Особливості просторової структури тубуліну як основа клітинної відповіді рослин на дію гербіцидів динітроанілінового та фосфороамідного рядів - Автореферат

Роботу виконано у відділі геноміки і біотехнології Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України Беручи до уваги, що тубулінам з різних органічних царств властива перехресна імунна активність, можна зробити обґрунтований висновок, що структурні відмінності, які обумовлюють ці властивості тубулінів рослин, мають специфічний характер. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України: відділу цитофізіології та клітинної інженерії: № 2.28.2.9 "Вивчення молекулярно-біологічних і генетичних процесів в реконструйованих трансгеномних і трансгенних клітинних лініях і рослинах" (1995-1999), а потім відділу геноміки і біотехнології: № 2.28.2.10 "Зясування ролі цитоскелетних структур клітини у відповіді рослин на вплив абіотичних факторів та розробка біотехнологічних підходів для регуляції функціонування цитоскелету" (2000-2004, номер держреєстрації 0101U000395). б) провести порівняльний аналіз особливостей вторинної і просторової структури рослинних a-, b-та g-тубулінів між собою та в порівнянні з вторинною і просторовою структурою тубулінів іншого походження; е) проаналізувати механізми стійкості рослин до динітроанілінів та фосфороамідів, які базуються на відповідних змінах в структурі b-тубуліну, і порівняти їх з такими, що обумовлені змінами в а-тубуліні;Для порівняльного аналізу структурних особливостей рослинних тубулінів із структурою інших тубулінів і тубулін-подібних білків було використано a-і b-тубуліни свині (Sus scrofa L.), g-тубулін людини (Homo sapience L.), бактеріальний FTSZ-білок метанококу (Methanococcus jannaschii) та білок поділу хлоропластів Послідовності всіх тубулінів, за винятком b-тубуліну N. plumbaginifolia, були отримані з банку даних SWISS-PROT. Було проведено тотальний аналіз послідовностей всіх тубулінів, для яких повністю розшифровано первинну структуру - 144 послідовності а-тубулінів, 166 послідовностей b-тубулінів, 28 послідовностей g-тубулінів, 2 послідовності d-тубулінів і 1 послідовність e-тубуліну. Як матрицю для наближення третинної структури всіх досліджуваних a-та b-тубулінів було використано просторову структуру a-та b-тубулінів S. scrofa (PROTEINDATABANK, http://www.rcsb.org/pdb, код 1TUB). Як матриця для моделювання просторової структури рослинного g-тубуліну використовувалася просторова структура молекули а-тубуліну свині, оскільки послідовності a і g-тубулінів мають більший ступінь подібності між собою, ніж послідовності b-і g-тубулінів.У ході роботи вперше було відтворено просторову структуру a-, b-і g-тубулінів рослинного походження і досліджено особливості їх третинної структури, які обумовлюють характер відповіді рослинної клітини на вплив динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів на молекулярному рівні. Вперше показано, що тубулінам як рослинного, так і тваринного походження властива метастабільність вторинної структури в часі, яка може виступати одним з ключових факторів, що забезпечують динамічні властивості мікротрубочок у живій клітині. Нижчий рівень метастабільності g-тубулінів рослин порівняно з a-і b-тубулінами (53% проти 56%) може бути обумовлений клітинною роллю цих білків як основних структурних компонентів ЦОМТІВ. Встановлено, що структура ділянок різного ступеня консервативності a-, b-і g-тубулінів будь-якого походження не має ознак істотної різниці, що свідчить про некритичність ознаки консервативності/відмінності тих чи інших залишків в обумовленні специфічних властивостей тубулінів рослин. Показано, що основним структурним компонентом сайту звязування динітроанілінових та фосфороамідних сполук є позитивно заряджена порожнина на поверхні а-тубуліну, до складу якої входить залишок диамінної амінокислоти і яка служить для звязування діючого компоненту гербіцидів - нітрогрупи, приєднаної до бензольного кільця.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У ході роботи вперше було відтворено просторову структуру a-, b- і g-тубулінів рослинного походження і досліджено особливості їх третинної структури, які обумовлюють характер відповіді рослинної клітини на вплив динітроанілінових та фосфороамідних гербіцидів на молекулярному рівні.

1. Показано, що при єдності загального плану просторової будови і типу упаковки кожний тип тубуліну характеризується індивідуальною кількістю і довжиною елементів вторинної структури, які визначаються не лише амінокислотними послідовностями, а також залежать від складу залишків, що утворюють просторове оточення цих елементів.

