Імуногістохімічна діагностика та оцінка клітинного імунітету при сальмонельозі курей - Автореферат

Усе це підкреслює необхідність розробки та впровадження ефективних заходів специфічної профілактики сальмонельозу птиці, які передбачають використання високочутливих і специфічних методів діагностики, застосування активних імунізуючих препаратів, вивчення особливостей стану імунітету за цієї хвороби. Тема дисертаційної роботи є частиною досліджень, передбачених тематичним планом ІЕКВМ УААН: "Дослідити механізми формування клітинного і гуморального імунітету з метою удосконалення методів діагностики, профілактики і лікування заразних хвороб тварин", 2001-2005 рр, № державної реєстрації 010101U001615 та "Вивчити фундаментальні та прикладні основи формування імунітету і регуляції метаболізму з метою створення нових методів діагностики, лікування та профілактики хвороб тварин, 2006-2010 рр", № державної реєстрації 0106U000339. Метою роботи було визначити за допомогою сучасних імуногістохімічних методів зміни кількості основних кластерів імунокомпетентних клітин селезінки та бурси Фабриціуса в динаміці формування імунітету в курчат після зараження сальмонелами або щеплення їх атенуйованою вакциною проти цього захворювання, розробити методику імуногістохімічного виявлення сальмонельозних антигенів, місць їхньої локалізації в органах курчат, заражених сальмонельозом. Застосування принципово нового підходу до вивчення особливостей динаміки формування імунітету шляхом імуногістохімічного вивчення відповідальних кластерів клітин дозволяє розпочати новий напрямок його досліджень у ветеринарних наукових закладах України. На підставі здійснених досліджень отримано нові дані про склад кластерів імунітету в курчат різного віку та зміни його при захворюванні і імунізації проти сальмонельозу, встановлені показники кількості та особливості характеру маркованих клітин у нормі, визначені потенціальні можливості імуногістохімії як чутливого і точного методу оцінки стану клітинного (тканинних лімфоцитів, нормальних кілерів, хелперів та макрофагів) і гуморального (клітини, що продукують гама-та секреторні імуноглобуліни) імунітетів.На 51-у добу відбувалося збільшення вмісту клітин з кластерами CD3, IGG та IGA порівняно із 17-ю добою за незначного зменшення кількості клітин кластерів CVI та CD4. Вміст клітин з маркером IGA помітно скорочувався між 1-ю та 15-ю добами і в подальшому підвищувався, досягаючи максимуму на 51-у добу. На 17-у-21-у доби відзначалася деяка стабілізація кількості кластера CD3, проте на 51-у добу знову відзначалося зниження відсотка цих клітин. Було встановлено, що різке зниження їхньої кількості на першу добу в групі вакцинованої птиці змінювалося періодом підвищення їхньої активності на 6-у-8-у доби, причому максимального рівня IGM досягав на 8-у добу (2,026±0,502 % проти 0,229±0,080 % на 6-у добу). Дослідженнями кластерів імунних клітин у бурсі Фабриціуса в курчат установлено, що в субпопуляції лімфоцитів з поверхневим маркером CD3, який характеризує загальну кількість тканинних Т-лімфоцитів у лімфоїдному органі, у інфікованої птиці на 1-у та 2-у доби спостерігалася тенденція до зниження, і лише з 3-ї доби спостерігалися незначні позитивні зрушення із збільшенням відсотка CD3-4,550±0,592 % проти 2,781±0,562 % у курчат на 1-у добу.У селезінці контрольних неінфікованих SPF курчат між 1-ю та 8-ю добами їхнього життя різко зростала кількість клітин з маркерами CD3, CD4, CD8, CVI, IGG. З 15-ї доби майже вдвічі зменшувалася кількість клітин з маркером IGA, яка потім помітно підвищувалася на 17-у - 51-у доби (0,263±0,063 % на 51-у добу). У бурсі Фабриціуса SPF курчат з 13-ї по 51-у доби спостерігалося стабільне зменшення вмісту клітин з маркерами CD3, CD4 та CD8. Кількість клітин з маркером CVI незначна та була з 15-ї по 51-у доби практично на рівні одноденних курчат (16,085±0,239 % на 51-у добу). У фабрицієвій бурсі така закономірність не спостерігалась, і тільки вміст клітин з маркерами імуноглобулінів у цьому органі помітно зростав, починаючи з 13-ї доби для IGG від 0,496±0,083 (1-а доба) до 0,740±0,046 (51-а доба) та для IGA від 0,019±0,003 (1-а доба) до 0,188±0,036 (на 51-у добу).

