Індукований морфогенез і клональне мікророзмноження перспективних сортів м"яти - Автореферат

За останні десятиріччя в Україні створено високоолійні сорти мяти (Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька карвонна, Удайська, Удайчанка, Імла та ін.), що відзначаються високим вмістом ефірної олії, підвищеною врожайністю сухого листя, зимостійкістю і посухостійкістю, стійкістю до іржі, із різним напрямком біосинтезу ефірної олії сортів (Бугаенко, 1985; Шило, 1987; Бугаенко и др., 1999). Дослідження проводилися у відділі селекції і насінництва Інституту ефіроолійних і лікарських рослин Української Академії аграрних наук відповідно до програм за темами: "Розробити методи клонального мікророзмноження для одержання посадкового матеріалу перспективних ефіроолійних і лікарських рослин" (№ державної реєстрації 01.94U023836); "Створити новий вихідний матеріал для селекції ефіроолійних і лікарських рослин на основі методів клітинної інженерії" (№ державної реєстрації 01.94U023827); "Розробити методи розмноження з використанням культури меристем in vitro для одержання посадкового матеріалу лаванди і мяти" (№ державної реєстрації 01.94U023845). Мета досліджень - розробити біотехнологічні прийоми та біотехнологічну схему клонального мікророзмноження перспективних сортів мяти вітчизняної селекції. розробити біотехнологічну схему клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових та стеблових експлантів in vitro; Вперше для ряду нових перспективних і раніше створених сортів мяти вітчизняної селекції (Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька 6) виявлено особливості морфогенетичних реакцій в культурі вегетативних органів in vitro і розроблено біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів.Модифіковані живильні середовища: Мурасіге-Скуга - 75 діб; Шенка-Хільдебрандта - 45 діб; Гамборга-Евелега - 40 діб Наші дослідження показали перевагу використання рідких живильних середовищ для регенерації рослин і клонального мікророзмноження в культурі листкових експлантів всіх виучуваних сортів мяти. В результаті одного циклу вирощування (30 діб) на рідкому живильному середовищі з одного листового експланта мяти сортів Сімферопольська 200 і Заграва розвивалося 27-31 рослина-регенерант, а сортів Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 - 22-23. Культивування листкових експлантів як на рідкому, так і на агаризованому живильних середовищах понад 30 діб не приводило до додаткового утворення мікропагонів і не сприяло збільшенню коефіцієнта розмноження при ростових процесах, що продовжувалися. У обох випадках за один цикл вирощування (30 діб) з одного експланта розвивалося 11-14 рослин-регенерантів залежно від сорту, а культивування понад 30 діб не приводило до збільшення коефіцієнта розмноження.На основі розроблених біотехнологічних прийомів було проведено клональне мікророзмноження перспективного селекційного зразка 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia) для включення в селекційні програми по створенню нових сортів мяти. З метою індукції калюсоутворення в культурі листкових і стеблових експлантів мяти використовували модифіковані живильні середовища Мурасіге-Скуга, доповнені 2,4-Д, кінетином і БАП. Для більшості виучуваних сортів, максимальна частота (90-100%) й інтенсивність калюсоутворення спостерігалися на модифікованому живильному середовищі, що містить 0,5 мг/л кінетину, 0,5 мг/л БАП і 2,0 мг/л 2,4-Д. Дослідження показали, що частота калюсоутворення в культурі листкових експлантів залишалася достатньо високою протягом всього року і не опускалася нижче 70-80% залежно від сорту. Із збільшенням пасажу ця гетерогенність прогресувала і в калюсних культурах III-пасажу межа варіювання клітин за вмістом ДНК в інтерфазних ядрах складала 2С-13С.Вперше розроблено біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження мяти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 на основі культури ізольованих меристем, а також листкових і стеблових експлантів in vitro. Краща здатність до морфогенезу і регенерації у всіх сортів спостерігалася при введенні експлантів в культуру in vitro протягом березня-червня. На модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, Шенка-Хільдебрандта і Гамборга-Евелега, доповнених кінетином, БАП, ІОК і 2,4-Д, при культивуванні ізольованих меристем виявлено множинне пагоноутворення і ризогенез (коефіцієнт розмноження 1:4,9-1:6,9) протягом одного циклу вирощування культур, що виключає проведення власне мікророзмноження і вкорінення мікропагонів як спеціальних етапів, повязаних з субкультивуванням. На модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга цикл вирощування культур складає 75 діб, а на модифікованому живильному середовищі Гамборга-Евелега - 40 діб. Клональне мікророзмноження мяти на основі культури листкових і стеблових експлантів in vitro забезпечує вищий коефіцієнт розмноження (1:11-1:31), ніж на основі культури ізольованих меристем.