2. Вперше показано, що тубулінам як рослинного, так і тваринного походження властива метастабільність вторинної структури в часі, яка може виступати одним з ключових факторів, що забезпечують динамічні властивості мікротрубочок у живій клітині. Нижчий рівень метастабільності g-тубулінів рослин порівняно з a- і b-тубулінами (53% проти 56%) може бути обумовлений клітинною роллю цих білків як основних структурних компонентів ЦОМТІВ.

3. Встановлено, що структура ділянок різного ступеня консервативності a-, b- і g-тубулінів будь-якого походження не має ознак істотної різниці, що свідчить про некритичність ознаки консервативності/відмінності тих чи інших залишків в обумовленні специфічних властивостей тубулінів рослин.

4. Вперше на поверхні молекул а-тубуліну рослинного походження ідентифіковано розташування сайту взаємодії з надспецифічними ефекторами рослинних тубулінів - динітроаніліновими і фосфороамідними гербіцидами. Показано, що цей сайт розташовується на поверхні інтердимерного контакту і складається з амінокислотних залишків Arg2, Gln133, Arg243, Asn249, Val250, Asp251, Val252, Asn253, Glu254.

5. Показано, що основним структурним компонентом сайту звязування динітроанілінових та фосфороамідних сполук є позитивно заряджена порожнина на поверхні а-тубуліну, до складу якої входить залишок диамінної амінокислоти і яка служить для звязування діючого компоненту гербіцидів - нітрогрупи, приєднаної до бензольного кільця. Мутації, що викликають підвищення стійкості до означених сполук, спричиняють повне або часткове закриття цієї порожнини. Різниця в антимітотичній ефективності окремих представників динітроанілінів і фосфороамідів обумовлена індивідуальними особливостями їх просторової структури.

6. Показано, що мутація Met->Thr в позиції 268 рослинного а-тубуліну, яка викликає виникнення проміжної стійкості до динітроанілінових гербіцидів, співпадає з позицією заміни Met->Val, яка спричиняє підвищення рівня холодостійкості і, в свою чергу, приводить до перебудов поверхні інтердимерного контакту. Таким чином, показано критичну роль інтердимерної поверхні в забезпеченні стійкості до стрес-факторів цілком різної природи.

7. Виявлено, що розташування відповідних сайтів взаємодії на поверхні b-тубуліну не співпадає з таким на поверхні а-тубуліну, що обумовлено індивідуальними відмінностями у складі відповідних субодиниць. Сайт на поверхні b-тубуліну локалізується на поверхні інтрадимерного контакту і містить у випадку хламідомонади залишки Leu246, Asn247, Ala248, Asp249, Lys252, Leu253, Val255, Asn256, Lys350, (Ser351, Thr352), а у випадку тютюну - Leu246, Asn247, Ser248, Asp249, Lys252, Leu253, Val255, Asn256, Lys350, Ser351, Thr352.

8. Виявлено, що різниця в спорідненості динітроанілінів і фосфороамідів до a- і b-субодиниць тубулінів є неістотною, а істотна відмінність в ефективності мутацій по a- та b-субодиницях, які підвищують стійкість до цих сполук, обумовлена різницею між доступністю поверхонь інтердимерного та інтрадимерного контакту для атаки молекулою гербіциду.

9. Виявлено загальну закономірність розташування мутацій, що спричиняють підвищення стійкості до речовин, які деполімеризують мікротрубочки - позиції цих замін локалізуються не далі шостого залишку від амінокислоти, залученої до утворення поверхонь повздовжніх контактів, що може бути базовим критерієм для пошуку нових мутацій з аналогічною активністю.

1. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Сравнительный анализ вторичной структуры тубулинов и FTSZ-белков // Биополимеры и клетка. - 2001. - Т. 17. - С. 61-69.

2. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Особенности вторичной структуры g-тубулина растений // Ученые записки ТНУ, серия “Биология”. - 2001. - Т. 14. - С. 145-150.

3. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Моделирование и анализ пространственной структуры молекул g-тубулина высших растений // Доповіді НАН України. - 2002. - № 1, - С. 175-179.

4. Ныпорко А. Ю., Емец А.И., Климкина Л.А., Блюм Я. Б. Взаимосвязь чувствительности каллуса Eleusine indica к трифлюралину и амипрофосметилу с особенностями взаимодействия этих соединений с тубулином // Физиология растений. - 2002. - Т. 49. - С. 459-466.

