Окраска по Граму - Реферат

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные ), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных ).Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются.Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки.Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %).Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют). Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода 2 части йодида калия 100 частей дистиллированной воды.На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин). Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек). Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).Мазок высушивают на воздухе без нагревания. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b (2-3 мин). Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более). Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более). Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин). Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка) · Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором · Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие · Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску Культура выращена в неблагоприятных условиях · При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой · Культивируйте микроорганизм на полноценной среде Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации) · Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении · Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной "густотой" мазка · Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади · При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду Мазок плохо обесцвечен · Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием · Повторить приготовление препарата и его окраску · Дообесцветить имеющийся мазок · Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора.

Содержание

Введение

1. Техника проведения окраски

1.1 Подготовка материала для окраски

1.2 Фиксация

1.2.1 Физический способ фиксации

1.2.2 Химический способ фиксации

1.3 Процесс окрашивания мазков

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

2.1 Модификация Hucker

2.2 Модификация Burke

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

2.4 Модификация Preston-Morrell

3. Ошибки