Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека - Дипломная работа

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Протеогликаны 1.2 Отличие протеогликанов от гликопротеинов 1.3 Классификация протеогликанов 1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов 1.5 Присоединение цепей ГАГ к коровому белку 1.6 Гиалуроновая кислота 1.7 Хондроитинсульфат протеогликаны 1.8 Дерматансульфат протеогликаны 1.9 Гепарансульфат протеогликаны и гепарин 1.10 Кератансульфат протеогликаны 1.11 Биосинтез протеогликанов 1.12 Обмен протеогликанов 1.13 Локализация и функции протеогликанов 1.14 Состав протеогликанов в трансформированных клетках 1.14.1 Декорин 1.14.2 D-глюкуронил С5-эпимераза Глава 2. Материалы и методы 2.1 Материалы 2.1.1 Операционный материал 2.1.2 Антитела 2.2 Методы 2.2.1 Выделение протеогликанов 2.2.2 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот 2.2.3 Идентификация протеогликанов 2.2.4 Аналитические методы 2.2.5 Вестерн-блот 2.2.6 Электрофорез Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1 Выделение протеогликанов 3.2 Отработка условий проведения электрофореза протеогликанов в агарозном геле 3.3 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот 3.3.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью 3.3.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами 3.4 Сравнение состава протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека 3.5 Количественная оценка протеогликанов 3.6 Идентификация фракций протеогликанов 3.6.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами 3.6.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой 3.7 Определение экспрессии декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека 3.8 Определение экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека Заключение Список литературы Список сокращений АТ - антитела ВКМ - внеклеточный матрикс ГАГ - гликозаминогликаны ГС - гепарансульфат Ге - гепарин ГК - гиалуроновая кислота ДС - дерматансульфат КС - кератансульфат НК - нуклеиновые кислоты ПААГ - полиакриламидный гель ПГ - протеогликаны ПЦР - полимеразная цепная реакция ХС - хондроитинсульфат Эпимераза - D-глюкуронил С5-эпимераза Ac - ацетил Gal - галактоза GalN - галактозамин GlcN - глюкозамин GlcUA - глюкуроновая кислота IdoUA - идуроновая кислота Fuc - фукоза Man - манноза SA - сиаловая кислота Xyl - ксилоза Введение Проблема регуляции клеточной пролиферации является одной из ключевых проблем биологии. В опухолевых тканях, наряду с общим увеличением количества протеогликанов, снижается содержание дерматансульфат протеогликанов, характерных для покоящихся клеток, и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов, характерных для эмбриональных и активно пролиферирующих тканей. Однако вопрос о причинах уменьшения содержания декорина в опухолевых клетках до сих пор не поднимался. Гликозаминогликаны являются регулярными (повторяющиеся дисахаридные единицы), неразветвленными, высокозаряженными полимерами. Олиго - или полисахаридные цепи в гликопротеинах присоединяются к полипептидным цепям через кислород остатков серина или (чаще) азот остатков аспарагина (О - или N-гликозилирование). Если к гликопротеину присоединена хотя бы одна цепь ГАГ, он является протеогликаном. 1.3 Классификация протеогликанов Классифицируют протеогликаны по типу доминантных цепей ГАГ, присоедненных к коровому белку. 1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахариды, составленные из повторяющихся дисахаридных единиц, каждая из которых состоит из гексозамина (D-глюкозамина - GlcN или D-галактозамина - GalN), соединенного с гексуроновой кислотой (D-глюкуроновой - GlcUA, или L-идуроновой - IdоUA), присутствующей во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (Gal). Дисахаридные единицы могут быть N - и O-сульфатированы и/или ацетилированы. Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3-4 сульфатных групп на дисахарид. Дипептид Ser-Gly в последовательности акцепторного сайта белка является основным требованием для узнавания ферментом ксилозилтрансферазой, переносящим остаток ксилозы на серин [2]. Рис.3. Такого типа взаимодействия связывают ГК с протеогликанами, стабилизируя структуру внеклеточного матрикса, и с клеточными поверхностями, изменяя поведение клеток [3]. Примеры хондроитинсульфат протеогликанов Протеогликан Коровый белок, кДа Количество цепей Ткань Аггрекан 208-220 ~100 cекретируемый, хрящ Версикан 265 12-15 cекретируемый, фибробласты Нейрокан 145 1-2 cекретируемый, мозг Бревикан 96 0-4 cекретируемый, мозг Декорин 36 1 cекретируемый, клетки соединительной ткани Бигликан 38 1-2 cекретируемый, клетки соединительной ткани Бамакан 138 1-3 базальные мембраны ?2 (IX) коллаген 68 1 хрящ, стекловидное тело Тромбомодулин 58 1 эндотелиальная мембрана CD44 37 1-4 лимфоциты, мембранный NG2 251 2-3 нейральные клетки, мембранный Инвариантная цепь 31 1 антиген-презентирующие клетки Серглицин 10-19 10-15 миелоидные клетки, гранулы 1.8 Дерматансульфат протеогликан