Особливості прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у щурів за дії важких металів і нітриту натрію та корекція порушень - Автореферат

Широке використання азотних добрив у сільському господарстві призводить до збільшення вмісту азотовмісних сполук у питній воді та харчових продуктах (Горішна О. В., 2001; Коршун М. М., 2001), зокрема нітриту натрію, який є класичним метгемоглобіноутворювачем, за його дії на організм розвивається гемічна гіпоксія. За даними літератури (Гоженко А. І. зі співавт., 2000; Посохова К. А. зі співавт., 2000; Фіра Л. С., Гонський Я. І., 2003), нітрит натрію в контакті з оксигемоглобіном призводить до утворення радикалів, які є активними реагентами, що пошкоджують біологічні системи, проявляють виражену цитотоксичну дію, ініціюють процеси пероксидації ліпідів, білків, нуклеїнових кислот. При її виконанні автор дослідила вплив ентеросорбенту «Ентеросгель», гістидинату міді та ізольованих гепатоцитів на процеси пероксидного окиснення ліпідів, стан антиоксидантної системи і ступінь ендогенної інтоксикації у щурів з ураженням організму хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію. Зясувати особливості процесів пероксидного окиснення ліпідів та стану антиоксидантної системи організму щурів за умов комбінованого ураження хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію, а також розробити ефективні способи їх корекції шляхом застосування металокомплексу гістидинату міді, ентеросорбенту «Ентеросгель» та ізольованих гепатоцитів. Вивчити показники вільнорадикального окиснення ліпідів у щурів з ураженням організму нітритом натрію, хлоридами кадмію і свинцю окремо та при їх комбінованій дії.Для виключення випадкових впливів усі тварини перебували в однакових умовах і досліджувалися в один і той же час (зберігалась сезонність і час доби). Всі маніпуляції з експериментальними тваринами проводили відповідно до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986) та «Науково-практичних рекомендацій з утримання лабораторних тварин та роботи з ними» (Кожемякін Ю. М. зі співавт., 2002). Піддослідні тварини були поділені на такі групи: I - контрольна; II - тварини, уражені нітритом натрію; III - тварини, уражені хлоридом кадмію і нітритом натрію; IV - тварини, уражені хлоридом свинцю і нітритом натрію; V - тварини, уражені хлоридами кадмію і свинцю на тлі гострої нітритної інтоксикації; VI - тварини, уражені хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію, яким проводили корекцію «Ентеросгелем»; VII - тварини, уражені хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію, яким проводили корекцію ізольованими гепатоцитами; VIII - тварини, уражені хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію, яким проводили корекцію «Ентеросгелем» та гістидинатом міді. Гостре токсичне ураження моделювали шляхом одноразового внутрішньошлункового введення нітриту натрію в дозі 70 мг/кг маси тіла тварини (1/3 LD50; Фіра Л. С., Гонський Я. І., 2003), а через 24 год вводили хлориди свинцю і кадмію в дозі 6,5 мг/кг і 6 мг/кг маси тіла тварини (1/15 LD50) відповідно (Гонський Я. І., Головко Л. Л., 2004). Кремнієвий ентеросорбент «Ентеросгель» у вигляді пасти для перорального застосування (виробник ЗАТ «ЕОФ» КРЕОМА-ФАРМ») вводили щурам внутрішньошлунково за допомогою зонда щоденно в дозі 650 мг/кг маси тіла тварини протягом всього терміну експерименту (Черняшова В. зі співавт., 2008).Концентрація ДК і ТК у сироватці крові щурів після інтоксикації нітритом натрію зростала: на 1-шу добу - на 88,4 і 147,2 % відповідно (р<0,001), на 4-ту добу - на 128,7 і 190,7 % (р<0,001) відносно інтактної групи тварин. Про порушення структури і функції клітинних мембран за умов дії нітриту натрію вказують результати досліджень активності цитозольних ферментів (АЛАТ та АСАТ), яка збільшувалася протягом усього експерименту та максимальне збільшення було відмічено на 7-му добу досліду відносно групи уражених тварин. Під впливом нітриту натрію наступило зниження активності ГП на 39,3 % (р<0,001) на 1-шу добу експерименту, на 45,9 % (р<0,001) відносно контрольних тварин вміст її знижувався на 4-ту добу і на 20,8 % - на 7-й день від початку дії отрути. Результати досліджень впливу нітриту натрію на вміст G-SH у крові показали найбільше зниження (38,7 %) на 4-ту добу досліду порівняно з групою інтактних щурів. Результати експериментальних досліджень показали, що введення щурам трьох токсикантів призводить до інтенсивнішого зростання активності ПОЛ у крові і печінці тварин, порівняно з ізольованим введенням нітриту натрію.У дисертації наведено теоретичне узагальнення і новий шлях вирішення наукового завдання, що полягає у встановленні перебігу вільнорадикального окиснення ліпідів, стану антиоксидантної системи і ендогенної інтоксикації у щурів з гострим ураженням солями кадмію і свинцю на тлі нітритного отруєння. З метою корекції виявлених порушень вперше застосовано ізольовані гепатоцити, ентеросорбент «Ентеросгель» окремо і в комбінації з металокомплексом гістидинату міді та вивчено їх вплив на метаболічні порушення в організмі уражених тварин. Найвищого рівня показники досягали за умов одночасного впливу солей важ

