Особливості морфогенезу та клональне мікророзмноження деяких квітково-декоративних культур - Автореферат

В результаті успішної селекції останнім часом отримано безліч гібридних форм цих рослин, що також сприяло їх широкому поширенню (Shibata, 2008). У дисертаційній роботі узагальнені результати наукових досліджень, виконаних у відповідності з науково-тематичними планами відділу біотехнології та вірусології рослин в рамках науково-технічних програм УААН за темами "Інтродукувати й вивчити генофонд декоративних, плодових і технічних рослин, удосконалити методи селекції і біотехнології та на їх основі створити нові сорти інтенсивного типу" (№ держреєстрації 0192U034076), "Розробити теоретичні основи біотехнології отримання нових селекційних форм рослин з підвищеною продуктивністю і адаптивністю до стресових факторів середовища, створення калюсної біомаси та мікророзмноження субтропічних і кісточкових плодових, лікарських і декоративних культур" в рамках проблеми "Поповнення і вивчення генофонду плодових, субтропічних, горіхоплідних, декоративних, ефіроолійних, лікарських, пряноароматичних і барвних рослин; створення продуктивних і стійких сортів з використанням сучасних методів фізіології, біохімії та біотехнології" (№ держреєстрації 0197U004324). З 2006 р. робота триває за науковою темою відділу біотехнології та біохімії рослин НБС-ННЦ УААН 09.02/017 "Створити в умовах in vitro колекції цінного рослинного генофонду на основі вивчення біотичних і абіотичних факторів безпересадочного культивування регенерантів плодових, субтропічних і декоративних культур" (№ держреєстрації 0106U006808). Мета досліджень - виявити особливості регенерації рослин у культурі органів і тканин і розробити біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження Anthurium andreanum, Begonia riger elatior, Caladium hortulanum і Saintpaulia ionantha для масового тиражування важко розмножуваних видів і сортів квітково-декоративних культур та збереження in vitro цінних генотипів. встановити оптимальні концентрації регуляторів росту для ризогенезу мікропагонів in vitro та надати ефективні способи адаптації пробіркових рослин до ґрунтових субстратів;A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, B. riger elatior сортів Krefeld, Lorrenie, Nixi red і Nixi rose, Schwabenland, S. ionantha сортів Apachi Midnight, Margerys Melody, Ness Orange Pekoe, Alocha Orchid, Ruffled Skyes, Ruffles Snow Rose, C. hortulanum сортів Triumphe de Compte, Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose з колекційного генофонду НБС-ННЦ. Як експланти для введення в культуру in vitro були узяті висічки листків, сегменти початків і суцвіть. Як стерилізуючі агенти були використані 70%-ний етанол (С2Н5ОН, Медасепт, Україна), 1-2%-ні розчини гіпохлориту натрію (NACLO, Merck, Німеччина), 0,08%-ний розчин нітрату срібла (AGNO3, Merck, Німеччина), 1%-ний розчин Thimerosal (Merck, Німеччина) та їх комбінації, що дозволило звільнити експланти, що вводилися, від ендогенної та екзогенної інфекції. В процесі досліджень модифіковано склад живильних середовищ Піріка і підібрано ефективні концентрації регуляторів росту для індукції калюсоутворення в культурі висічок листка і сегментів початка двох сортів / експлант у строкатолистих і 10-13 - у 1-сорт Alocha Orchid, 2-сорт Ruffled Skyes, 3-сорт Ruffles Snow Rose, 4-сорт Apachi Midnight, 5-сорт Margerys Melody, 6-сорт Ness Orange PekoeA. andreanum, пяти сортів B. riger elatior, чотирьох сортів C. hortulanum і шести сортів S. ionantha встановлені основні закономірності процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу цих культур в умовах in vitro та на їх основі розроблені способи клонального мікророзмноження перспективних квітково-декоративних рослин. A. andreanum (50-96%), 2 сортів B. riger elatior (95-98%), 6 сортів S. ionantha (90-96%) і 4 сортів C. hortulanum (90-92%) розміром 1 х 1 см, розташовані адаксіально до поверхні живильного середовища, а також сегменти початка 2 сортів Так, у культурі листкових експлантів 2 сортів B. riger elatior (8,90-11,20 МКМ БАП і 5,71 МКМ ІОЦК), 2 сортів C. hortulanum (2,22-2,66 МКМ БАП і 2,69 МКМ НОЦК) і 6 сортів S. ionantha (2,22 МКМ БАП і 0,27-1,07 МКМ НОЦК) морфогенетичний потенціал реалізувався через прямий органогенез. Непрямий органогенез відбувався в культурі листкових експлантів (4,40 МКМ БАП і 0,9 МКМ 2,4-Д) і сегментів початка (4,40 МКМ БАП і 0,45 МКМ 2,4-Д) 2 сортів Соматичний ембріогенез відзначався в культурі листкових експлантів (2,32-3,25 МКМ кінетину і 5,37 МКМ НОЦК) 4 сортів C. hortulanum.

Мікророзмноження квітково-декоративних рослин в умовах in vitro (огляд літератури)

У розділі подано інформацію про стан біотехнологічних досліджень квітково-декоративних культур в Україні та за кордоном. Особлива увага приділена клональному мікророзмноженню, розглянуті його принципи й теоретичні основи. Показано вплив трофічних, гормональних і фізичних факторів на ефективність клонального мікророзмноження. Проте низька ефективність методів культивування органів і тканин для ряду видів і сортів квітково-декоративних рослин насьогодні вимагає проведення досліджень, що дозволяють розробити нові та удосконалити існуючі способи клонального мікророзмноження або їх окремі етапи.