2. Основний зміст роботиЗміст етапу Умови реалізації етапуЗміст етапу Умови реалізації етапу

Вперше розроблено біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження мяти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 на основі культури ізольованих меристем, а також листкових і стеблових експлантів in vitro.

Виявлено високий морфогенетичний потенціал експлантів ізольованих меристем мяти з 2-3 парами листкових примордіїв (1,27-1,64 мм). При введенні таких експлантів в культуру in vitro 83,9% - 98,9% з них здатні до морфогенезу і регенерації рослин.

Показано залежність морфогенезу і регенерації рослин в культурі ізольованих меристем від часу відбору матеріалу (сезонність). Краща здатність до морфогенезу і регенерації у всіх сортів спостерігалася при введенні експлантів в культуру in vitro протягом березня-червня.

На модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, Шенка-Хільдебрандта і Гамборга-Евелега, доповнених кінетином, БАП, ІОК і 2,4-Д, при культивуванні ізольованих меристем виявлено множинне пагоноутворення і ризогенез (коефіцієнт розмноження 1:4,9-1:6,9) протягом одного циклу вирощування культур, що виключає проведення власне мікророзмноження і вкорінення мікропагонів як спеціальних етапів, повязаних з субкультивуванням.

Встановлено вплив складу живильних середовищ на інтенсивність пагоно- і коренеутворення при клональному мікророзмноженні в культурі ізольованих меристем. На модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга цикл вирощування культур складає 75 діб, а на модифікованому живильному середовищі Гамборга-Евелега - 40 діб.

Розроблено спосіб клонального мікророзмноження мяти на основі живцювання меристемних мікропагонів in vitro, що забезпечує коефіцієнт розмноження 1:4,6-1:6,1.

Виявлено різну морфогенетичну реакцію листкових і стеблових експлантів в ході культивування на модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга. Встановлено, що при клональному мікророзмноженні в культурі листкових експлантів спостерігається прямий органогенез і регенерація рослин безпосередньо з тканин листка. У культурі стеблових експлантів виявлено непрямий органогенез, при цьому регенерація рослин відбувається з клітин первинного калюсу протягом одного циклу вирощування.

Клональне мікророзмноження мяти на основі культури листкових і стеблових експлантів in vitro забезпечує вищий коефіцієнт розмноження (1:11-1:31), ніж на основі культури ізольованих меристем.

Оптимізовано умови одержання калюсних культур з листкових і стеблових експлантів. Виявлено морфологічні і цитологічні особливості калюсних культур і вперше показано високий рівень гетерогенності калюсних клітин мяти за морфологією і вмістом ДНК в інтерфазних ядрах. Встановлено, що із збільшенням пасажу рівень морфологічної гетерогенності за клітинним складом знижується, а рівень гетерогенності за змістом ДНК зростає.

Розроблено біотехнологічну схему клонального мікророзмноження перспективних вітчизняних сортів мяти, що дає змогу одержувати необхідну кількість рослин при різних способах регенерації.

Практичні рекомендації

Для інтенсивного розмноження мяти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька 6, Прилуцька карвонна, Удайчанка і селекційних зразків 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia), K 59(4n) (M. canadensis), 94.18.8 (M. citrata x M. longifolia), 92.9.35 ( M. citrata K 66 (4n) х M. aquatica K6) рекомендується використовувати біотехнологічні прийоми, засновані на культивуванні in vitro ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів.

