Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования - Диссертация

С каждым годом потребность в каротиноидах возрастает, что требует расширения потенциальных источников их получения. В связи с тем, что дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, а также обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное количество биомассы и расти на относительно дешевых средах, эта группа эукариотных микроорганизмов может занять прочные позиции в современной биотехнологии, в том числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов (BEN-AMOTZ, 1999; SANDMAN, 2001). Цель исследований: изучить особенности каротиногенеза у дрожжей под влиянием различных факторов, разработать способы направленного синтеза каротиноидов и биотехнологии получения новых препаратов на базе дрожжевых каротиноидов. ? Исследовать особенности процесса биосинтеза каротиноидов дрожжами под влиянием нетрадиционных источников питания, предшественников, индукторов и координационных соединений некоторых переходных металлов. Выявлены особенности синтеза каротиноидных пигментов дрожжами рода Rhodotorula, культивируемых на питательных средах с нетрадиционными источниками питания: экстрактом виноградного, яблочного и томатного шротов, предшественниками (подсолнечное, оливковое, кукурузное, соевое масла и ретинол), индукторами (ацетат натрия, ацетат цинка и лимонная кислота) и координационными соединениями некоторых переходных металлов ([Fe2NIO(CCL3COO)6(CH3OH)3] и [Fe2Mn(CCL3COO)6(CH3OH)3]).Среди микроорганизмов, способностью синтезировать каротиноиды, желтые, оранжевые или красные пигменты (циклические или ациклические изопреноиды) обладают бактерии, грибы, водоросли и дрожжи (YOKOYAMA, 1985; CERDO-OLDO, 1989; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998). Среди бактерий, образующих широкий круг каротиноидов, особый интерес представляет штамм Agrobacterium auranticum, который является продуцентом таких пигментов как астаксантин, ?-каротин, эхиненон, бета-криптоксантин, 3-оксиэхиненон, кантаксантин, 3’-оксиэхиненон, зеаксантин, адонирубин, адониксантин (YOKOYAMA, 1995). Среди пигментных дрожжей, как источников каротиноидных пигментов, следует отметить штамм Rhodotorula glutinis ВКПМ V-2210, который на питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных условиях образует биомассу, содержащую 1450-1500 мкг/г каротиноидов (Патент RU 2103351, 27.01.98; www.SIBPATENT.ru). Исследователи Атаманюк Д.И., Борисова Т.А. и Цыгуля Т.Е. отмечают перспективу использования штамма Rhodotorula gracilis в качестве белково-витаминной добавки для нужд животноводства, способного синтезировать до 725 мкг/г сухой биомассы каротиноидных пигментов, качественный состав которых представлен, в основном, ?-каротином (43%), торулином (35%) и торулародином (22 %) (АТАМАНЮК и др., 1981). Природные каротиноиды по строению углеродной цепочки разделяются на 3 подгруппы: 1) ациклические структуры, куда относится ликопин; 2) моноциклические структуры, примером которых может служить ? - каротин, имеющий только одно замкнутое кольцо; 3) бициклические структуры - имеют 2 замкнутых кольца, к их числу относятся ?-и ?-каротин.Большое разнообразие каротиноидов в растительном, животном и микробном мире и то, что на протяжении всей эволюции растения производят, а животные и человек поглощают каротиноиды, содержащиеся в продуктах их ежедневного рациона, модифицируют и аккумулируют их специфическим образом, неизбежно возникает вопрос об их функциональном назначении (NEAMTU, 1986; КАРНАУХОВ, 1993; CANIZARES - Для растений фундаментальное значение имеет функция каротиноидов, связанная с процессом фотосинтеза, который стал основой всей жизни на земле, когда геохимические источники энергии на нашей планете были исчерпаны (после глобального энергетического кризиса, произошедшего на нашей планете около 5 миллиардов лет назад). В процессе фотосинтеза производится кислород, образующий кислородную атмосферу, в которой большинство органических молекул могли быстро разрушаться, если бы не были защищены от подобных побочных эффектов этого процесса (также как и от других неблагоприятных факторов). Животные и человек не способны синтезировать витамин А, который является незаменимым для зрения, роста, репродукции для защиты от различных бактериальных и грибковых заболеваний и нормального функционирования кожи и слизистых. Витамин А не образуется в растительных тканях и может быть получен только путем преобразования провитамин-А активных каротиноидов (прежде всего, ?-каротина, а также ?-каротина, криптоксантина, 3,4-дигидро-?-каротина, астаксантина, кантаксантина и др.) (БУКИН, 1991; ГОМБОЕВА и др., 1998).Исследования были проведены в течение 2001 - 2005 гг. в лабораторииПредметом исследований служили 14 штаммов дрожжей рода Rhodotorula и Sporobolomyces из рабочей коллекции лаборатории «Микробные продукты» и Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов: Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01, Rhodotorula rubra CNMN-YS-09, Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10 и штаммы

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………….….4

1. КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ - БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ

И ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ…………………………...…8

1.1. Микроорганизмы - потенциальные источники каротиноидных пигментов….….…..8

1.2. Химическое строение и биосинтез каротиноидных пигментов …………………..…11

1.3. Биологические функции и область применения каротиноидов…………………..….18

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ……………….……………….……….……..25

2.1. Предмет исследований ……………………………………………………………....…25

2.2. Питательные среды для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей.…..…25

2.3. Биостимуляторы, индукторы и координационные соединения металлов ……..……26

2.4. Аппаратура и оборудование……………………………………………………….….…26

2.5. Реактивы……………………………………………………………………………..……26

2.6. Методы исследований……………………………………………………..………..….…27

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ

СПОСОБНОСТЬЮ К БИОСИНТЕЗУ КАРОТИНОИДНЫХ ПИГМЕНТОВ .…………………………………………………………….…30

3.1. Продуктивность и содержание общего количества каротиноидов в биомассе дрожжей рода Rhodotorula………………………………………………….…..…....….31

3.2. Качественный состав каротиноидных пигментов дрожжей рода Rhodotorula………………………………………………………………..……..….34

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ НЕТРАДИЦИОННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПИТАНИЯ, ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ИНДУКТОРОВ И МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У ДРОЖЖЕЙ ………………….….….40 .

4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN - YS-03….……..42

3

4.2. Влияние предшественников на продуктивность и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN - YS-03………………………………………..46

4.3. Влияние индукторов на продуктивность и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03…………………………………...….…51

4.4. Влияние координационных соединений Fe (II) на биосинтез каротиноидов дрожжами рода Rhodotorula……………………………………………………….…….57

4.5. Способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей………………….…...…..64

ГЛАВА 5. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЦИНКА………………………………....77

.

5.1. Продуктивность и биосинтез каротиноидных пигментов дрожжами, культивируемыми в присутствии различных соединений цинка………………….…78

5.2.Оптимизация среды и разработка способа получения цинксодержащей биомассы..85

ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИХ ДРОЖЕЙ РОДА RHODOTORULA….93

6.1. Технология получения препарата из пигментных дрожжей для стимулирования жизнеспособности икры и личинок рыб……………...………..….…93

6.2. Технология получения цинксодержащей биомассы пигментных дрожжей, предназначенной для стартовых кормов личинок рыб………………..…101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………….….…..106