3. Матеріали та методи досліджень

У дослідженнях використані рослини A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, B. riger elatior сортів Krefeld, Lorrenie, Nixi red і Nixi rose, Schwabenland, S. ionantha сортів Apachi Midnight, Margerys Melody, Ness Orange Pekoe, Alocha Orchid, Ruffled Skyes, Ruffles Snow Rose, C. hortulanum сортів Triumphe de Compte, Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose з колекційного генофонду НБС-ННЦ. Як експланти для введення в культуру in vitro були узяті висічки листків, сегменти початків і суцвіть.

При проведенні експериментальних робіт використовували загальноприйняті методи культури ізольованих клітин, органів і тканин рослин in vitro (Бутенко, 1964; Калінін та ін., 1980; Калінін та ін.,1992; Митрофанова та ін., 1999).

Для отримання асептичної культури первинних експлантів нами розроблені способи стерилізації для кожного досліджуваного виду рослин. Експозицію й концентрацію стерилізуючої речовини підбирали залежно від типу експланта, що вводився. Як стерилізуючі агенти були використані 70%-ний етанол (С2Н5ОН, Медасепт, Україна), 1-2%-ні розчини гіпохлориту натрію (NACLO, Merck, Німеччина), 0,08%-ний розчин нітрату срібла (AGNO3, Merck, Німеччина), 1%-ний розчин Thimerosal (Merck, Німеччина) та їх комбінації, що дозволило звільнити експланти, що вводилися, від ендогенної та екзогенної інфекції.

В процесі вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин досліджуваних культур використані базові живильні середовища Піріка (Pierik, 1976), МС (Murashige, Skoog, 1962), Кнопа (Knop, 1865) і Буржен-Ніча (Bourgen-Nitsch, 1967), які були модифіковані нами в ході проведення експериментів: АЛ 1, АП 1, А 3, А 4, А, Б, С, S 1, S 2, S 3, Cl 1, Cl 2, Cl 3. Як регулятори росту використані БАП, кінетин, зеатин, 2,4-Д, ІОЦК, НОЦК, ІОЛК. Умови регенерації рослин у культуральній кімнаті: температура 21-29°С, 12-20-годинний фотоперіод, інтенсивність освітлення 1-5 клк і відносна вологість повітря 70%. Частину експлантів вміщували до термостату з температурою 25°С і 28°С. Субкультивування експлантів здійснювали за 3-4 тижні. експлант клональний мікророзмноження ризогенез

Вкорінення мікропагонів проводили на модифікованих живильних середовищах А 4, С, S 3, Cl 3, доповнених 0,98-4,40 МКМ ІОЛК. Вкорінені мікропагони висаджували на адаптацію in vivo в стерильні субстрати: торф; перліт; мікропарник (торф, збагачений мікроелементами); торф:перліт (1:1, 2:1); мікропарник:перліт (1:1, 2:1); торф:пісок (1:1, 2:1, 3:1); перліт:торф:пісок (1:6:4); торф:листкова земля:пісок (1:1:1). Адаптовані рослини далі вирощували в теплиці.

Статистичну обробку результатів експериментальних досліджень проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Лакін, 1990), послуговуючись прикладними програмами "Математична статистика" версія 6.0. Вірогідність відмінностей між отриманими експериментальними даними встановлювали за допомогою F-критерію Фішера.

Особливості отримання стерильної культури A. andreanum, B. riger elatior, S. ionantha і C. hortulanum. Використання для стерилізації рослинного матеріалу 70%-ного етанолу (С2Н5ОН), 1-2%-них розчинів гіпохлориту натрію (NACLO), 0,08%-ного розчину нітрату срібла (AGNO3), 1%-ного розчину Thimerosal та їх комбінацій дозволило визначити оптимальні способи стерилізації рослинного матеріалу досліджуваних культур. Ефективність стерилізації підвищували за рахунок додавання до кожного стерилізуючого агента детергенту Твін-80. Так, кращі результати були отримані за ступінчастої стерилізації листків і молодих ювенільних початків A. andreanum у 70%-ному С2Н5ОН з експозицією 60 сек, з подальшим вміщенням до 1%-ного розчину NACLO. Тривалість стерилізації залежала від типу експланта й становила 5 хв. для листкових експлантів і 7 хв. для початка, після чого рослинний матеріал ретельно промивали 4 рази в стерильній дистильованій воді. Це дозволило отримати 86% висічок листка і 85% сегментів початка A. andreanum, вільних від контамінації. Для суцвіть і листків B. riger elatior ефективнішою виявилася стерилізація в 70%-ному С2Н5ОН 1 хв., 1%-ному розчині NACLO з експозицією 10 хвилин і 4-разовим промиванням у стерильній дистильованій воді. За такого способу стерилізації вдалося досягти не тільки низького рівня зараження експлантів B. riger elatior (20%), але й отримати достатньо високий ступінь регенерації мікропагонів (80%). Листки C. hortulanum стерилізували в 1,8%-ному розчині гіпохлориту натрію протягом 5 хв., потім занурювали до 70%-ного етилового спирту. При цьому рівень контамінації був низький і складав 4-5%. Всі вільні від інфекції експланти мали високий морфогенетичний потенціал. Застосування 0,08% розчину AGNO3 і 1% розчину Thimerosal також сприяло виходу стерильних експлантів B. riger elatior і C. hortulanum. Проте їх послідовне використання мало помітний фітонцидний вплив на рослинні тканини, що далі викликало зниження морфогенетичного потенціалу й регенерації рослин. Асептична культура S. ionantha була отримана при послідовному зануренні листка до 1%-ного розчину Thimerosal з експозицією 25 хв., потім до 70%-ного С2Н5ОН - 1 хв. та до 0,08%-ного розчину AGNO3 - 3-5 хв. Після стерилізації рослинний матеріал тричі промивали в стерильній дистильованій воді. При такому способі стерилізації тканини листка на модифікованому середовищі S1 залишалися зеленими та надалі виявляли високу здатність до морфогенезу й регенерації (75-94%). Подальше збільшення експозиції стерилізації в 0,08%-ному розчині AGNO3 до 6-8 хв. сприяло 100%-ному виходу експлантів, вільних від контамінації, проте сильна фітотоксична дія на листки знижувала регенераційний потенціал до 12%. З огляду на отримані експериментальні дані, уся робота з впровадження експлантів досліджуваних квітково-декоративних культур грунтувалася на використанні ступінчастої стерилізації рослинного матеріалу.