2. Основний зміст роботи

Вплив нітриту натрію на процеси пероксидного окиснення ліпідів і показники антиоксидантної системи та ендогенної інтоксикації у тварин. Результати досліджень показали, що за умов гострої нітритної інтоксикації відбуваються значні зміни в процесах ліпопероксидації. Концентрація ДК і ТК у сироватці крові щурів після інтоксикації нітритом натрію зростала: на 1-шу добу - на 88,4 і 147,2 % відповідно (р<0,001), на 4-ту добу - на 128,7 і 190,7 % (р<0,001) відносно інтактної групи тварин. В наступні доби досліду вміст ДК і ТК знижувався, порівняно з попереднім показником. Вміст ТБК-активних продуктів у сироватці крові найбільше зростав на 4-ту добу досліду - на 94,1 % (р<0,001) відносно групи інтактних тварин. У печінці отруєних щурів спостерігалась аналогічна закономірність змін вмісту продуктів ПОЛ. Токсична дія нітриту натрію проявлялася утворенням METHB на 69,1 % (р<0,001) через 24 год від початку експерименту. На 4-ту добу вміст METHB був найвищим (180,0 %) порівняно з контролем. На 7- і 14-й день досліду спостерігалося деяке зниження показника відносно попередньої доби. Одним із способів діагностики ендогенної інтоксикації є дослідження проникності мембран еритроцитів. На 1-шу добу експерименту ЕІІ зростав на 60,3 %, на 4-ту - на 92,5 %, а на 7-му і 14-ту доби досліду спостерігалося деяке зменшення ЕІІ. Результати були вірогідними (р<0,001), що свідчить про підвищення проникності мембрани еритроцитів після отруєння щурів нітритом натрію. Очевидно, це є наслідком дії на мембрану АФК, які утворюються при надходженні в організм токсиканта. Про порушення структури і функції клітинних мембран за умов дії нітриту натрію вказують результати досліджень активності цитозольних ферментів (АЛАТ та АСАТ), яка збільшувалася протягом усього експерименту та максимальне збільшення було відмічено на 7-му добу досліду відносно групи уражених тварин. Як відомо, вміст цитозольних форм у сироватці крові та позаклітинному просторі тканин знаходиться на відносно низькому рівні. Пошкодження плазматичних мембран або підвищення клітинної проникності призводить до виходу ферментів із цитозоля, і активність їх вказує на ступінь пошкодження мембран, що супроводжується синдромом ендогенної інтоксикації (Бакалюк О. Й., 2000).

Важливою у системі антиоксидантного захисту є глутатіонзалежна ланка цієї системи, яка включає ферменти - ГП та ГР, а також неферментний компонент - G-SH. Під впливом нітриту натрію наступило зниження активності ГП на 39,3 % (р<0,001) на 1-шу добу експерименту, на 45,9 % (р<0,001) відносно контрольних тварин вміст її знижувався на 4-ту добу і на 20,8 % - на 7-й день від початку дії отрути. Щодо ГР, то даний показник найбільше знижувався на 4-ту добу досліду - на 32,1 % (р<0,001) відносно групи інтактних щурів. Результати досліджень впливу нітриту натрію на вміст G-SH у крові показали найбільше зниження (38,7 %) на 4-ту добу досліду порівняно з групою інтактних щурів. Особливої уваги заслуговує зміна концентрації в сироватці крові мідьвмісного білка ЦП - одного із основних антиоксидантів плазми крові, особливістю якого є висока стабільність до токсичної дії активних форм кисню, що дозволяє йому зберігати біологічну активність за умов їх інтенсивної генерації. Через 4 дні від початку введення токсиканта вміст ЦП був найбільш зниженим - на 33,1 % (р<0,001) відносно групи контрольних тварин.