Вивчення динаміки кластерів імунітету в інтактних SPF курчат різного віку. При проведенні власних досліджень використовувалися SPF курчата. Було досліджено селезінку та бурсу Фабриціуса 33 курчат, у яких визначали кількість 9 кластерів клітин імунітету на 1-у, 2-у, 3-ю, 6-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-у та 51-у доби життя.

Дослідженнями встановлено, що кількість клітин досліджуваних кластерів з віком змінювалася, причому характер та динаміка змін у цих головних органах імунітету істотно відрізнялися. Отримані дані свідчили про те, що в селезінці (порівняно з 1-ю добою досліджень) на 8-у- 13-у доби відбувалося різке збільшення (у 2-5 разів) кількості клітин кластерів CD3, CD4, CD8, CVI та IGG. На 15-у добу спостерігалося зниження кількості клітин кластерів CD3, CVI, IGG та IGA за деякого зростання вмісту клітин з маркерами CD4 та CD8 порівняно з 13-ю добою досліджень. На 17-у добу відзначалася певна стабілізація вмісту кластерів на рівні, близькому до їхнього значення на 15-у добу. На 51-у добу відбувалося збільшення вмісту клітин з кластерами CD3, IGG та IGA порівняно із 17-ю добою за незначного зменшення кількості клітин кластерів CVI та CD4. Вміст клітин з маркером IGA помітно скорочувався між 1-ю та 15-ю добами і в подальшому підвищувався, досягаючи максимуму на 51-у добу.

Характер кількісних показників кластерів у бурсі Фабриціуса був істотно іншим. У ній відзначалося значне і безперервне, з 15-ї по 51-у доби, зниження кількості клітин з маркерами CD3 та CD4. З 15-ї доби починалося зменшення кількості клітин з маркером CD8. Кількість клітин кластера CVI утримувалася майже весь час на рівні показників першої доби. Вміст кластера IGG починав стабільно зростати з 13-ї по 51-у доби. Кількість клітин кластера IGA різко підвищувалась майже вдвічі, на 8-у добу і в 6-9 разів на 13-у-15-у та 17-у-51-у доби. Інформативними були дані, отримані при визначенні строків нагромадження максимальної кількості досліджених кластерів (табл. 1).

Таблиця 1

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса SPF курчат (M n; n=3)

Назва кластера Селезінка Бурса Фабриціуса

Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, % Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, %

CD3 13 28,252±4,595 1 2,574±0,162

CD4 17 8,604±0,355 1 0,267±0,055

CD8 15 15,515±1,534 1 0,654±0,074

CVI 8 70,805±2,519 8 20,817±0,024

IGG 13 1,780±2,380 10 1,012±0,158

IGA 51 0,263±0,063 10 0,237±0,059

Отримані дані свідчили про те, що в SPF курчат показники всіх кластерів імунітету були вищими в селезінці. Особливо привертав увагу дуже високий максимальний вміст тканинних лімфоцитів CD3 (до 28,2 %) та макрофагів (70,8 %), що засвідчувало їхнє провідне значення у визначенні стану імунітету в SPF курчат.

Вивчення динаміки кластерів імунітету курчат після щеплення вакциною Salmovac SEO. Динаміка імунітету вивчалася на субпопуляційному рівні шляхом визначення кількості 9 згаданих вище кластерів імунокомпетентних клітин Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів і макрофагів у селезінці та фабрицієвій бурсі.

Дослідження засвідчили, що в селезінці після введення вакцинного штаму сальмонел чітке зниження кількості клітин з маркером CD3 виявлялось уже на 2-гу добу. Супресивний вплив вакцини спостерігався і на 3-ю добу, але на 6-у добу відбувалося помітне збільшення відсотка CD3, причому кількісні показники в групі імунізованих курчат приблизно вчетверо перевищували їхню величину в попередні строки досліджень. На 17-у-21-у доби відзначалася деяка стабілізація кількості кластера CD3, проте на 51-у добу знову відзначалося зниження відсотка цих клітин.