5. Ныпорко А. Ю., Живолуп А. Н., Блюм Я. Б. Сравнительный анализ первичной структуры мутантных тубулинов, устойчивых к антимикротрубочковым соединениям, для предсказания позиций новых мутаций с аналогичными свойствами // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37. - С. 69-78.

6. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Baird W.V. Structural modeling of plant б-tubulin interaction with dinitroanilines and phosphoroamidates // Cell Biol. Int. - 2003. - V. 27. - P. 171-174.

7. Nyporko A.Yu., Demchuk O.N., Blume Ya.B. Cold adaptation of plant microtubules: structural interpretation of primary sequence changes in a highly conserved region of a-tubulin // Cell Biol. Int. - 2003. - V. 27. - P. 241-243.

8. Ныпорко А. Ю., Демчук О. Н., Блюм Я. Б. Анализ структурных особенностей а-тубулина растений, обеспечивающих повышенную устойчивость к холоду // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37- № 6. - С. 3-11.

9. Nyporko A. Yu. Three-dimensional structure of plant tubulins // Abstr. of XVI International Botanical Congress (August 1-7, 1999, st. Louis, USA), - St. Louis, 1999. - P. 665.

10. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Идентификация и анализ сайтов взаимодействия молекул тубулина растений с высокоспецифичными лигандами // Тезисы конференции “Цитоскелет и клеточная регуляция” (Пущино, Россия, 11-12 мая 2000). - Пущино, 2000. - С. 27.

11. Емец А.И., Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Механизмы динитроанилин-устойчивости у высших растений // Материалы II международной научной конференции “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (18-19 октября 2000, Москва, Россия) - Москва, 2000. - С. 121-122.

12. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Особенности пространственной структуры молекул тубулина растений // Тези доповідей VII Конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (18-20 жовтня, 2000, Київ, Україна) - Київ, 2000. - С. 86.

13. Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Klimkina L.A., Blume Ya.B. Identification and analysis of interactive sites of plant tubulin for dinitroanilines and phosphoroamidates // Mol. Biol. Cell - 2000. - V. 11. - P. 190a.

14. Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Blume Ya. B. Three-dimensional reconstruction of interactive sites of plant б-tubulin for dinitroanilines and phosphoroamidates // Abstr. of 16th European Cytoskeleton Forum Meeting (August 22-26, 2001, Maastricht, the Netherlands) - Maastricht, 2001. - P. 30.

15. Nyporko A.Yu. Investigation of spatial-specific properties of plant tubulins // Abstr. of of Conference for students, PHD and young scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the establishment of Ukraine Society for molecular biology (September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine) - Kyiv, 2001. - P. 61.

16. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I. Development of gene transfer approaches for creating of dinitroaniline resistant crops // Abstr. of Bulgarian-Ukrainian Seminar on Plant Biotechnology, (September 24-28, 2001, Lessidren, Bulgaria) - Lessidren, 2001.

17. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I. Modified plant tubulin genes - a novel system for transgenic plant selection: mode of action and ecologically safety // Abstr. of Int. Symposium “Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources” (May 26-31, 2002, Yalta, Ukraine) - Yalta, 2002. - P. 90.

18. Blume Ya.B., Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Baird W.V. Are earlier predicted sites of different plant tubulins involved in interaction with dinitroanilines? // Mol. Biol. Cell - 2002. - V. 13. - P. 463a.

19. Yemets A. I, Radchuk V V., Nyporko A. Y., Bayer G.Ya., Pakhomov A.V., Blume Ya.B. Novel selection system for transgenic plants based on altered tubulin genes conferring resistance to dinitroanilines // Abstr. of Ukrainian-UK Workshop on Plant Biotechnology “Biotech Approaches to Engineering Plant Growth” (March, 14-16, 2004, Yalta Ukraine) - Yalta, 2004 - P.41.

20. Ныпорко А. Ю., Блюм Я. Б. Анализ особенностей структуры участков различной степени консервативности молекул тубулинов растительного происхождения // Актуальні проблеми ботаніки та екології. - Вип. 9. - Матеріали конференції молодих вчених-ботаніків - Канів, 7-10 вересня 2004. - С. 170-172.

21. Yemets A. I., Nyporko A. Y., Swire-Clark G., Baird W. V., Blume Y. B. Mechanisms of plant resistance to dinitroanilines and phosphoroamidates based on в-tubulin mutations // Abstracts of XVII International Botanical Congress (July 17-23, 2005, Vienna, Austria) - Vienna, 2005 - P.292.