Розроблену біотехнологічну схему клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів in vitro рекомендується використовувати як найважливішу складову при створенні промислової біотехнології одержання високоякісного посадкового матеріалу мяти і як ефективний допоміжний прийом для розмноження унікальних зразків в селекційних програмах зі створення нових сортів.

Матеріали, викладені в дисертаційній роботі, можуть використовуватися у вузах при розробці навчальних курсів, спецкурсів і проведенні лабораторно-практичних занять з біотехнології рослин.

1. Бугара И.А., Бугара А.М. Некоторые особенности клонального микроразмножения мяты на основе культуры изолированных меристем in vitro // Бюл. Никит. бот. сада. - 2002. - Т. 86. - С. 49-53.

2. Бугара И.А., Бугара А.М. Клональное микроразмножение мяты в культуре листовых сегментов in vitro // Вісник Харківського Національного Аграрного Університету. - 2002. - 1, № 9. - С. 60-64.

3. Бугара И.А., Бугара А.М. Культура изолированных тканей мяты in vitro: возможности для размножения сортов и сохранения биологического разнообразия // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 12. -2002.- С. 194-199.

4. Бугара И.А., Бугаенко Л.А. Клональне мікроразмноження деяких сортів мяти на основі культури ізольованих меристем in vitro // Вісник аграрної науки. - 2002. - 1. - С. 53-55.

5. Бугара И.А., Бугара А.М. Использование методов биотехнологии для размножения растений и сохранения генофонда // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 13. - 2003. - С. 14-20.

6. Бугара И.А., Бугаенко Л.А., Бугара А.М. Клональное микроразмножение мяты в культуре стеблевых сегментов in vitro // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 14. - 2004. - С. 97-103.

7. Бугара И.А., Бугаенко Л.А. Морфогенез и клональное микроразмножение мяты in vitro // Труди Міжнар. наук. конф. "Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів" - Харків. - 1999. - С. 17-19.

8. Бугара И.А. Экспериментальный морфогенез изолированных меристем мяты in vitro // Труди I республ. Конф. молодых учен. Крыма "Актуальные вопросы современной биологии". - Симферополь. - 2000. - С. 39.

9. Пилунская О.А., Бугара И.А. Некоторые особенности морфогенеза изолированных меристем розы эфиромасличной и мяты in vitro // Труди 12 Міждунар. наук. конфер. "Вивчення онтогенезу рослин природних і культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії". - Полтава. - 2000. - С. 240.

10. Бугара И.А. Микроклональное размножение мяты in vitro // Труды VIII Междунар. конф по садоводству "Современные научные исследования в садоводстве". - Ялта. - 2000. - С. 15-19.

11. Бугаенко Л.А., Бугара И.А., Лисоматко Е.В. Способы размножения мяты и перспективы улучшения качества посадочного материала // Труды КГАУ. - 2000. - № 66. - С. 150-154.

12. Бугара И.А. Микроклональное размножение мяты in vitro методом индукции прямого морфогенеза // Труды Междунар. конф. молодых учен. "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции". - Харьков. - 2001. - С. 7.

13. Бугара И.А. Клональное микроразмножение некоторых сортов мяты на основе адвентивного побегообразования в культуре листовых сегментов in vitro // Труды КГАУ. - 2002. - № 72. - С. 14-17.

14. Бугара И.А. Использование метода in vitro для микроклонального размножения мяты // Третья Междунар. конф "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений". - Ереван. - 1999. - С. 64.

15. Bugara I.A. Clonal micropropagation of mint in vitro // Int. simp. "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources". - Yalta. - 2002. - P. 28.

16. Бугара И.А. Получение каллусных тканей мяты и их цитологическая характеристика // Труды Всеукр. конфер. молодых ученых "Актуальные вопросы современного естествознания". - Симферополь. - 2003. - С. 18.

Размещено на .ru