Особливості протеолітичних процесів у травному тракті телят - Автореферат

Ефективність використання кормів телятами на ранніх етапах постнатального розвитку значною мірою залежить від морфофункціонального розвитку рубця, який впливає на ріст симбіотичних мікроорганізмів і ступінь розщеплення поживних речовин, у тому числі протеїну корму (Van Soest P.J., 1982; Янович В.Г., Сологуб Л.І., 2000). У результаті розщеплення протеїну корму протеїназами мікроорганізмів у рубці утворюються пептиди і амінокислоти, частина яких використовується мікроорганізмами у синтезі власних білків, котрі після розщеплення у тонкому кишечнику панкреатичними і кишечними протеїназами служать основним джерелом амінокислот для телят (Tamminga S., 1979; Orskov E.R., 1982). Загалом, ефективність засвоєння протеїну корму телятами залежить від активності протеїназ у рубці і кишечнику, на яку значною мірою впливає склад протеїну, наявність у кормах активаторів і інгібіторів протеолітичних ферментів. Цим пояснюється науково-практична актуальність досліджень, скерованих на зясування вікових особливостей протеолізу в рубці і тонкому кишечнику телят, ролі окремих протеїназ у розщепленні протеїну корму, механізмів і чинників регуляції їх активності. Досліди виконано в лабораторії обміну речовин Інституту землеробства і біології тварин УААН у 1996-2000 роках (здобувач дослідила протеолітичну активність і протеїнази вмісту рубця та хімусу 12-палої кишки телят, субстратну залежність активності протеїназ у перелічених відділах травного тракту, розподіл протеїназ серед білків фракцій рубцевої рідини залежно від молекулярної маси, здійснила часткове очищення нейтральної серинової протеїнази із безклітинної рідини рубця телят).Експериментальну частину роботи виконано на 2-х групах поліфістульних (рубця і 12-палої кишки) бичків-аналогів чорно-рябої породи віком від 30-ти до 180-ти днів (по 6 голів у групі) у 1998 і 1999 роках у весняно-літний період у дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН. У першій серії дослідів у зразках вмісту рубця та хімусі 12-палої кишки визначали протеолітичну активність за звільненням циклічних амінокислот при інкубації аліквот з казеїном (Wallace R., 1985), концентрацію загального білка за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951), целюлозолітичну активність (Паєнок С.М., 1970). Вплив інгібіторів, активаторів та інших модуляторів на активність протеїназ вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят в окремих варіантах досліджень визначали, додаючи до інкубаційної суміші 0,1 мл розчину модулятора у відповідній концентрації (замість 0,1 мл тріс-HCL буферу): - катіони: CACO3 (50 MM), CACO3 (1000 MM), MGCL2 (100 MM), MNCL2 (100 MM), ZNCL2 (100 MM), COCL2 (100 MM), CUCL2 (100 MM), BACL2 (100 MM), FECL2 (100 MM), CRCL3 (100 MM), CDCL2 (100 MM), NICL2 (100 MM); Дослідження різних білків, як субстратів дії протеїназ у вмісті рубця та хімусі 12-палої кишки телят в окремих дослідах здійснювали із заміною казеїну на: альбумін сироватки бика (10 мг/мл), гемоглобін (10 мг/мл), горох нативний (30 мг/мл), горох екструдований (30 мг/мл), макуху ріпакову нативну (30 мг/мл), макуху ріпакову екструдовану (30 мг/мл) (кормові інградієнти у перемеленій формі). Водночас активність протеїназ, які проявляються при вищих концентраціях протонів водню (РН 5,0), у вмісті рубця змінюється з віком тварин меншою мірою (у 6-місячному віці тварин вона лише приблизно в 2 рази вища, ніж в 1-місячному віці).У дисертації подано теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає у визначенні особливостей деградації білків у рубці та 12-палій кишці телят у перші місяці їхнього життя. Наведено дані щодо протеолітичних ферментів різних фракцій вмісту рубця, їхніх деяких фізико-хімічних властивостей, залежності їхньої активності від концентрації протонів водню, наявності інгібіторів, активаторів, катіонів. З віком телят у вмісті рубця і хімусі 12-палої кишки зростає активність протеїназ. Рівень їхньої активності за нейтральних значень РН протягом перших 6-ти місяців життя тварин підвищується у 3 рази, а рівень активності кислих протеїназ - у 2 рази. Найбільше впливають на протеолітичну активність рубцевої рідини і хімусу 12-палої кишки інгібітори серинових протеїназ (в середньому інгібування, відповідно, на 80 і 50%); вплив інгібіторів цистеїнових протеїназ, аспартатних протеїназ і металопротеїназ значно менший (18 і 10%, 11 і 19%, 10 і 15%, відповідно).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертації подано теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає у визначенні особливостей деградації білків у рубці та 12-палій кишці телят у перші місяці їхнього життя. Наведено дані щодо протеолітичних ферментів різних фракцій вмісту рубця, їхніх деяких фізико-хімічних властивостей, залежності їхньої активності від концентрації протонів водню, наявності інгібіторів, активаторів, катіонів.

