовидної залози порівняно з нормальною тканиною (Lyzogubov et al., 2003). Метою даної роботи було розробити модель культивування тиреоцитів, при якій зберігається фолікулярна організація цих клітин, та дослідити на ній звязок між активацією процесів проліферації, міграції, рівнем функціональної активності фолікулярного епітелію щитовидної залози та субклітинною локалізацією S6K1 та S6K2. Обєктом дослідження була внутрішньоклітинна передача сигналу у клітинах фолікулярного епітелію щитовидної залози, а предметом - особливості субклітинної локалізації S6K1 та S6K2 у тиреоцитах з різним ступенем функціональної активності в умовах дво-та тривимірових культур.Для отримання сфероїдних культур тиреоцити із моношару трипсинізували і у вигляді суспензії переносили у чашки Петрі, попередньо вкриті шаром агарози, на якому клітини формували сфероїди. Враховуючи, що анатомічною та функціональною одиницею щитовидної залози є фолікул, в основу отримання первинних культур тиреоцитів було покладено одержання суспензії неушкоджених фолікулів. Кількість фолікулів, ізольованих із тканини вузлового зобу була вірогідно вищою, ніж із нормальної тканини (1275 проти 9425 на 0,3 г тканини щитовидної залози, відповідно для нормальної тканини та вузлового зобу, p 0,05, n=12), і навіть призводила до зниження (проте статистично не вірогідного) виходу неушкоджених фолікулів при ензиматичній деградації тканини вузлового зобу. Так, кількість фолікулів, ізольованих за допомогою суміші гіалуронідаза/колагенназа/диспаза, становила 863 та 5687 відповідно з 0,3 г нормальної тканини та вузлового зобу; кількість фолікулів, ізольованих за допомогою суміші еластаза/колагеназа/диспаза, становила відповідно 1825 та 2701 з 0,3 г нормальної тканини та вузлового зобу. Отже, із суспензії ізольованих фолікулів тканини щитовидної залози були отримані моношарові, сфероїдні культури та культури флотуючих агрегатів фолікулів, із яких лише останній тип культур за морфологічними ознаками характеризувався збереженням фолікулярної організації клітин.У дисертаційній роботі вперше розроблено модель тривимірового культивування тиреоцитів людини та щура у вигляді флотуючих агрегатів фолікулів, що зберігають свою структурну організацію. Встановлено звязок між субклітинною локалізацією S6K1/2 кіназ рибосомного білка S6K та рівнем функціональної активності культивованих тиреоцитів. Вперше розроблено умови та отримано первинні культури флотуючих агрегатів фолікулів щитовидної залози людини та щурів. Проведено порівняльний аналіз рівня збереження функціональної активності клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози у трьох типах культур (моношаровій, сфероїдній та у флотуючих агрегатах фолікулів) за вмістом тиреоглобуліну, найвищий рівень якого виявлено у тиреоцитах агрегатів фолікулів, що характеризувалися збереженням фолікулоподібної організації протягом тривалого терміну культивування. Встановлено, що втрата фолікулярної організації тиреоцитів в умовах моношарової культури та у частині клітин флотуючих агрегатів фолікулів супроводжується субклітинною релокалізацією S6K1/2, що виражається у появі досліджуваних кіназ у ядрах клітин.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

У дисертаційній роботі вперше розроблено модель тривимірового культивування тиреоцитів людини та щура у вигляді флотуючих агрегатів фолікулів, що зберігають свою структурну організацію. Встановлено звязок між субклітинною локалізацією S6K1/2 кіназ рибосомного білка S6K та рівнем функціональної активності культивованих тиреоцитів.

1. Вперше розроблено умови та отримано первинні культури флотуючих агрегатів фолікулів щитовидної залози людини та щурів.

2. Проведено порівняльний аналіз рівня збереження функціональної активності клітин фолікулярного епітелію щитовидної залози у трьох типах культур (моношаровій, сфероїдній та у флотуючих агрегатах фолікулів) за вмістом тиреоглобуліну, найвищий рівень якого виявлено у тиреоцитах агрегатів фолікулів, що характеризувалися збереженням фолікулоподібної організації протягом тривалого терміну культивування.

3. У тканині щитовидної залози щура шляхом непрямої імунопероксидазної реакції виявлено переважно цитоплазматичну локалізацію S6K1 та S6K2 кіназ рибосомного білка S6.