Відсоток кількості CD4 (хелперів), як і в попередній групі лімфоцитів, змінювався в процесі розвитку реакції на щеплення. Так, після введення вакцини на 1-у-2-у доби спостерігалося зменшення їхньої кількості до 1,944±0,467 % проти 5,528±1,173 % у контролі. Кількість хелперів після введення вакцинного штаму на 21-у добу знову починала дещо зменшуватися.

Характер кривої змін кількості CD8 (цитотоксичних клітин-кілерів) був майже таким, як і в субпопуляції CD3 (табл. 2).

Таблиця 2

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса вакцинованих проти сальмонельозу курчат (M n; n=3)

Назва кластера Селезінка Бурса Фабриціуса

Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, % Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, %

CD3 8 41,953±1,959* 8 8,479±1,178

CD4 8 8,119±0,838 8 0,983±0,338

CD8 8 36,924±1,115* 8 5,901±1,203

CVI 6 67,343±1,773* 8 30,464±2,365

IGG 51 0,494±0,052** 51 2,856±0,018

IGA 51 0,606±0,013* 17 7,205±0,051

IGM 8 2,026±0,502** 10 21,767±2,947

Примітка: * - р<0,001;

** р<0,05

У субпопуляціях В-лімфоцитів з поверхневими імуноглобулінами G, M та A зміни мали інший характер. Кількість лімфоцитів з маркером IGG у цілому на першу добу мала тенденцію до зниження. На третю добу розміри скупчень цих клітин були близькими до контролю, таким чином, відбувалася певна стабілізація їхньої кількості. Далі спостерігався процес активації, що тривав до кінця строку спостережень на 51-у добу, коли відсоток цих клітин досягав 0,494±0,052 % проти 0,194±0,033 % на 15-у добу.

Істотних змін кількості лімфоцитів з маркерним імуноглобуліном IGA впродовж перших 10-и діб досліду не спостерігалося. Безперервне збільшення клітин кластера IGA починалось із 13-ї та тривало до 51-ї доби.

Своєрідний тип змін спостерігався при вивченні динаміки розвитку імунної реакції лімфоцитів з маркером IGM. Було встановлено, що різке зниження їхньої кількості на першу добу в групі вакцинованої птиці змінювалося періодом підвищення їхньої активності на 6-у-8-у доби, причому максимального рівня IGM досягав на 8-у добу (2,026±0,502 % проти 0,229±0,080 % на 6-у добу).

На макрофаги з поверхневим маркером CVI вакцина в першу добу діяла супресивно. У подальшому спостерігалося збільшення їх відсотка.

Динаміка змін субпопуляцій клітин бурси Фабриціуса мала певні особливості (табл. 2).

Вивчення субпопуляцій клітин бурси Фабриціуса з маркером CD3 дозволило встановити супресивну дію вакцини на ці клітини в перші три доби після імунізації. Із 6-ї доби спостерігалося чітке збільшення субпопуляції цих клітин. Максимального значення з високим рівнем вірогідності вона досягала на 8-у добу (8,479±1,178 %).

Досить схожим із CD3 був характер змін кількості CD4 (Т-хелперів). Звертало на себе увагу те, що реакція хелперів на вакцинний штам була слабкішою і на 51-у добу практично згасала та була помітно нижчою, ніж після інфікування сальмонелами. Таким чином, хелпери більш активно реагували на інфікування патогенними сальмонелами.

Різке підвищення відсотка TCR2 було зареєстровано ще на першу добу після вакцинації, коли значення цього маркера було максимальним (0,718±0,158 % проти 0,289±0,068 % у групі контролю). Очевидно, воно було обумовлене сильною неспецифічною реакцією (на введення антигена) головного комплексу гістосумісності, до якого належать TCR1 і TCR2.

Своєрідною була реакція макрофагів (маркер CVI) бурси Фабриціуса. Кількість цих клітин у піддослідній і контрольній групах була протягом усього досліду практично однаковою навіть на 51-у добу.