У результаті вирішення поставленого завдання зроблено такі висновки: Вміст білків у рубці і 12-палій кишці телят у перші два місяці життя вірогідно зростає, а в старшому віці змінюється незначно. З 1- до 6-місячного віку у рубці телят вірогідно збільшується кількість клітин симбіотичних бактерій і інфузорій. Причому кількість перших зростає за цей період у 3 рази, останніх - у 6 разів.

З віком телят у вмісті рубця і хімусі 12-палої кишки зростає активність протеїназ. Рівень їхньої активності за нейтральних значень РН протягом перших 6-ти місяців життя тварин підвищується у 3 рази, а рівень активності кислих протеїназ - у 2 рази.

Протеїнази рубця і 12-палої кишки телят відзначаються значною гетерогенністю і спорідненістю до білків-субстратів. Порівняно швидко деградується ними казеїн, гемоглобін, а також альбумін. Розщеплення перших двох білків відбувається переважно завдяки сериновим протеїназам, а останнього - завдяки ферментам цистеїнового типу.

Інтенсивність розщеплення у вмісті рубця білків макухи протеїназами після її екструзії знижується, а інтенсивність розщеплення білків гороху - підвищується. Деградація білків макухи і гороху в рубці здійснюється переважно цистеїновими протеїназами, а у 12-палій кишці - сериновими.

Активність казеїнолітичних протеїназ у рубці телят з віком знижується; активність ферментів деградуючих гемоглобін і альбумін у 6-місячних телят вища, ніж у 1-місячних. Активність протеїназ, що розщеплюють білки гороху і макухи у рубці телят підвищується після переходу з молочної годівлі на рослинну.

Найбільше впливають на протеолітичну активність рубцевої рідини і хімусу 12-палої кишки інгібітори серинових протеїназ (в середньому інгібування, відповідно, на 80 і 50%); вплив інгібіторів цистеїнових протеїназ, аспартатних протеїназ і металопротеїназ значно менший (18 і 10%, 11 і 19%, 10 і 15%, відповідно).

Значна активація протеолітичної активності у вмісті рубця спостерігається при додаванні до середовища іонів металів, причому вони неоднаково впливають на різні групи протеїназ. Кальцій значно стимулює цистеїнові ферменти, цинк - металопротеїнази. Магній дещо більше впливає на ферменти серинового типу, ніж на аспартатні, тоді як марганець, навпаки, значною мірою активує останні. Хром(ІІІ), кобальт(ІІ), мідь(ІІ) у концентраціях 10 ММ на активність протеїназ вмісту рубця помітно не впливає, а кадмій у цій же концентрації значно її інгібує.

Різні сполуки сірки неоднаково впливають на активність протеолітичних ферментів вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят. Окиснені сполуки цього елемента (сульфати, окиснений глутатіон) знижують їх активність, причому це зниження відбувається переважно за рахунок ферментів цистеїнового типу. Цистеїн, відновлений глутатіон, дитіотреітол, навпаки, їх активують.

У рубці телят максимальна активність протеїназ виявлена при РН ~7, тоді як у 12-палій кишці вона вища при кислих значеннях РН, і нижча при нейтральних значеннях.

У вмісті рубця телят протеїнази розподілені серед білків різних фракцій. Найвищим рівнем активності цих ферментів з оптимумом дії за нейтральних значень РН відзначається бактеріальна фракція (48%); у фракціях інфузорій, кормових частинок і безклітинній рідині їх рівень значно нижчий (відповідно, 23, 10 і 19%). Найвищу активність кислих протеїназ виявлено в безклітинній рідині і кормових частинках вмісту рубця.

