Індуктивно-резонансний перенос енергії в мембранних системах - Автореферат

Особливо багато переваг цей метод дає при дослідженні молекулярної організації мембран та різноманітних мембранних процесів, зокрема білок-ліпідних взаємодій. Надійна кількісна інтерпретація даних, отриманих методом переносу енергії, зумовлюється, насамперед, наявністю ґрунтовних теоретичних моделей цього явища у відповідних системах, які мають коректно описувати можливі просторові конфігурації донорів і акцепторів, їх взаємну орієнтацію, особливості розподілу хромофорів у системі, а також базуватися на адекватних процедурах усереднення параметрів. Дослідження молекулярних механізмів взаємодії між гемоглобіном та мембранами є безумовно актуальним як у фундаментальному аспекті, так і з точки зору створення замінників крові на основі штучних структур, що містять гемоглобін, - так званих гемосом. Вперше побудовано моделі ІРПЕ для випадку обємного розподілу донорів всередині мембрани та, на основі даних моделювання, продемонстрована можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані. Проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання структурного параметра, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються; вперше показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії.Наведено ключові положення квантово-механічної теорії Фьорстера, яка дозволяє повязати швидкість переносу енергії із спектроскопічними характеристиками донора і акцептора, а саме: мірою перекривання спектра флуоресценції донора зі спектром поглинання акцептора, квантовим виходом донора і взаємною орієнтацією моментів переходу донора і акцептора. У рамках цього підходу розглядається збуджена молекула донора, від якої енергія може передаватися на декілька найближчих до неї молекул акцепторів; при цьому вважається, що донори і акцептори випадково розподілені в одній площині. Для цього були отримані вирази для радіальної функції розподілу акцепторів навколо донора (тобто імовірності знаходження акцептора на відстані від донора) у різних геометріях, що можуть мати місце при дослідженні переносу енергії в модельних ліпідних і білково-ліпідних мембранах. Наприклад, у випадку, коли донори є гідрофобними зондами, а акцептори мають амфіфільну природу, перенос енергії відбувається від донорів, що розподілені в обємі гідрофобної ділянки бішару, на акцептори, що локалізуються на межі гідрофобної і гідрофільної ділянок. Чисельний аналіз отриманих моделей демонструє можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані на основі залежності відносного квантового виходу донора від поверхневої концентрації акцептора.Вперше методом індуктивно-резонансного переносу енергії охарактеризовано структурні особливості комплексів цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідами. Розроблено універсальну систему моделей індуктивно-резонансного переносу енергії для опису різних випадків розподілу донорних і акцепторних хромофорів у мембранних системах; зокрема, вперше побудовано моделі ІРПЕ для випадку обємного розподілу донорів всередині мембрани та на основі даних моделювання продемонстрована можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані. Проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання локалізації хромофорів у ліпідному бішарі, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються; вперше показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими, ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії. На основі розгляду особливостей ІРПЕ у мембранах, зокрема, орієнтаційних ефектів, запропоновано ряд рекомендацій щодо підбору оптимальних донорно-акцепторних пар, які забезпечуватимуть отримання найбільш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях мембранних систем. З використанням чисельного моделювання та аналізу взаємної кореляції параметрів показано, що така методологія отримання та аналізу даних дозволяє оцінювати одночасно як параметри звязування акцептора з мембраною, так і відстань від площини акцепторів до центра бішару.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі наведене нове вирішення важливої задачі біофізики мембран - встановлення молекулярної організації білок-ліпідних комплексів. Вперше методом індуктивно-резонансного переносу енергії охарактеризовано структурні особливості комплексів цитохрому с і гемоглобіну з фосфоліпідами. Запропоновані в роботі моделі та методичні підходи дозволять отримати нову кількісну інформацію про структуру як модельних, так і природних мембран.

1. Розроблено універсальну систему моделей індуктивно-резонансного переносу енергії для опису різних випадків розподілу донорних і акцепторних хромофорів у мембранних системах; зокрема, вперше побудовано моделі ІРПЕ для випадку обємного розподілу донорів всередині мембрани та на основі даних моделювання продемонстрована можливість визначення вимірності розподілу донорів та/або акцепторів у мембрані.

2. Проведено математичне моделювання переносу енергії при різноманітних можливих варіантах орієнтаційних розподілів донорів і акцепторів; отримані помилки оцінювання локалізації хромофорів у ліпідному бішарі, що мають місце, коли орієнтаційні ефекти в мембрані не враховуються; вперше показано, що ефекти невизначеності орієнтаційної поведінки хромофорів у мембрані є значно слабкішими, ніж у випадку внутрішньомолекулярного переносу енергії.

3. На основі розгляду особливостей ІРПЕ у мембранах, зокрема, орієнтаційних ефектів, запропоновано ряд рекомендацій щодо підбору оптимальних донорно-акцепторних пар, які забезпечуватимуть отримання найбільш точної і надійної структурної інформації у флуоресцентних дослідженнях мембранних систем.