4. Встановлено, що втрата фолікулярної організації тиреоцитів в умовах моношарової культури та у частині клітин флотуючих агрегатів фолікулів супроводжується субклітинною релокалізацією S6K1/2, що виражається у появі досліджуваних кіназ у ядрах клітин.

5. Продемонстровано підвищення вмісту S6K1/2 у проліферуючих тиреоцитах за умов моношарової культури та у тиреоцитах, що втратили фолікулярну організацію у тривиміровій культурі.

6. Встановлено, що активація спрямованої міграції культивованих тиреоцитів не супроводжується внутрішньоклітинною релокалізацією S6K1/2.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Khoruzhenko A.I. New approaches for thyrocyte cultivation in vitro with retention of their follicular organization / A.I. Khoruzhenko // Exp. Oncol. - 2002. - Vol. 24, P. 99-104.

2. Khoruzhenko A.I. Subcellular localization of S6K1 and S6K2 forms of ribosomal protein S6K kinase in primary monolayer culture of rat thyrocytes / A.I. Khoruzhenko, O.V. Cherednyk, V.V. Filonenko // Біополімери та клітина. - 2008. Т. 24, № 1. - С. 35-40. Особистий внесок здобувача - отримання первинних культур, імунохімічний аналіз.

3. Хоруженко А.І. Субклітинна локалізація S6K1 і S6K2 форм кінази рибосомного білка S6 у тиреоцитах щурів за умов дво- та тривимірної культури / А.І. Хоруженко, О.В. Чередник, В.В. Філоненко // Біополімери та клітина. - 2008. Т. 24, № 6. - С. 470-475. Особистий внесок здобувача - отримання первинних культур, подвійний імунопероксидазний/імуноферментний аналіз.

4. Хоруженко А.І. Визначення тиреоглобуліну для оцінки функціональної активності у моношарових та флотуючих культурах клітин щитоподібної залози людини. - 2001. - Т. 6 додаток. - С. 321.

5. Khoruzhenko A.I. Human thyrocyte culture derived from isolated follicles / A.I. Khoruzhenko // The 27th Annual Meeting of European Thyroid Association, (Warsaw, 25-29 August 2001) Journal of endocrinological Investigation. - 2001. - Vol. 24, Suppl to No. 6. - P. 24.

6. Khoruzhenko A. Loss of thyrocyte follicular organization in vitro is accompanied by subcellular redistribution of ribosomal protein S6 kinases S6K1 and S6K2 / A. Khoruzhenko, V. Filonenko // V annual meeting of ELSO, 3-6 September 2005, Dresden, Germany.

7. Хоруженко А.И. Потеря тиреоцитами фолликулярной организации in vitro сопровождается внутриклеточным перераспределением киназ рибосомального белка S6: S6K1 и S6K2 / А.И. Хоруженко, О.В. Чередник, В.В. Филоненко // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология - наука XXI века”, Пущино, 17-21 апреля 2006 г. Особистий внесок здобувача - - отримання первинних культур, оцінка субклітинної локалізації, аналіз зображень.

8. Khoruzhenko A.I. Subcellular localization of S6K1 and S6K2 isoforms of ribosomal protein S6 kinase in rat thyroid tissue, primary thyrocyte monolayer culture and aggregates of undamaged follicles / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // Conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine. Особистий внесок здобувача - отримання дво- та тривимірових культур тиреоцитів, імунохімічний аналіз.

9. Khoruzhenko A. Immunocytochemical determination of subcellular localization of S6K1 and S6K2 forms of ribosomal protein S6 kinase in initial tissue and two- and three-dimensional cultures of rat thyrocytes / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // VI annual meeting of ELSO, 1-4 September 2007, Dresden, Germany. Особистий внесок здобувача - отримання дво- та тривимірових культур тиреоцитів.

10. Khoruzhenko A. Thyroid cell dedifferentiation in vitro is accompanied by subcellular redistribution of ribosomal protein S6 kinase / A. Khoruzhenko, O. Cherednyk, V. Filonenko // VII annual meeting of ELSO, 30 August - 2 September 2008, Nice, France. Особистий внесок здобувача - аналіз субклітинної локалізації S6K1/2.

11. Cherednyk O. Expression of ribosomal protein S6 kinases S6K1 and S6K2 in proliferating rat thyroid and MCF-7 cells / O. Cherednyk, V. Kukharchuk, A. Khoruzhenko // VII annual meeting of ELSO, 30 August - 2 September 2008, Nice, France. Особистий внесок здобувача - аналіз субклітинної локалізації S6K1/2.