Протеїнази фракцій бактерій і інфузорій вмісту рубця телят за фізико-хімічними і функціональними властивостями відзначаються значною гетерогенністю. Основна частина протеолітичної активності симбіотичних мікроорганізмів повязана, за даними гельфільтрації, з білками молекулярною масою ~400, 200, 100, 60, 30-40 і 10-20 КДА. Ці ферменти відзначаються неоднаковою чутливістю до різних значень РН середовища, катіонів та деяких інших регуляторних чинників.

Здійснено часткове очищення нейтральної серинової протеїнази (в ~70 разів) із безклітинної рідини рубця телят і досліджено деякі її властивості.

Сологуб Л.І, Герасимів М.Г., Якимовець О.М. Метаболізм азотових сполук в рубці жуйних тварин// Біологія тварин.-1999. - Т.1, №1. - С.11-21.(Дисертант брала участь в аналізі літературних джерел та написанні статті).

Гідролітичні процеси в рубці телят у звязку з онтогенезом / О.М. Якимовець, М.Г. Герасимів, В.С. Скварук, І.С. Пашковська, Л.І. Сологуб // Наук.-техн. бюл. ІЗІБТ (Сер.- фізіологія і біохімія). - 1999. - Вип.1, №3. -С.88-91. (Дисертант провела дослідження протеолітичної та целюлолітичної активностей, брала участь в опрацюванні експериментальних даних, написанні статті).

Клепач Л.В., Снітинський В.В, Якимовець О.М. Зміни інтенсивності протеолітичних процесів у рубці телят під впливом екструзії корму // Наук.-техн. бюл. ІЗІБТ (Сер.- фізіологія і біохімія). - 1999. - Вип. 1, №3. - С.120 - 122. (Дисертант провела дослідження розщеплюваності протеїну кормів, статистичне опрацювання експериментальних даних, брала участь в аналізі результатів досліджень).

Мікроорганізми рубця великої рогатої худоби і їх гідролітична активність при годівлі їх різними раціонами / О.М. Якимовець, О.А. Войтюк, Л.І. Сологуб, М.Г. Герасимів // Науковий вісник Львів. держ. акад. вет.мед. ім.С.З. Гжицького. -. 2000. - Т.2, №2. - С.197 - 200.(Дисертант брала участь у проведенні досліджень підрахунку кількості клітин бактерій та інфузорій в рідині рубця, кількості протеолітичних бактерій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Стефанишин О.М., Сологуб Л.І. Протеази вмістимого рубця великої рогатої худоби// Біологія тварин. - 2000. - Т.2, №2. - С.76-79. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Стефанишин О.М., Сологуб Л.І. Позаклітинні нейтральні протеїнази вмістимого рубця бичків// Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2000. -Вип.2. - С.99-103. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Огородник Н.З., Стефанишин О.М. Вікові особливості обмінних процесів в рубці телят// Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2001. -Вип.1-2. - С.215-219. (Дисертант провела дослідження загальної протеолітичної активності, визначенні мікробної маси, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Вміст білків і протеолітична активність в рубці і 12-палій кишці бичків у звязку з віком / О.М. Стефанишин, М.Г. Герасимів, Л.І. Сологуб, Л.В. Клепач // Вісник Полтавського с.-г. ін-ту.-2001.-№2.- С.138. (Дисертант провела дослідження протеолітичної активності, визначенні кількості білків бактерій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Stephanishyn O.M., Solohub L.I Proteinases of protozoa in rumen of cattle// Біологія тварин. - 2002. - Т.4,№1-2. - С.136-140. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі статті).

Стефанишин О. М. Вміст білків і активність протеїназ в рубці і 12-палій кишці телят в перші місяці після народження // Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2002. -Вип.4, №1. - С.134-137.

Влияние типа кормления нарост популяции микроорганизмов и гидролитическую активность в рубце телят / О. М.Якимовец, А. А.Войтюк, М. Г.Герасымив, Л.И. Сологуб // Тез. докл. ІІІ Междун. конф. “Актуальные проблемы биологии в жывотноводстве”. - Боровск (Россия): ВНИИФБИП с.-х. животных. - 2000. -С.255-256. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень протеолітичної та целюлолітичної активностей, підрахунку кількості клітин бактерій та інфузорій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

Stephanishyn O., Solohub L. The investigations of proteases in the rumen content of steers // 1-Polish-Ukrainian Sci.Conf.”Animal Sciences in the XXI Century”. - Kracow, 2001. - Р.207-211. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).