4. Запропонована методологія та комплекс компютерних програм для обробки багатовимірних масивів даних ІРПЕ в мембранах. З використанням чисельного моделювання та аналізу взаємної кореляції параметрів показано, що така методологія отримання та аналізу даних дозволяє оцінювати одночасно як параметри звязування акцептора з мембраною, так і відстань від площини акцепторів до центра бішару. Таким чином, можна отримувати оцінки цих параметрів з високою точністю і статистичною достовірністю, використовуючи лише дані стаціонарної флуоресцентної спектроскопії.

5. За допомогою методу ІРПЕ визначено положення гемової групи цитохрому с відносно центра ліпідного бішару, а також параметри звязування білку з ліпідами в рамках різних формалізмів адсорбції.

6. Проаналізовано залежність ефективності взаємодії цитохрому с з модельними мембранами та структури білок-ліпідних комплексів від вмісту аніонного ліпіду кардіоліпіну, а також від іонної сили середовища. Вперше методом флуоресцентної спектроскопії виявлено занурення цитохрому с вглиб зарядженого бішару при підвищенні поверхневої концентрації білку за умов низької іонної сили.

7. Проведено кількісний аналіз комплексоутворення гемоглобіну з фосфоліпідними мембранами. Вперше методом ІРПЕ отримані докази на користь існування двох типів комплексів гемоглобіну з ліпідним бішаром. Проведена оцінка ефективних рівноважних і кінетичних параметрів комплексоутворення.

1. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Resonance energy transfer in membrane systems. I. Bulk donor distribution // Вісник ХДУ №528, Біофізичний вісник.- 2001, № 9(2), С.71-75.

2. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Energy transfer method in membrane studies: some theoretical and practical aspects // J. Biochem. Biophys. Methods.- 2002.- Vol.52, No.1.- P.45-58.

3. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Resonance energy transfer in membrane systems. II. Effect of surface curvature // Вісник ХДУ №560, Біофізичний вісник.- 2002, № 10(1), С.50-53.

4. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Analysis of resonance energy transfer in model membranes: role of orientational effects // Biophys. Chemistry.- 2002.- Vol.99, No.2.- P.143-154.

5. Gamolina O.V., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Fluorescence quenching study of ribonuclease A complexes with model phospholipid membranes // Вісник ХДУ №560, Біофізичний вісник.- 2002, № 10(1), С.124-126.

6. Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Cytochrome c location in phosphatidylcholine/ cardiolipin model membranes: resonance energy transfer study // Biophys. Chemistry.- 2003.- Vol.103, No.3.- P.239-249.

7. Domanov Ye.A. Resonance energy transfer in membrane systems. III. Planar acceptor distribution in two monolayers // Вісник ХДУ №593, Біофізичний вісник.- 2003, № 12(1), С.86-88.

8. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Gamolina O.V. Fluorescence quenching in protein-lipid systems: contribution of diffusion-controlled factors // Вісник ХДУ №593, Біофізичний вісник.- 2003, № 12(1), С. 117-119.

9. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Molotkovsky, J.G. Global analysis of steady-state energy transfer measurements in membranes: resolution of structural and binding parameters // J. Fluoresc.- 2004.- Vol.14, No.1.- P.49-55.

10. Доманов Е.А., Горбенко Г.П., Дюбко Т.С. Влияние криопротекторов и низких температур на структурное состояние модельных фосфолипидных мембран // Проблемы криобиологии.- 2001.- № 3.- С.26-27.

11. Горбенко Г.П., Доманов Е.А. Термодинамические аспекты образования белок-липидных комплексов // Труды XIV Междунар. конф. по химической термодинамике.- Санкт-Петербург.- 2002.- с.219.

12. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Methemoglobin effect on structural state of model membranes // Тези доп. VIII Зїзду Українського біохімічного товариства.- Чернівці.- 2002.- С.27.

13. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Cytochrome c disposition in lipid model membranes as revealed by resonance energy transfer // Тези доп. III Зїзду Українського біофізичного товариства.- Львів.- 2002.- С.45.

14. Доманов Е.А., Горбенко Г.П. Индуктивно-резонансный перенос энергии в модельных белок-липидных системах // Труды Междунар. конф. “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биологических систем”.- Минск.- 2002.- С.67.

15. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Gamolina O.V. Dynamic fluorescence quenching in model membranes: role of diffusion-controlled effects // Тези доп. Другої харківської конф. молодих вчених і науковців “Радіофізика та НВЧ електроніка”.- Харків.- 2002.- С.12.

16. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P., Global analysis of steady-state energy transfer measurements in membranes: resolution of structural and binding parameters // Proc. of the 8th Conference on Methods and Applications of Fluorescence: Spectroscopy, Imaging and Probes.- Prague.- 2003.- P.82.

17. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Contribution of orientational effects to the efficiency of nonradiative energy transfer in membrane systems, Праці XVI Міжнародної школи-семінару “Спектроскопія молекул і кристалів”.- Севастополь.- 2003.- С.290.

18. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. FRET reveals concentration-dependent changes of cytochrome c location in phospholipid membranes al low ionic strength Proc. of the 5th International Conference on Biological Physics.- Gцteborg.- 2004.- P.113.

19. Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Resonance energy transfer and light scattering studies of glucose oxidase interaction with liposomes // Тези доп. Першої української наукової конференції “Проблеми Біологічної і медичної фізики”.- Харків.- 2004.- С.115.