Особливості процесів пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи та ендогенної інтоксикації у щурів, уражених нітритом натрію у комбінації його з хлоридами кадмію і свинцю. Результати експериментальних досліджень показали, що введення щурам трьох токсикантів призводить до інтенсивнішого зростання активності ПОЛ у крові і печінці тварин, порівняно з ізольованим введенням нітриту натрію. За дії на організм хлоридів кадмію і свинцю та нітриту натрію найвищий вміст ДК і ТК у крові був на 4-й день від початку отруєння. За цих же умов вміст ТБК АП найбільше зростав на 4-ту добу експерименту - на 127,0 % (р<0,001) відносно контрольної групи тварин. На 7- і 14-ту доби рівень ТБК АП дещо знижувався відносно попередньої доби. При порівнянні досліджуваних показників з такими у тварин, ураженими ізольованим введенням нітриту натрію та у комбінації його з хлоридом кадмію або свинцю видно, що зміни більш виражені за одночасної дії солей важких металів з нітритом натрію. При визначенні вмісту METHB в крові ми відмітили найбільше зростання його на 4-ту добу експерименту - у 3,6 раза. Порівнюючи ці дані з попередніми результатами, можна стверджувати, що комбінована дія важких металів і нітриту натрію викликає більш посилене метгемоглобіноутворення, що призводить до зміни стаціонарних концентрацій радикальних метаболітів ОН·, О2·, НО2·, які спричиняють деструктивну дію на мембрани еритроцитів. При комбінованому введенні щурам солей важких металів і нітриту натрію найвищий ступінь пошкодження еритроцитарних мембран був на 4-ту добу - на 130,4 % більше від рівня, характерного для інтактних тварин. На 7- і 14-ту доби експерименту ЕІІ, порівняно з попередньою добою, дещо зменшився, що свідчить про деяке зниження токсичного впливу хімічних чинників на еритроцитарні мембрани. Зміни були вірогідними (р<0,001) по відношенню як до інтактних тварин, так і до тварин, уражених тільки нітритом натрію та у комбінації його з хлоридом кадмію чи свинцю протягом експерименту.

За умов отруєння щурів солями важких металів і нітриту натрію наступала зміна активності амінотрансфераз в сторону підвищення протягом усього експерименту та найвищою активність АЛАТ та АСАТ була на 7-му добу досліду. Одночасне введення щурам токсикантів супроводжувалось підсиленням їх токсичної дії і проявлялось чітким пригніченням показників глутатіонової ланки антиоксидантної системи. Істотне зниження вмісту ЦП та активності СОД під впливом солей важких металів і нітриту натрію відмічено на 4-ту добу експерименту - у 2,6 і 1,8 раза (р<0,001) відносно групи інтактних тварин. Збільшення в клітині концентрації вільних радикалів обумовлює зменшення активності СОД внаслідок незворотного відновлення міді в активному центрі або внаслідок окиснення в ньому функціональних груп, зокрема тіолових. Також цілком ймовірно, що токсиканти викликають конформаційні зміни молекули фермента, що приводить до втрати ним своїх функціональних властивостей. Отже, проведене нами дослідження показало, що під впливом солей важких металів і нітриту натрію в організмі тварин активуються процеси ліпопероксидації, що зумовлено зниженням ферментної і неферментної ланок антиоксидантної системи.

Вплив «Ентеросгелю» на показники пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи та ендогенної інтоксикації у щурів з комбінованим ураженням організму хлоридами кадмію, свинцю і нітритом натрію. Серед еферентних методів особливо перспективною вважається ентеросорбція, що застосовується з метою вилучення з організму токсичних речовин екзо- та ендогенного походження. В останні роки широкої популярності набули ентеросорбенти, яким притаманні цитопротекторні та гепатопротекторні властивості (Николаев В. Г. с соавт., 2007; Чернобровый В. Н., Палий И. Г., 2003), зокрема кремнійорганічний ентеросорбент «Ентеросгель» - лікарський засіб виробництва ЗАТ «ЕОФ» КРЕОМА-ФАРМ» (Київ, Україна). Введення ураженим тваринам «Ентеросгелю» проявило нормалізуючий вплив на вміст продуктів ліпопероксидації в крові і печінці, зокрема на рівень ДК, який на 1-шу добу знижувався відповідно на 26,7 % (р<0,001), на 4-, 7- і 14-ту - на 18,5; 25,9 і 30,5 % (р<0,001) порівняно з ураженими тваринами. Через добу від початку введення коригуючого середника вміст ТБК АП знижувався на 16,6 % (р<0,001) порівняно з аналогічним показником у групі уражених тварин. На 4-ту добу дослідження цей показник був на 17,2 % меншим, а на 7- і 14-ту доби експерименту - на 22,9 і 40,5 % відповідно порівняно з групою уражених тварин. При дослідженні вмісту METHB в крові щурів за умов корекції порушень, викликаних введенням хлориду кадмію та свинцю з нітритом натрію, було відмічено найбільше його зниження на 40,7 % на 14-ту добу експерименту відносно групи уражених тварин. Слід вказати на виражене зниження ЕІІ та активності амінотрансфераз в організмі отруєних щурів після введення «Ентеросгелю».

