Розробка схеми виділення та скринінг мікробних продуцентів оксидаз аналітичного значення (алкогольоксидази та гліцеролоксидази). Створення на основі алкогольоксидази нових ферментативних і біосенсорних методів аналізу етанолу, метанолу, формальдегіду.
Серед них особливе місце займають метилотрофні дріжджі, які, завдяки наявності унікально сильного промотора алкогольоксидазного гена (PAOX1), стали вигідним організмом-господарем для гетерологічної експресії промислово важливих білків та ферментів, у тому числі й аналітичного призначення [Cregg et al., 1985, Cregg et al., 1993, Rosenfeld et al., 1999]. Метилотрофні дріжджі є джерелом алкогольоксидази (АО) (КФ 1.1.3.13) - ферменту, який завдяки здатності in vitro окислювати первинні аліфатичні спирти, включаючи етанол, має велике біотехнологічне значення. Серед нових біоаналітичних систем особливого розвитку набули дослідження в області біоелектронних систем аналізу. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт Інституту біології клітини НАН України (бюджетна тема “Біотехнологічне отримання та функціональна характеристика білків, важливих для діагностики та лікування“ (шифр 2.2.9.15) за комплексною програмою “Фізіолого-біохімічні та молекулярно-генетичні основи функціонування живих систем і розробка принципів керування ними”; бюджетна тема “Вивчення механізмів біоасиміляції перехідних металів у неконвенційних дріжджів і створення на їх основі нових біоаналітичних методів” (шифр: 2.2.9.14); проекти “Розробка біо-та хемосенсорів для моніторингу загальної токсичності та окремих токсичних речовин у навколишньому середовищі” (шифр: 2.2.1.7), “Конструювання ферментних елементів біосенсорів на основі оксидоредуктаз для контролю вмісту лактату і етанолу в біологічних рідинах та бродильних культурах”, “Розробка нових біосенсорних та ензиматичних систем аналізу гліцерину в алкогольних напоях та визначення тригліцеридів у біологічних рідинах” за комплексною програмою фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження в галузі сенсорних систем та технологій”). Результати, викладені в дисертації, отримано здобувачем самостійно (розроблено оптимальну схему виділення та очистки АО з клітин Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 CATX), яку отримано в препаративних кількостях у високоочищеному стані; розроблено нові ензиматичні підходи для аналізу етанолу, метанолу та формальдегіду з використанням АО H. polymorpha; проведено скринінг штамів цвільових грибів за гліцеролоксидазною активністю; розроблено схему виділення і очистки ГО з відібраного продуцента ферменту та проведено початкову структурну й ензимологічну характеристику ГО).У результаті комплексу експериментальних робіт проведено скринінг продуцентів гліцеролоксидази, виділено та охарактеризовано оксидази біоаналітичного значення: алкогольоксидазу з мутантного штаму метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha і гліцеролоксидазу із цвільового гриба Botrytis allii; створено нові ензиматичні та біосенсорні аналітичні підходи для аналізу вмісту деяких практично важливих аналітів у біологічних рідинах, бродильних культурах та харчових продуктах з використанням алкогольоксидази. Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках: Розроблено оптимальну схему виділення високоочищеного препарату алкогольоксидази (з питомою активністю понад 23 мкмоль·хв-1·мг-1) з клітин надпродуцента ферменту - мутанта термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha К-105 (gcr1 CATX). Проведено фізико-хімічну, структурну та ензимологічну характеристику виділеної алкогольоксидази: визначено ізоелектричну точку (РІ=6,2); отримано спектри поглинання та спектри кругового дихроїзму; розраховано вміст окремих структурних мотивів вторинної структури білка; визначено кінетичні параметри ферменту відносно основних субстратів. Розроблено протоколи алкогольоксидазно-пероксидазного методу аналізу, адаптовані для визначення вмісту аналітів у реальних зразках: етанолу (для алкогольних напоїв, виноматеріалів та бродильних культур) і формальдегіду (для харчових продуктів). На основі алкогольоксидази метилотрофних дріжджів та пероксидази сконструйовано біензимний амперометричний біосенсор для кількісного визначення етанолу, який, завдяки використанню оригінальної схеми електроосадження ферментів і опосередкування електронного переносу через осмій-вмісний редокс-полімер, має високу операційну стабільність (понад 1000 аналізів) та високу чутливість (до 0,2 МКА/ММ).
План
Основний зміст роботи
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
