Інактивація простих та складних модельних вірусів у плазмі донорської крові (експериментальні дослідження) - Автореферат

Для проведення вірусінактивації плазми та її препаратів використовують наступні методи: теплову обробку (Bridonneau P. et al., 1996; Зубкова Н.В. и соавт., 2002; Ажигирова М.А. и соавт., 2004), хімічні та фізичні методи (Klein H.G. et al., 1998; Аграненко В.А. и соавт., 2002; Solheim B.G. et al., 2003; Суханов Ю.С. и соавт., 2003), поєднання фізичних і хімічних способів (Lin L. et al., 1997; van Rhenen D. et al., 2000; Corash L., 2001). Сольвент-детергентний метод, який широко застосовується за кордоном для знезараження плазми, на жаль, є неефективним по відношенню до простих вірусів (наприклад, гепатиту А й парвовірусу В19) і не дає гарантії повної безпеки плазми крові та її препаратів, які були знезаражені цим методом (Baudoux E. et al., 1998; Тимченко А.С. і співавт., 2001, Nifong T.P. et al., 2002). Враховуючи вищезазначене, проблема пошуку умов і режимів, які необхідні для інактивації простих і складних вірусів у плазмі донорської крові, залишається актуальною, що й зумовило вибір теми дисертаційної роботи. Дисертаційна робота безпосередньо повязана з виконанням загальнодержавної „Програми розвитку донорства крові та її компонентів на 2002-2007 рр.” і виконувалась у рамках науково-дослідної роботи Інституту гематології та трансфузіології АМН України „Дослідження вірусінактивуючої дії ультрафіолетового опромінення і фотосенсибілізації на РНК-та ДНК-вмісні віруси в плазмі крові” (шифр АМН.Ф.03.01, № держреєстрації 0103U000682). Вивчити механізми фотодинамічної вірусінактивуючої дії ультрафіолетового опромінення та фотосенсибілізатора метиленового синього для визначення оптимальних умов їх комбінованого застосування з метою інактивації простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові.Для проведення фотосенсибілізації донорської плазми був застосований реактив МС (С16Н18CLN3S Ч 3H2O) виробництва фірми “Merck” (Німеччина) з молекулярною масою 374, із якого для досліджень готували 0,1, 0,4 і 1,0 % розчини, а також молярні - у концентраціях від 1 ? 10-1 до 1 ? 10-6 моль/л. За результатами спектрально-люмінесцентних досліджень розраховували коефіцієнт молярної екстинкції та товщину поглинаючого шару донорської плазми (її було враховано при розробці приладу для УФ-опромінення донорської плазми) за законом Бугера-Ламберта-Бера: Д = lg (I0/ I) = е Ч с Ч l (1) де Д - оптична густина зразка; Результати аналізу вважали достовірними при р <0,05. плазма кров донор фотосенсибілізатор На першому етапі, для уточнення механізмів фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми УФ-опроміненням, були вивчені спектри поглинання, спектри флуоресценції й збудження флуоресценції молекул білків плазми крові, а також фотосенсибілізатора МС. Крім того, враховуючи дані наукової літератури та результати власних досліджень спектрів поглинання, спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції плазми крові й розчинів МС окремо та їх сумішей без УФО і після УФ-обробки, було доведено, що молекули білків плазми крові та МС, які беруть участь у поглинанні УФ-випромінювання, взаємодіють між собою (це виражалось зміною як положення смуг поглинання цих речовин, так і їх інтенсивності).У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в експериментальному визначенні режимів та умов фотодинамічного методу інактивації донорської плазми, яка контамінована модельними простими (вірус поліомієліту) і складними (вірус везикулярного стоматиту) вірусами. Установлено, що інактивація простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові більш ефективна при її попередній обробці фотосенсибілізатором МС у концентрації 1 ? 10-5 моль/л протягом однієї години та УФО в дозі 75 Дж. Показано, що при використанні фотодинамічного способу інактивації відбувається знезараження модельних вірусів поліомієліту і везикулярного стоматиту, які були внесені в донорську плазму з кінцевою інфекційною активністю 6,83 lg ТЦД50/мл і 5,33 lg ТЦД50/мл відповідно, відбувалось при використанні фотодинамічного способу інактивації, при цьому інфекційність модельних вірусів знижується до нуля.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в експериментальному визначенні режимів та умов фотодинамічного методу інактивації донорської плазми, яка контамінована модельними простими (вірус поліомієліту) і складними (вірус везикулярного стоматиту) вірусами. Показана ефективність комбінованого застосування фотосенсибілізатора фенотиазінового ряду метиленового синього та дозованого ультрафіолетового опромінення з метою отримання вірусобезпечної плазми крові донорів.

2. Установлено, що інактивація простих і складних модельних вірусів у плазмі донорської крові більш ефективна при її попередній обробці фотосенсибілізатором МС у концентрації 1 ? 10-5 моль/л протягом однієї години та УФО в дозі 75 Дж.

3. Показано, що при використанні фотодинамічного способу інактивації відбувається знезараження модельних вірусів поліомієліту і везикулярного стоматиту, які були внесені в донорську плазму з кінцевою інфекційною активністю 6,83 lg ТЦД50/мл і 5,33 lg ТЦД50/мл відповідно, відбувалось при використанні фотодинамічного способу інактивації, при цьому інфекційність модельних вірусів знижується до нуля.