Дослідження глутатіонової ланки АОС за корекції ентеросорбентом показало значне зростання активностей ГП, ГР та вмісту G-SH. Слід відмітити, що на тлі корекції дані показники були близькими до показників у контрольній групі тварин. Застосування «Ентеросгелю» позитивно вплинуло і на активність СОД та вміст ЦП, який вірогідно (р<0,001) зростав протягом усього досліження та був наближеним до рівня інтактних тварин

Отже, отримані нами результати свідчать про доцільність використання «Ентеросгелю» при гострих отруєннях солями важких металів і нітритами з метою зменшення проявів ендогенної інтоксикації та відновлення динамічної рівноваги між про- та антиоксидантними процесами за даної патології. Однак, враховуючи, що повної нормалізації досліджуваних показників не наступило під впливом «Ентеросгелю», то наступним етапом було дослідження впливу ізольованих гепатоцитів за умов отруєння щурів хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію.

Коригуючий вплив ізольованих гепатоцитів на показники пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи та ендогенної інтоксикації у щурів з гострим ураженням організму хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію. На відміну від еферентних методів терапії перспективним є застосування ізольованих гепатоцитів, що призводить до зниження токсичного навантаження на печінку, покращення функціонального стану органа, нормалізації біохімічних показників крові (Гонський Я. І. зі співавт., 1997). Результати досліджень показали, що внутрішньочеревне введення отруєним тваринам ізольованих гепатоцитів призвело до нормалізації вмісту продуктів ПОЛ в крові і печінці, а саме на вміст ДК і ТК, а також на вміст ТБК АП, який через добу від початку введення коригуючого чинника знижувався на 15,2 % порівняно з групою нелікованих щурів. Вміст METHB в крові щурів за умов корекції ізольованими гепатоцитами знижувався на 38,9 % через 14 діб відносно уражених тварин. Еритроцитарний індекс інтоксикації в організмі уражених щурів за введення ізольованих гепатоцитів, починаючи з 4-ї доби експерименту, знижувався на 21,4 % (4-та доба), 27 % (7-ма доба) і 26,0 % (14-та доба). Активність АЛАТ через 24 год після введення коригуючого середника знижувалась порівняно з отруєними тваринами на 13,0 %. На 4- і 7-й дні досліду активність даного ферменту була нижчою відповідно на 31,3 і 13,0 % (р<0,001) відносно рівня уражених тварин. Такої ж спрямованості зазнала і активність АСАТ під впливом ізольованих гепатоцитів, але в цьому випадку найбільше зниження активності ферменту мало місце на 7-му добу (44,5 %) відносно групи уражених тварин. Введення ураженим щурам ізольованих гепатоцитів супроводжувалось вірогідним зростанням активності ГП і ГР, а також вмісту G-SH у крові і печінці щурів протягом усього терміну Ізольовані гепатоцити проявили позитивний вплив і на активність СОД і рівень ЦП, які вірогідно зростали в усі доби експерименту порівняно з групою тварин, яким гепатоцити не вводили. Отже, застосування ізольованих гепатоцитів з метою корекції проявило позитивний вплив на показники ферментативної та не ферментативної ланок АОС, нормалізувало показники пер оксидного окиснення ліпідів та зменшило прояви ендогенної інтоксикації.

Вплив «Ентеросгелю» та гістидинату міді на показники пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантної системи та ендогенної інтоксикації у щурів з комбінованим ураженням організму хлоридами кадмію, свинцю і нітритом натрію. Перспективним напрямком корекції є застосування металокомплексів, зокрема гістидинату міді, як високоефективного і малотоксичного засобу профілактики та лікування різних захворювань. Здатність звязувати активні форми кисню та токсини біологічного походження, а також виражені антиоксидантні властивості (Головко Л.Л., 2004; Гонський Я.І. зі співавт, 2009) обумовлюють доцільність використання гістидинату міді за умов комбінованого ураження організму хлоридами кадмію і свинцю на тлі гострого нітритного отруєння. Введення ураженим щурам «Ентеросгелю» та гістидинату міді призвело до нормалізації вмісту продуктів ПОЛ в крові і печінці, зокрема вміст ТБК АП, який знижувався у 1,7 раза на 14-ту добу експерименту і був наближеним до такого показника у контрольній групі.