Вплив генотипу і термінів відбору на індукцію розвитку первинних эксплантів A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha. Дослідження показали, що здатність введених експлантів до морфогенезу і регенерації мікропагонів в умовах in vitro значною мірою залежали від термінів відбору вихідного матеріалу. Відбір експлантів A. andreanum сорту Porzellan проводили протягом усього року. При цьому 91-96% експлантів проліферували калюс. Найкращою порою для введения в культуру in vitro висічок листка та сегментів початка A. andreanum сорту Iga-Gold була осінь-весна. При цьому частота калюсогенезу сягала 95%. У експлантів, відібраних з травня по жовтень, цей показник не перевищував 50%. Встановлено, що високий морфогенетичний потенціал мали висічки листка A. andreanum 2-4-тижневого віку, що перебувають у стадії виходу з трубки, і сегменти ювенільного початка.

Відбір листків C. hortulanum і їх введення в культуру in vitro проводили з травня по вересень включно. Встановлено, що висічки листків, відібрані в період з травня по серпень мали високий морфогенетичний потенціал. При цьому частота утворення мікропагонів сягала 78-100%. У листкових експлантів, введених в умови in vitro в вересні, частота регенерації мікропагонів не перевищувала 45%. Кращий розвиток мікророзеток B. riger elatior у культурі in vitro спостерігали при ізоляції експлантів у період з серпня по жовтень. Разом з тим, було встановлено, що високий морфогенетичний потенціал мали висічки листків 2-3-річних рослин S. ionantha, що вводяться в умови in vitro, протягом всього року. Зі збільшенням віку рослини-донора до 4-5 років спостерігали значне зменшення здатності до морфогенезу і регенерації рослин сортів, що вивчалися. Подальші дослідження проводилися з урахуванням виявлених закономірностей.

Вивчення регенераційного потенціалу A. andreanum. Для розроблення біотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження двох досліджуваних сортів A. andreanum були вивчені особливості органогенезу та встановлені основні фактори, що впливають на морфогенетичний потенціал органів і тканин досліджуваних видів рослин. Виявлено, що ними є генотип рослини, концентрація регуляторів росту в живильному середовищі, температура, інтенсивність освітлення і фотоперіод. В процесі досліджень модифіковано склад живильних середовищ Піріка і підібрано ефективні концентрації регуляторів росту для індукції калюсоутворення в культурі висічок листка і сегментів початка двох сортів A. andreanum. Показано, що застосування 4,40 МКМ БАП і 0,9 МКМ 2,4-Д в середовищі АЛ 1 для висічок листка A. andreanum 2-4-тижневого віку розміром 1х1 см і 4,40 МКМ БАП і 0,45 МКМ 2,4-Д в середовищі АП 1 для сегментів початка розміром 2-3 мм дозволило індукувати активне калюсоутворення двох сортів в умовах in vitro. Максимальна вага калюсу за 60 діб культивування у висічках листків сорту Iga-Gold сягала 70-75 мг, у сорту Porzellan - 85-90 мг.

В результаті виконання експериментів встановлено, що активна регенерація мікропагонів у культурі висічок листка й сегментів початка відбувалася на модифікованому живильному середовищі А 3, доповненому 4,40 МКМ БАП.

Розвиток адвентивних бруньок і регенерація мікропагонів відбувалися одночасно. З калюсу розміром 1,5-2 см3 за 6 тижнів культивування отримано до 30 мікропагонів сорту Iga-Gold і до 35 - сорту Porzellan. Мікропагони регенерували протягом 4-5 місяців. За цей період отримано в середньому до 70 мікропагонів на експлант. Відокремлення мікропагонів сприяло відновленню процесу регенерації в калюсі A. andreanum протягом 3-4 пасажів. Проте після цього морфогенетичні потенції калюсу знижувалися. На живильному середовищі, доповненому 4,40 МКМ БАП, відзначалось спонтанне формування коренів.

Утворення мікропагонів і коренів на даному середовищі А 3 істотно скорочувало цикл регенерації рослин, виключаючи додаткові пасажі.

У процесі проведення досліджень встановлено вплив температури, інтенсивності освітлення, фотоперіоду на регенераційну здатність висічок листка і сегментів початка. Виявлено, що індукція калюсогенезу з висічок листка й сегментів початка A. andreanum відбувалася за температурі 28±1°С у відсутності освітлення. Швидкість формування калюсу і його маса в цьому випадку були максимальними. При інтенсивності освітлення 2-3 клк і 14-годинному фотоперіоді активна регенерація мікропагонів відбувалася при температурі 25-26°С і 26-27°С у сорту Porzellan (85%) та в сорту Iga-Gold (68%), відповідно. Встановлено оптимальне значення РН живильного середовища (5,5 і 5,8) для нормального росту й розвитку рослин A. andreanum в умовах in vitro при культивуванні сегментів початка й висічок листка, відповідно Показано, що 92% висічок листа і 89% сегментів початка двох сортів A. andreanum мали високий регенераційний потенціал.