4. Визначено, що механізм знезаражування контамінованої донорської плазми крові при комбінованому використанні МС та УФО полягає в ультрафіолетовій активації фотосенсибілізатора, а також у фотодинамічному ефекті синергічної дії МС і УФО.

5. Показано, що інактивація простих і складних модельних вірусів за фотодинамічним методом у запропонованому режимі не викликає агрегації білків вірусінактивованої плазми крові людини.

6. Доведена відсутність генотоксичної дії фотосенсибілізатора МС у вірусінактивуючій концентрації на гепатоцити білих щурів лінії Вістар.

7. Установлено, що ефективним способом видалення фотосенсибілізатора МС із фотомодифікованої вірусінактивованої плазми крові є метод хроматографії з використанням TSK-гелю “Toyopearl” (діапазон сорбції 100-10000 Д), який дозволив у модельних умовах зменшити вміст МС у 7,4 раза (від 3,7 до 0,5 мг/л), що не перевищує безпечну для людини дозу, яка дорівнює 1-2 мг/кг маси.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Отримані експериментальні дані показали принципову можливість вірусінактивації плазми донорської крові при комбінованому застосуванні фотосенсибілізатора метиленового синього та дозованого УФ-опромінення, що може слугувати основою для розробки промислової технології інактивації вірусів у донорській плазмі і створення доповнень до існуючих регламентів виготовлення білкових препаратів на станціях переливання крові України.

Виготовлена експериментальна модель „Пристрою для знезаражування рідини” (деклараційний патент України № 7835), яка може стати основою для промислової лінії зі знезараження плазми крові людини в закладах Служби крові України та інших медичних закладах.

1. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Профилактика вирусных инфекций при гемотрансфузиях // Гігієна населених місць. - 2003. - Вип. 41. - С. 399-405. Здобувачем здійснено підбір та аналіз наукової літератури, проведено критичний аналіз різних способів інактивації біопрепаратів крові, здійснено порівняльний аналіз архівного матеріалу щодо ступеня вірусінактивації плазми донорської крові при її фракціонуванні за Коном та сольвент-детергентним методом.

2. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Безопасность гемотрансфузий: проблемы карантинизации, вирусинактивации и донорства // Укр. журнал гематології та трансфузіології. - 2003. - № 5 (3). - С. 44-49. Здобувачем проведено аналіз сучасних методів інактивації біопрепаратів крові та шляхів вирішення проблеми безпеки гемотрансфузій, проведено узагальнення архівного матеріалу визначення ступеня інактивації модельних вірусів у плазмі крові при її фракціонуванні за Коном та сольвент-детергентним методом.

3. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Изучение механизмов фотодинамической инактивации вирусов в плазме крови // Міжвідомчий зб. „Гематологія і переливання крові”. - Харків: “НТМТ”, 2004. - Вип. 32, т. 1. - С. 126-131. Здобувачем проведено спектрально-флуоресцентні й вірусологічні дослідження для визначення механізму фотосенсибілізуючої дії метиленового синього та ступеню вірусінактивуючої дії комбінованого застосування фотосенсибілізатора та УФО, виконано статистичний аналіз та узагальнення результатів.

4. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В., Недилько С.Г. Спектрально-люминесцентные свойства плазмы донорской крови при фотохимической инактивации вирусов // Укр. журнал гематології та трансфузіології. - 2004. - № 4 (4). - С. 31-36. Здобувачем здійснено підбір спектрально-люмінесцентних методів дослідження, визначено ступінь інактивації вірусів у плазмі крові після комбінованого застосування МС і УФО, проведено статистичний аналіз та узагальнення отриманих результатів.

5. Декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32. Пристрій для знезаражування рідини: декл. патент UA № 7835, МКП 7 C 02 F 1/32/ Тимченко А.С., Бондар В.В., Сергутіна С.Ю. (Україна); Інститут гематології та трансфузіології АМН України. - № 20041109664; Заявл. 24.11.2004; Опубл. 15.07.2005. - Бюл. № 7.

6. Bondar V.V., Timchenko A.S., Sergutina S.Y. Investigation of inactivation of DNA- and RNA-contained viruses in human blood plasma // Book of Abstract: International Scientific and Practical Conference. - Kyiv, 18-21 June, 2003. - P. 59.

7. Timchenko A.S., Lisniak I.A., Boyko I.I., Sergutina S.Y., Pogodayeva L.K. Estimation of virus inactivation efficacy by means of Cohns spirit fractionation and solvent-detergent method // Prague 2003 Abstract Book. E.S.F.H. 14th Congress of the Interdisciplinary European Society for Haemapheresis and Haemotherapy. - Prague, September 10-13, 2003. - P. 62.

8. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Изучение механизмов и эффективности вирусинактивации плазмы крови с помощью фотосенсибилизаторов и ультрафиолетового облучения // Зб. праць науково-практич. конференції „Біофізичні і клінічні ефекти УФО”. - Євпаторія, 27-28 травня, 2004 р. - С. 88-89.

9. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю., Бондар В.В. Фотодинамическая инактивация вирусов плазмы крови // Материалы Российской науч.-практич. конференции “Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии”. - Санкт-Петербург, 8-10 июня, 2004 г. - С. 162-163.

10. Тимченко А.С., Сергутина С.Ю. Зависимость вирусинактивирующей активности метиленового синего от концентрации и длительности фотосенсибилизации / Матеріали науково-практичної конференції „Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”, 13-14 жовтня, 2005 р., г. Київ. // Укр. журнал гематології та трансфузіології. - 2005. - № 4 (дод.) (5). - С. 119-120.