При дослідженні вмісту METHB в крові щурів за умов корекції «Ентеросгелем» та гістидинатом міді було відмічено значне його зниження протягом усіх діб дослідження порівняно з групою тварин, яким коригуючі чинники не вводили. Слід вказати на виражене зменшення ЕІІ в організмі уражених тварин після застосування коригуючих чинників. Так, починаючи з 4-ї доби досліду, цей показник вірогідно знижувався протягом усього терміну дослідження. В усі доби експерименту активність АЛАТ зазнала істотного зменшення - на 39,5 % (1-ша доба), 43,6 % (4-та доба), 29,8 % (7-ма доба) та 49,0 % (14-та доба) і наблизилась до норми. Аналогічні за спрямованістю зміни встановлені й для АСАТ, активність якої на 14-ту добу після корекції майже зрівнялась з такою в інтактних тварин. Отже, застосування «Ентеросгелю» і гістидинату міді зумовило зміщення активності мембранозалежних амінотрансфераз у сторону норми. Введення щурам «Ентеросгелю» та гістидинату міді супроводжувалось вірогідним зростанням активності ГП і ГР, а також вмісту G-SH у крові і печінці протягом дослідження (табл.).

За даних патологічних умов коригуючі чинники позитивно вплинули на активність СОД, яка вірогідно зростала на 1-шу добу досліду - в 1,4 раза, на 4-ту - у 1,5 раза, на 7-му - у 1,5 раза і на 14-ту - у 1,3 раза відносно аналогічного показника у групі тварин, яким корекцію не проводили.

Таблиця

Вплив «Ентеросгелю» і гістидинату міді на активність ГП, ГР та вміст G-SH у крові і печінці щурів, уражених хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію (M±m)

Група тварин Показник Доба експерименту

1 4 7 14 інтактні ГП печінки, ммоль/(хв•кг) 23,30±0,24 уражені 11,60±0,33 р<0,001 9,90±0,27 р<0,001 16,01±0,45 р<0,001 18,50±0,54 р<0,001 уражені корекція 18,05±0,57 р1<0,001 15,26±0,47 р1<0,001 20,04±0,63 р1<0,001 22,74±0,71 р1<0,001 інтактні ГР печінки, ммоль/(хв•кг) 11,26±0,30 уражені 7,16±0,21 р<0,001 6,50±0,18 р<0,001 6,95±0,20 р<0,001 8,67±0,24 р<0,001 уражені корекція 9,50±0,30 р1<0,001 8,94±0,27 р1<0,001 9,96±0,31 р1<0,001 11,02±0,36 р1<0,001 інтактні G-SH печінки, ммоль/кг 3,46±0,09 уражені 2,07±0,05 р<0,001 1,34±0,03 р<0,001 1,41±0,06 р<0,001 2,03±0,06 р<0,001 уражені корекція 3,35±0,12 р1<0,001 3,12±0,09 р1<0,001 3,27±0,09 р1<0,001 3,41±0,12 р1<0,001 інтактні G-SH крові, ммоль/л 2,22±0,06 уражені 0,87±0,02 р<0,001 0,72±0,02 р<0,001 1,04±0,03 р<0,001 1,43±0,04 р<0,001 уражені корекція 1,80±0,06 р1<0,001 1,65±0,04 р1<0,001 1,88±0,06 р1<0,001 2,04±0,06 р1<0,001

Примітки: 1. p - відмінності вірогідні порівняно з інтактними тваринами. 2. p1 - відмінності вірогідні між тваринами, ураженими хлоридами кадмію і свинцю та нітритом натрію.

Вміст ЦП за корекції отруєних щурів «Ентеросгелем» і гістидинатом міді вірогідно (р<0,001) зростав протягом досліду та був наближеним до рівня інтактних. Таким чином, результати наших досліджень показали значне порушення стану антиоксидантної системи тварин за умов комбінованої дії хлоридів кадмію та свинцю на тлі нітритної інтоксикації, яке супроводжувалось порушенням активності ферментів, підвищенням проникності плазматичних мембран, активацією пероксидного окиснення ліпідів, що в свою чергу зумовлює розвиток синдрому ендогенної інтоксикації.

Запропоновані нами середники корекції біохімічних порушень у тварин, викликаних гострим отруєнням нітритом натрію і солями кадмію та свинцю, засвідчують перспективність та доцільність використання їх у подальших експериментах з метою можливого застосування в клініці для корекції порушень вільнорадикальних реакцій, антиоксидантної системи і ендогенної інтоксикації та послаблення токсичної дії токсикантів. натрій кадмій ліпід інтоксикація