Особливості регенерації органів і тканин B. riger elatior. Вивчена регенераційна здатність листкових експлантів пяти сортів B. riger elatior в умовах in vitro. На основі проведених експериментів визначені регулятори росту в живильному середовищі, що індукують пряму регенерацію мікророзеток сортів Krefeld і Schwabenland. Встановлені оптимальні концентрації БАП (11,20 МКМ) і ІОЦК (5,71 МКМ) в середовищі МС, при яких після введення висічок листка розміром 1 х 1 см за 3-3,5 тижнів культивування формувалися численні адвентивні бруньки. Виявлено, що інтенсивність адвентивного пагоноутворення сягала максимуму за 8 тижнів культивування. Мікророзетки в умовах in vitro регенерували без етапу калюсоутворення, що забезпечувало їх генетичну стабільність. Виявлено, що подальше збільшення концентрацій регуляторів росту спричиняло утворенню калюсу двох типів, що значно знижує частоту регенерації мікророзеток.

Разом з тим, було встановлено, що положення листкових експлантів на живильному середовищі також мало значний вплив на частоту регенерації мікророзеток B. riger elatior сортів Krefeld і Schwabenland. Показано, що більший вихід мікророзеток отримано при адаксіальному розташуванні листкових експлантів на поверхні живильного середовища, ніж при абаксіальному. Кількість листкових експлантів, що регенерують мікророзетки, за 8 тижнів культивування при адаксіальному розташуванні сягала 95% у сорта Schwabenland і 98% у сорта Krefeld. Таким чином, було отримано ефективну пряму регенерацію мікророзеток з висічок листка B. riger elatior сортів Krefeld і Schwabenland. При цьому встановлена її залежність від генотипу експланта, розташування експланта на поверхні живильного середовища, комбінацій регуляторів росту в живильному середовищі.

Проте в ході експериментів так і не вдалося індукувати пряму регенерацію в культурі ізольованих листкових експлантів B. riger elatior сортів Nixi red, Nixi rose і Lorrenie. У звязку з цим у додаткові дослідження як первинні експланти були включені сегменти суцвіть квітучих рослин пяти сортів B. riger elatior. Морфогенетичний потенціал первинних експлантів реалізувався через непрямий органогенез. Застосування різних регуляторів росту в культурі сегментів суцвіть показало, що БАП і НОЦК виявилися найбільш ефективними цитокініном і ауксином на початковому етапі клонального мікророзмноження сортів, що вивчалися. Максимальну частоту індукції калюсоутворення з сегментів суцвіть розміром 12 мм відзначали на модифікованому живильному середовищі А, що містить макроелементи за Кнопом, мікроелементи за Буржен-Нічем, доповненому 1,49 МКМ тіаміну, 54,29 МКМ аденіну сульфату, 30 г/л сахарози, 2,69 МКМ НОЦК і 13,30 МКМ БАП (рис. 3). Встановлено, що активна регенерація і розвиток мікророзеток відбувалися на середовищі Б, доповненому 4,40 МКМ БАП. Для масової проліферації мікророзеток разом з БАП до живильного середовища додатково вводили 2,69 МКМ НОЦК і 1,14 МКМ ІОЦК (рис. 4).

За 2-3 тижні культивування формувалися мікророзетки з 2-4 листками. Встановлено залежність частоти регенерації від тривалості культивування калюсу. Так, середня частота регенерації з калюсу 1-го пасажу сортів Krefeld і Schwabenland становила 80-84%, а в сортів Nixi red, Nixi rose і Lorrenie - 70-73%. У більшості сортів B. riger elatior регенерація обмежувалася 1-2 пасажами. У сорту Krefeld формування адвентивних бруньок і мікропагонів тривало до 3-4 пасажів. При тривалішому культивуванні калюсу після 5-7 пасажів відзначали формування аномальних нежиттєздатних мікророзеток.

Дослідження впливу основних фізичних факторів на морфогенетичні потенції експлантів B. riger elatior показали, що інтенсивність освітлення 2-3 клк, температура 23-25°С і 16-годинний фотоперіод виявилися найбільш ефективними при прямій регенерації з висічок листка (85,6% - сорту Krefeld і 94,6% - сорту Schwabenland) і непрямій регенерації з сегментів суцвіть. Мікророзетки, що утворилися, мали інтенсивне зелене забарвлення. Виявлено, що 88-96% ізольованих сегментів суцвіть 5 сортів B. riger elatior, що вивчаються, активно формували морфогенний калюс за тих самих умов освітлення.

Виявлено вплив генотипу на частоту регенерації. Так, за однакових умов культивування найактивніше розвивалися сорти Krefeld і Schwabenland (червоні, неповні), і менш активно - сорти Nixi red, Nixi rose і Lorrenie (з напівповними та повними квітками). Кількість мікророзеток на експлант при цьому становила 30,2±5,2 шт. у сорту Krefeld, 31,3±1,7 шт. - у сорту Schwabenland, 27,9±1,2 шт. - у сорту Nixi red, 26,6±1,2 шт. - у сорту Nixi rose і 21,3±2,7 шт. - у сорту Lorrenie. Таким чином, отримані результати показали значну роль епігенетичних, гормональних і фізичних факторів у процесі регенерації рослин B. riger elatior.

Індукція пагоноутворення в культурі листкових експлантів S. ionantha. Для розроблення біотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження зеленолистих і строкатолистих форм гібридних S. ionantha проведено вивчення морфогенетичних потенцій листкових експлантів в умовах in vitro. Вивчено вплив різних концентрацій і поєднань цитокінінів (БАП і кінетину) та ауксинів (НОЦК і ІОЦК), які індукували активну регенерацію мікророзеток і формування нормальних рослин S. ionantha. Встановлено, що 96% висічок листка зеленолистих форм і 90% - строкатолистих при культивуванні на живильному середовищі S 1, доповненому 8,61 МКМ гліцину, 555,1 МКМ мезоінозиту, 0,29 МКМ тіаміну- HCL, 2,96 МКМ піридоксину- HCL, 4,06 МКМ нікотинової кислоти, 3% сахарози, 2,22 МКМ БАП і 0,27-1,07 МКМ НОЦК були здатні до регенерації мікророзеток. При цьому середня кількість мікророзеток на експлант у зеленолистих форм S. ionantha становило 20-25 шт., а у строкатолистих - 15-20 шт.

