Особливості антиоксидантного захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae на різних фазах росту культури - Автореферат

Активовані форми кисню (АФК) утворюються в клітині як побічні продукти метаболізму або внаслідок дії різних зовнішніх факторів. У випадку, коли швидкість утворення АФК перевищує швидкість їх деградації, клітина зазнає оксидативного стресу (Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 1999). Відповідь S. cerevisiae на дію пероксиду водню в експоненційній фазі росту характеризується, насамперед, збільшенням синтезу ферментів, які знешкоджують Н2О2, зокрема каталази [КФ 1.11.1.6] (Godon C. et al., 1998; Lee J. et al., 1999). У даній роботі ми зосередили свою увагу на вивченні ролі каталази в захисті від пероксиду водню культур S. cerevisiae, в яких клітини інтенсивно діляться (експоненційна фаза росту) і в яких поділ клітин обмежений внаслідок нестачі живильних речовин у середовищі культивування (стаціонарна фаза росту). 2) вивчити вплив пероксиду водню на життєздатність клітин, активність антиоксидантних і функціонально повязаних з ними ферментів та вміст карбонільних груп білків як показників оксидативного стресу в батьківського та ізогенного безкаталазного штамів S. cerevisiae за умов нестачі живильних речовин (стаціонарна фаза росту);У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих аспектів проблеми захисту дріжджів S. cerevisiae від оксидативного стресу, спричиненого пероксидом водню. Виявлено, що відповідь S. cerevisiae на дію Н2О2 залежить як від способу індукції стресу, так і від генетичних і фізіологічних особливостей штамів. Відповідь S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту на оксидативний стрес, індукований 0,25-0,5 ММ Н2О2, полягає в збільшенні активності каталази та супероксиддисмутази, проте величина цього ефекту залежить від штаму і блокується циклогексимідом, інгібітором біосинтезу білка. Модифікація активності каталази і супероксиддисмутази в клітинах S. cerevisiae за дії оксидативного стресу залежить від умов його індукції, а саме: від складу середовища інкубації, концентрації і часу обробки пероксидом водню, кількості клітин у суспензії. Так, у клітинах штаму YPH98, ресуспендованих у середовищі з 1% глюкозою, за дії 0,25 ММ і 0,5 ММ Н2О2 протягом 30 хв активність каталази зростає в 2-3 рази і СОД в 1,6 рази, а при індукції стресу в 50 ММ калій-фосфатному буфері активується тільки каталаза - в 1,4-2,0 рази.

Основний зміст роботи

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих аспектів проблеми захисту дріжджів S. cerevisiae від оксидативного стресу, спричиненого пероксидом водню. Виявлено, що відповідь S. cerevisiae на дію Н2О2 залежить як від способу індукції стресу, так і від генетичних і фізіологічних особливостей штамів. Отримані результати поглиблюють знання про роль каталази в захисті S. cerevisiae від пероксиду водню в експоненційній фазі росту культури і за умов голодування.

1. Відповідь S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту на оксидативний стрес, індукований 0,25-0,5 ММ Н2О2, полягає в збільшенні активності каталази та супероксиддисмутази, проте величина цього ефекту залежить від штаму і блокується циклогексимідом, інгібітором біосинтезу білка. Відмінності в активності каталази і супероксиддисмутази в дріжджів дикого типу зумовлюють різну чутливість їхніх клітин до високих концентрацій пероксиду водню. У відповіді S. cerevisiae на дію пероксиду водню беруть участь обидва ізоферменти каталази та Cu,Zn-вмісна, але не Mn-вмісна супероксиддисмутаза.

2. Модифікація активності каталази і супероксиддисмутази в клітинах S. cerevisiae за дії оксидативного стресу залежить від умов його індукції, а саме: від складу середовища інкубації, концентрації і часу обробки пероксидом водню, кількості клітин у суспензії. Так, у клітинах штаму YPH98, ресуспендованих у середовищі з 1% глюкозою, за дії 0,25 ММ і 0,5 ММ Н2О2 протягом 30 хв активність каталази зростає в 2-3 рази і СОД в 1,6 рази, а при індукції стресу в 50 ММ калій-фосфатному буфері активується тільки каталаза - в 1,4-2,0 рази.