У процесі досліджень було відзначено, що наявність у живильному середовищі як регуляторів росту 2,32-4,60 МКМ кінетину та 2,85-5,71 МКМ ІОЦК знижувала частоту регенерації мікророзеток (8-10 шт. / експлант у строкатолистих і 10-13 - у 1-сорт Alocha Orchid, 2-сорт Ruffled Skyes, 3-сорт Ruffles Snow Rose, 4-сорт Apachi Midnight, 5-сорт Margerys Melody, 6-сорт Ness Orange Pekoe

На етапі власне мікророзмноження використовували живильне середовище S 2, що містить половинну концентрацію макро- й мікросолей, вітаміни та сахарозу за МС, доповнену 0,44 МКМ БАП.

При проведенні експериментів було виявлено залежність регенераційної здатності висічок листків двох форм S. ionantha від розміру й розташування експланта на поверхні живильного середовища. В середньому 92% листкових експлантів зеленолистих форм і 89% - строкатолистих форм розміром 1 х 1 см регенерували мікропагони. Показано, що адаксіальне розташування експлантів на поверхні живильного середовища збільшувало частоту регенерації порівняно з абаксіальним до 98% у зеленолистих і до 95% у строкатолистих форм.

Разом з тим, виявлені ефективні значення фізичних факторів культивування. Так, до появи адвентивних бруньок по краях висічок листка ізольовані листкові експланти перші два тижні культивування перебували в термостаті при температурі 28°С. При 16-годинному фотоперіоді, інтенсивності освітлення 2-3 клк і відносній вологості повітря 70% визначено оптимальну температуру, 23±1°С, при якій частота регенерації мікророзеток становила 87% у строкатолистих і 94% у зеленолистих форм. Таким чином, отримані дані свідчать про високу регенераційну здатність листкових експлантів двох форм S. ionantha в умовах in vitro.

Вивчення морфогенетичного потенціалу листкових експлантів C. hortulanum. У процесі досліджень модифіковано склад живильних середовищ (Cl 1, Cl 2) і підібрані оптимальні концентрації регуляторів росту (кінетину, БАП, НОЦК) для індукції процесів морфогенезу з висічок листка чотирьох сортів C. hortulanum. Як контроль обрано сорт Triumphe de Compte, біотехнологічна система отримання рослин якого була розроблена І.В. Митрофановою. В наші дослідження були включені, крім сорту Triumphe de Compte, три нових сорти C. hortulanum з колекції НБС-ННЦ: Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose.

Серед досліджених концентрацій кінетину оптимальними були 2,32-3,25 МКМ, при якій на живильному середовищі Cl 1 на 69,3% висічок листка сорту Gipsy Rose, 69,9% - сорту Triumphe de Compte, 70,2% - сорту Frieda Hemple і 74,2% - сорту Candidum при температурі 25°С за відсутності освітлення формувалися соматичні зародки (табл. 1). Встановлено, що зони з обох боків від центральної жилки і зона зєднання листкової пластинки з черешком мали високу здатність формувати незиготичні зародки. Цю закономірність відзначали в усіх сортів, що вивчалися. Розвиток соматичних зародків відбувався без етапу калюсоутворення і тривав протягом 27-35 діб залежно від сорту.

Таблиця 1

Вплив різних концентрацій кінетину на ембріогенний потенціал висічок листка сортів C. hortulanum на живильному середовищі Cl 1, доповненому 5,37 МКМ НОЦК

Концентрація кінетину, МКМ Кількість експлантів, що утворили соматичні ембріоїди ,% сорт Triumphe de Compte сорт Frieda Hemple сорт Candidum сорт Gipsy Rose

1,39 13,9±3,6 8,3±3,1 11,3±3,4 7,5±2,8

2,32 69,9±5,7 70,2±5,7 51,2±3,8 69,3±5,7

3,25 37,3±5,1 34,3±4,9 74,2±4,9 36,9±5,1

4,60 18,4±4,2 17,4±4,2 38,3±5,1 20,1±4,2

У ході проведення експериментів також виявлено, що реалізація морфогенетичного потенціалу листкових експлантів у процесі прямої та непрямої регенерації мікропагонів C. hortulanum при 16-годинному фотоперіоді здійснювалася на живильному середовищі Cl 2, доповненому БАП і НОЦК.

Визначені оптимальні концентрації регуляторів росту в живильному середовищі, які сприяли формуванню максимальної кількості мікропагонів і виявлені особливості органогенезу окремих сортів. Так, на листкових експлантах сортів Frieda Hemple і Gipsy Rose на живильному середовищі Cl 2, доповненому 2,22 МКМ БАП і 2,69 МКМ НОЦК спостерігали формування калюсу, а потім і появу численних меристемоїдів. Кількість мікропагонів становила 18 шт. на експлант у сорту Frieda Hemple і 15 - у сорту Gipsy Rose. Формування адвентивних бруньок на листкових експлантах сортів Triumphe de Compte і Candidum відбувалося без етапу калюсоутворення. При цьому 92,3% висічок листка сорту Triumphe de Compte і 90,1% - сорту Candidum регенерували мікропагони на живильному середовищі Cl 2, доповненому 2,22-2,66 МКМ БАП, на фоні 2,69 МКМ НОЦК. Виявлено, що адаксіальне розташування висічок листка на поверхні живильного середовища порівняно з абаксіальним збільшувало частоту регенерації мікропагонів у всіх досліджуваних сортів.

Встановлено вплив фізичних факторів на пряму та непряму регенерацію мікропагонів в умовах in vitro. Визначено оптимальну температуру (25°С), за якої середня кількість соматичних зародків на експлант становила 20,4±2,6 шт. При інтенсивності освітлення 2-3 клк, 16-годинному фотоперіоді і температурі 24±1°С частота регенерації мікропагонів сягала 92% у сорту Triumphe de Compte і 90% у сорту Candidum. Таким чином, показано, що регенерація рослин досліджуваних сортів C. hortulanum може відбуватися через прямий і непрямий органогенез і соматичний ембріогенез.

Вкорінення мікропагонів in vitro і адаптація рослин in vivo

Вкорінення мікропагонів є необхідним етапом завершення клонального мікророзмноження. Успішність розмноження і вкорінення рослин залежать від біологічних і фізіологічних особливостей обєкту, що вивчається, включаючи гормональні, трофічні й фізичні фактори культивування.

У процесі проведення досліджень було вивчено дію різних ауксинів (НОЦК, ІОЦК, ІОЛК) і їх поєднань на процеси коренеутворення A. andreanum, B. riger elatior, С. hortulanum і S. ionantha в умовах in vitro. Встановлено, що в більшості видів рослин, що вивчалися, процес ризогенезу найефективніше відбувався за наявності у складі живильного середовища ІОЛК. Кращі результати були отримані при культивуванні мікропагонів двох сортів A. andreanum на модифікованому середовищі А 4, що містить половинну концентрацію макроелементів, мікроелементи і вітаміни в повному обсязі і доповненому 2,46 МКМ ІОЛК. Показано, що за 2-3 тижні культивування середня вкорінюваність мікропагонів у A. andreanum склала 94,3±1,7% (табл. 2). При цьому кількість коріння у середньому завдовжки 4,0±1,1см на один мікропагін сягала 4,0±1,4 шт. незалежно від сорту. Рослини A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, отримані з висічок листка і сегментів початка, не мали жодних морфологічних відхилень як при порівнянні між собою, так і відносно вихідної рослини-донора.

Встановлено, що активне утворення коріння у мікророзеток B. riger elatior відбувалося на середовищі С, у присутності 4,90 МКМ ІОЛК (див. табл. 2). Через 14 діб середня кількість коренів складала 4,1±1,2 шт. на мікророзетку, а їх середня довжина - 2,5±0,9 см. Введення до живильного середовища ІОЦК і НОЦК замість ІОЛК викликало утворення калюсу в основі мікророзеток, який перешкоджав закладенню коренів.

Дослідження показали, що 2,46 МКМ ІОЛК у живильному середовищі Cl 3 з Ѕ норми солей за МС, стимулювало ризогенез у середньому у 90,0±1,3% мікропагонів С. hortulanum. За 14 діб культивування мікророзеток розвивалося в середньому 4,0±1,3 коренів завдовжки 6,0±1,2 см.

Використання безгормонального живильного середовища S 3 з вітамінами за МС і 20 г/л сахарози сприяло формуванню коренів у S. ionantha за 12-14 діб при середній частоті ризогенезу 84,5±2,4%. Середня кількість коренів завдовжки 1,8-2,0 см у зеленолистих форм склала 5-6 шт. на пагін, у строкатолистих - 4-5 шт. на пагін завдовжки 1,5-2,0 см. У процесі проведення роботи виявлені сортові особливості S. ionantha. Так, частота ризогенезу мікророзеток зеленолистих форм становила 91-98%, тоді як цей показник у строкатолистих форм сягав 73-88%.

Таблиця 2

Вплив ІОЛК на частоту вкорінення мікропагонів А. andreanum, B. riger elatior і С. hortulanum в умовах in vitro

Культура Живильне середовище Концентрація ІОЛК, МКМ Кількість коренів на пагоні, шт. Довжина коренів, см Частота вкорінення, %

А. andreanum B. riger elatior C. hortulanum А 4 С Cl 3 2,46 4,90 2,46 4,0±1,4 4,1±1,2 4,0±1,3 4,0±1,1 2,5±0,9 6,0±1,2 94,3±1,7 100 90,0±1,3

Під час розроблення способу адаптації пробіркових рослин велика увага приділялася якісним характеристикам отриманих регенерантів і підбору адаптаційних субстратів, що являють собою суміш природних і синтетичних компонентів у певних співвідношеннях. Встановлено, що для регенерантів A. andreanum і B. riger elatior кращими виявилися суміш торфу й перліту (2:1), для C. hortulanum - суміш торфу і піску (3:1), для S. ionantha - суміш мікропарнику і перліту (1:1). Використання даних стерильних субстратів дозволило збільшити частоту приживаності рослин в умовах in vivo до 95-100% у A. andreanum, 95% у B. riger elatior, 90-94% у C. hortulanum і 78-95% у S. ionantha. У перші дні адаптації рослини витримували в приміщенні при температурі 22-24°С в умовах підвищеної вологості (80-90%), а через 2 тижні при відносній вологості 70%. Встановлена середня тривалість періоду адаптації, яка склала 1,5-2 місяці. Адаптовані рослини відрізнялися добрим розвитком кореневої системи і надземної частини. Після висадження у вазони більшого обєму рослини переносили для дорощування в теплицю.

Таким чином, виявлені особливості ризогенезу мікропагонів і мікророзеток у A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha в умовах in vitro. Підібрано ефективний склад адаптаційних сумішей, що забезпечило високу частоту приживаності пробіркових рослин.