3. Пероксид водню за високих концентрацій призводить до інактивації антиоксидантних та повязаних з ними ферментів у клітинах S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту. Узгоджене функціонування каталази і супероксиддисмутази за цих умов знижує ймовірність окисних пошкоджень захисних білків.

4. У середині експоненційної фази росту культури відсоток життєздатних клітин дикого YPH250 та безкаталазного YWT1 штамів після обробки 5 ММ Н2О2 протягом 30 хв становить 52 і 20%, а за голодування - 82 і 48% відповідно. Отже, каталаза забезпечує стійкість S. cerevisiae до пероксиду водню в даних умовах.

5. Стрес, індукований 0,5 ММ Н2О2 в умовах голодування, призводить до збільшення вмісту карбонільних груп білків і зниження активності глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази в 1,4 рази в безкаталазного штаму YWT1, проте не впливає на ці показники та викликає зростання активності каталази в 1,5 рази в дикого штаму YPH250. Отже, за голодування каталаза запобігає окисленню клітинних білків за дії пероксиду водню.

6. Ступінь інгібування каталази 3-аміно-1,2,4-триазолом in vivo й in vitro залежить від концентрації інгібітора та часу інкубації. Пероксисомна форма каталази in vitro чутливіша до дії АМТ, ніж цитозольна. Зниження активності каталази S. cerevisiae YPH250, інкубованих з 10 ММ АМТ в 0,9% NACL, на 65% супроводжується збільшенням активності глутатіонредуктази в 1,4 рази, що свідчить про індукцію компенсаторних механізмів.

1. Байляк М.М., Абрат О.Б., Семчишин Г.М., Лущак В.І. Виживання і антиоксидантний захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae за умов голодування і оксидативного стресу // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 4. - С. 97-102.

Дисертант здійснювала всі етапи моделювання умов голодування і оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані та брала участь у написанні рукопису статті.

2. Байляк М.М., Семчишин Г.М., Лущак В.І. Участь каталази та супероксиддисмутази у відповіді на дію пероксиду водню дріжджів Saccharomyces cerevisiae в експоненційній фазі росту // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 2. - С. 79-85.

Планування, експериментальна частина роботи, а також статична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом.

3. Байляк М.М., Семчишин Г.М., Лущак В.И. Влияние перекиси водорода на активность антиоксидантных ферментов Saccharomyces cerevisiae зависит от особенностей штаммов // Биохимия (Москва). - 2006. - Т. 71, № 9. - С. 1243-1252.

Дисертант запланувала роботу, здійснювала моделювання умов оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані та брала участь у написанні рукопису статті.

4. Bayliak М.М., Semchyshyn Н.M., Lushchak V.I. Possible accumulation of nonactive molecules of catalase and superoxide dismutase in S. cerevisiae cells under hydrogen peroxide induced stress // Central European Journal of Biology. - 2007. - Vol. 2, N 3. - P. 326-336.

Дисертант запланувала роботу, здійснювала моделювання умов оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані.

5. Байляк М.М. Вивчення ролі каталаз в стійкості Saccharomyces cerevisiae до пероксиду водню в умовах голодування // VIII Міжнародна науково-практична конференція „Наука і освіта ’2005”. - Дніпропетровськ, 2005. - С. 67-69.

6. Абрат О.Б., Байляк М.М. Відповідь Saccharomyces cerevisiae на дію пероксиду водню в умовах голодування // Тези доп. Першої Міжнарод. конф. студ. і аспір. „Молодь і поступ біології”. - Львів: СПОЛОМ. - 2005. - С. 3.

7. Байляк М.М., Абрат О.Б. Активність ферментів в експоненційних культур безкаталазного штаму Saccharomyces cerevisiae за дії Н2О2 // Тези доп. Першої Міжнарод. конф. студ. і аспір. „Молодь і поступ біології”. - Львів: СПОЛОМ. - 2005. - С. 3.

8. Байляк М.М. Роль каталази в адаптації Saccharomyces cerevisiae до пероксиду водню в середині експоненційної фази росту // Матеріали ІХ Укр. біохім. зїзду. - Т. 1. - Харків, 2006. - С. 98.

9. Bayliak М., Semchyshyn Н., Lushchak V. Possible accumulation of nonactive molecules of catalase and superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae under mild oxidative stress // 6th Parnas conf. - Krakow (Poland): Acta Biochim. Polon. - Vol. 54, N2. - 2007. - P. 31.