В результаті проведених досліджень розроблені способи клонального мікророзмноження квітково-декоративних культур, що подані у вигляді біотехнологічних схем та складаються з послідовних етапів: відбір первинних експлантів для введення до умови in vitro; стерилізація рослинного матеріалу; вичленення експлантів і введення їх до умов in vitro, непряма регенерація в культурі листкових експлантів, сегментів початка та суцвіття; пряма регенерація в культурі листкових експлантів; соматичний ембріогенез; укорінення мікропагонів (мікророзеток); адаптація пробіркових рослин in vivo (A. andreanum у культурі висічок листка та сегментів початка - 6 етапів, B. riger elatior у культурі листкових експлантів - 6 етапів, у культурі сегментів суцвіть - 6 етапів; С. hortulanum - через соматичний ембріогенез - 5 етапів; через органогенез - 6 етапів; S. ionantha у культурі листкових експлантів - 6 етапів).1. У результаті вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин двох сортів A. andreanum, пяти сортів B. riger elatior, чотирьох сортів C. hortulanum і шести сортів S. ionantha встановлені основні закономірності процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу цих культур в умовах in vitro та на їх основі розроблені способи клонального мікророзмноження перспективних квітково-декоративних рослин.

2. Виявлено, що морфогенез і регенерація рослин в умовах in vitro залежать від генотипу, термінів відбору, типу, розміру, розташування первинного експланта на поверхні живильного середовища. Високу регенераційну здатність мали висічки листка 2 сортів A. andreanum (50-96%), 2 сортів B. riger elatior (95-98%), 6 сортів S. ionantha (90-96%) і 4 сортів C. hortulanum (90-92%) розміром 1 х 1 см, розташовані адаксіально до поверхні живильного середовища, а також сегменти початка 2 сортів A. andreanum (50-96%) розміром 2-3 мм, 5 сортів суцвіть B. riger elatior (91-96%) - 12 мм.

3. Виявлені відмінності в морфогенетичних реакціях висічок листка й сегментів суцвіть культур, що вивчаються, на модифікованих живильних середовищах МС, Піріка і Буржен-Ніча. Так, у культурі листкових експлантів 2 сортів B. riger elatior (8,90-11,20 МКМ БАП і 5,71 МКМ ІОЦК), 2 сортів C. hortulanum (2,22-2,66 МКМ БАП і 2,69 МКМ НОЦК) і 6 сортів S. ionantha (2,22 МКМ БАП і 0,27-1,07 МКМ НОЦК) морфогенетичний потенціал реалізувався через прямий органогенез. Непрямий органогенез відбувався в культурі листкових експлантів (4,40 МКМ БАП і 0,9 МКМ 2,4-Д) і сегментів початка (4,40 МКМ БАП і 0,45 МКМ 2,4-Д) 2 сортів A. andreanum, в культурі листкових експлантів (2,22 МКМ БАП і 2,69 МКМ НОЦК) 2 сортів C. hortulanum і в культурі сегментів суцвіття (13,30 МКМ БАП і 2,69 МКМ НОЦК) 5 сортів B. riger elatior. Соматичний ембріогенез відзначався в культурі листкових експлантів (2,32-3,25 МКМ кінетину і 5,37 МКМ НОЦК) 4 сортів C. hortulanum.

4. Визначені основні фізичні фактори культивування, що впливають на ефективність регенерації досліджуваних видів рослин. Показано, що інтенсивність освітлення 2-3 клк, 14-16-годинний фотоперіод і температура 23-27°С були оптимальними для індукції органогенезу квітково-декоративних культур. Поряд з тим, індукція калюсоутворення в культурі висічок листка й сегментів початка A. andreanum, формування адвентивних бруньок в культурі листкових експлантів S. ionantha і соматичних зародків в культурі висічок листка C. hortulanum відзначали у відсутності освітлення при температурі 28°С і 25°С, відповідно.

5. Показано, що активне утворення коренів у A. andreanum (96%) і C. hortulanum (86-94%) відбувається у присутності 2,46 МКМ ІОЛК в живильному середовищі. ІОЛК у концентрації 4,90 МКМ збільшувало частоту корнеутворення у B. riger elatior до 100%. Вкорінення мікророзеток S. ionantha (71-98%) відбувається у відсутності регуляторів росту в живильному середовищі.

6. Визначені умови адаптації пробірних рослин in vivo. Так, приживаність регенерантів A. andreanum і B. riger elatior у суміші торфу й перліту (2:1) становила 95-100% і 87-90%, відповідно; C. hortulanum 86-94% - у суміші торфу й піску (3:1) і S. ionantha - 78-95% у суміші мікропарнику й перліту (1:1).

7. Представлені біотехнологічні схеми клонального мікророзмноження A. andreanum, B. riger elatior, C. hortulanum і S. ionantha, які грунтуються на прямій та непрямій регенерації рослин з вегетативних і генеративних експлантів, що дозволяє отримувати високоякісний садивний матеріал.

Практичні рекомендації

1. Рекомендується використовувати розроблені біотехнологічні схеми клонального мікророзмноження, що грунтуються на культивуванні вегетативних і генеративних експлантів в умовах in vitro для масового розмноження рослин A. andreanum сортів Porzellan і Iga-Gold, B. riger elatior сортів Krefeld, Lorrenie, Nixi red, Nixi rose, Schwabenland, C. hortulanum сортів Triumphe de Compte, Frieda Hemple, Candidum, Gipsy Rose, S. ionantha сортів Alocha Orchid, Apachi Midnight, Margerys Melody, Ness Orange Pekoe, Ruffled Skyes, Ruffles Snow Rose.

2. Рекомендується використовувати розроблений спосіб прямого і непрямого органогенезу A. andreanum, B. riger elatior, S. ionantha і C. hortulanum для отримання високоякісного садивного матеріалу та для створення нових селекційних форм.

3. Матеріали, подані в дисертаційній роботі, можуть бути використані у вузах для розроблення навчальних курсів, спецкурсів і проведення лабораторно-практичних занять з біотехнології рослин та декоративного садівництва.

Иванова Н.Н. Клональное микроразмножение некоторых лиственных декоративных растений / Н.Н. Иванова // Труды Никит. ботан. сада. - 1997. - Т. 119: Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур. - С. 153-168.

Иванова Н.Н. Микроразмножение Anthurium andreanum Lind. и Begonia Riger Elatior в условиях in vitro / Н.Н. Иванова // Бюлл. Никит. ботан. сада. - Вып. 86. - 2002. - С. 40-42.

Иванова Н.Н. Особенности регенерации растений интродуцированных сортов фиалки узамбарской (Saintpaulia ionantha Wendl.) в условиях in vitro / Н.Н. Иванова // Труды Никит. ботан. сада. - 2007. - Т. 128: Биотехнологические и биохимические исследования многолетних растений. - С. 59-66.

Митрофанова И.В. Пути реализации морфогенетического потенциала каладиума (Caladium hortulanum Birdsey.) и цветной каллы (Zantedeschia hybrida) в условиях in vitro / И.В. Митрофанова, О.И. Соколов, О.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова // Біологічний вісник. - 2006. - Т. 10, №1. - С. 64-67. (Дисертантом виконано частину досліджень, проведено аналіз експериментальних даних і написано частину статті).

Митрофанова И.В. Биотехнологическая система получения растений каладиума (Caladium hortulanum Birdsey.) через соматический эмбриогенез и органогенез / И.В. Митрофанова, М.К. Соколова, О.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова, С.В. Челомбит // Труды Никит. ботан. сада. - 2007. - Т. 127: Биохимические и биотехнологические исследования многолетних декоративных косточковых плодовых и эфиромасличных культур. - С. 50-60. (Здобувачем виконано частину досліджень, проведено аналіз експериментальних даних).

Иванова Н.Н. Сравнительное изучение регенерационной способности листовых эксплантов крупноцветковых и пестролистных сортов сенполии Saintpaulia ionantha Wendl. / Н.Н. Иванова // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. пр. Укр. т-ва генетиків селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К.: Логос, 2007. - Т. 2. - С. 488-492.

Митрофанова И.В. Различные пути морфогенеза in vitro каладиума (Caladium hortulanum Birdsey.) как способы получения растений / И.В. Митрофанова, В.Н. Ежов, Н.Н. Иванова, С.В. Челомбит // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К.: Логос, 2008. - Т. 5. - С. 297-302. (Дисертантом разом зі співавторами проаналізовані результати досліджень, зроблені основні висновки, підготовлені матеріали для публікації).

Митрофанова О.В. Микроразмножение бегонии Элатиор / О.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова // Цветоводство. - 1986. - №6. - С. 12-13. (Дисертантом проведено частину експериментів, спільно зі співавтором подготовлені матеріали до друку).

Иванова Н.Н. Роль фитогормонов в получении растений-регенерантов бегонии ригер Элатиор / Н.Н. Иванова // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Мат-лы междунар. конф. молодых ученых, 24-26 октября 1994, г. Ялта. - Ялта, 1994. - С. 37-38.

Иванова Н.Н. Действие разных фитогормонов на регенерацию бегонии Ригер Элатиор in vitro / Н.Н. Иванова, О.В. Митрофанова // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Мат-лы междунар. конф. молодых ученых, 24-26 октября 1994, г. Ялта. - Ялта, 1994. - С. 49-52 (Здобувачем проведено експериментальну работу, аналіз результатів, написано текст статі, зі співавтором - формулювання основних положень і висновків.

Иванова Н.Н. Особенности клонального микроразмножения Anthurium andreanum и Begonia Elatior / Н.Н. Иванова // Meeting of Young Scientists in Horticulture: 7 Intl. Conf., September 14-16, 1999, Lednice, Czech Republic. Materials. - Lednice, 1999. - P. 168-171.

Митрофанова И.В. Биотехнологические системы оздоровления и клонального микроразмножения цветочно-декоративных растений / И.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова, О.В. Митрофанова, В.Н. Ежов // Геном рослин: Мат-лы V Міжнар. конф., 13-16 жовтня 2008 р. - Одеса, 2008. - С. 207-209. (Дисертантом виконано частину досліджень і проведен аналіз експериментальних даних).

Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез in vitro - пути регенерации растений Caladium hortulanum Birdsey. / И.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова, О.В. Митрофанова, С.В. Челомбит // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тезисы докл. IX Междунар. конф., Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. - М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. - С. 250.

Ivanova N. Biotechnology methods of propagation in ornamental pot plants Anthurium andreanum Lind and Begonia Riger Elatior / N. Ivanova // Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resourses. - Yalta, 2002. - P. 32.

Ivanova N.N. Clonal micropropagation Saintpaulia ionantha Wendle. Gesneriaceae / N.N. Ivanova, I.V. Mitrofanova // Plant Biotechnology: II Intl. Symp., October 4-8, 1998, Kyiv. Abstracts. - Kyiv, 1998. - P. 47.

Митрофанова О.В. Биотехнология клонального микроразмножения безвирусного антуриума Андрэ / О.В. Митрофанова, Н.Н. Иванова, И.В. Митрофанова, Л.В. Левкина // Экспресс информ. ЦБНТИ Минжилкомхоза РСФСР. - 1985. - Вып. 6, №13. - 10 с. (Особистий внесок дисертанта - збір і аналіз отриманого матеріалу, написання частини тексту).

Размещено на .ru