При вивченні кількості клітин з маркером IGM збільшення їхньої кількості відзначено вже з 1-ї доби та становило в імунізованих курчат 3,639±0,540 % (при 1,737±0,472 % у контролі). Максимального значення рівень вмісту IGM досягав на 10-у добу. На 13-у добу величина IGM знижувалася до 5,767±1,171 % (при 21,767±2,947 % на 10-у добу). Очевидно, це було повязано з інтенсивним переходом IGM в IGG на цій стадії розвитку імунного процесу.

Кількість клітин з маркером IGG у бурсі Фабриціуса вакцинованих курчат не відрізнялась постійністю й до 10-ї доби була в більшості випадків нижчою, ніж у контрольної групи птиці. Лише на 13-у добу було зареєстроване чітке зростання вмісту IGG в імунізованих курчат (2,779±0,121 % проти 0,814±0,185 % на 10-у добу). Приблизно на цьому рівні утримувалося кількісне значення цього кластера від початку до кінця досліду, що засвідчувало становлення гуморального імунітету в курчат при сальмонельозі вже у віці 13-и-15-и діб. Отримані дані суттєво відрізнялися від тих, які були отримані при вивченні цих кластерів у селезінці. Вони свідчили про те, що у формуванні імуноглобулінів при сальмонельозі курчат раннього віку вирішальне значення має кластер IGG В-клітин бурси Фабриціуса.

Вміст маркеру IGA, починаючи з перших діб проведених досліджень, постійно зростав у бурсі Фабриціуса імунізованих курчат. Процес збільшення тривав з 8-ї до 21-ї доби включно, коли рівень IGA досягав максимальних значень (7,263±0,045 % при 0,176±0,007% у контролі). Лише на 51-у добу відзначене зниження вмісту лімфоцитів з поверхневим маркером IGA (рис. 1).

Динаміка кластерів клітин імунітету курчат, мічених стрептавідин-біотином, після застосування епізоотичного штаму S. enteritidis SE 147. У селезінці інфікованих курчат у найбільш ранній період відзначалася своєрідна фаза супресії популяції клітин з поверхневим маркером CD3, особливо чітко виражена в перші три доби. Максимальних значень рівень CD3 досягав на 6-у, 8-у та 10-у доби після зараження (табл. 3).

При вивченні субпопуляції Т-лімфоцитів з поверхневим маркером CD4 (Т-хелпери) було встановлено 2 етапи збільшення вмісту цих клітин. Перший етап спостерігався з першої по 10-у доби. Після різкого спаду активності на 13-у добу спостерігалася друга хвиля зростання відсоткового вмісту CD4 з піком на 15-у добу (табл. 3).

При вивченні динаміки змін імунокомпетентних клітин селезінки з поверхневим маркером CD8 було встановлено зменшення кількості цих цитотоксичних лімфоцитів у перші дві доби спостережень. Максимальний рівень CD8 було зареєстровано на 8-у добу. Друга хвиля постсупресивного зростання кількості клітин з маркером CD8 спостерігалася на 15-у добу (табл. 3). Високий рівень CD8 у період з 8-ї по 10-у доби значною мірою та досить демонстративно відображав загальний характер розвитку імунного процесу при сальмонельозі.

Таблиця 3

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса в курчат, заражених сальмонелами (M n; n=3)

Назва кластера Селезінка Бурса Фабриціуса

Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, % Доба виявлення максимального вмісту кластера Максимальний вміст кластера, %

CD3 8 28,898±1,299 8 19,311±1,278*

CD4 15 9,851±1,708 15-17 3,721±0,187*

CD8 15 18,697±1,056 8-13 14,769±1,196*

CVI 8 66,352±1,242 13 19,138±2,057

IGG 8 0,655±0,158 51 2,029±0,044*

IGA 51 0,761±0,094* 13-17 8,914±3,385

Примітка: * - різниця значень показників дослідних тварин (1-а група) вірогідна за р<0,001 відносно рівня значень відповідних показників у групі контролю.

Динаміка змін субпопуляції TCR2 була дуже схожою із CD8.

Характер динаміки змін субпопуляції В-лімфоцитів з поверхневим маркером IGM був таким, як і в групі імунізованих курчат, тобто спостерігався період підвищення активності з першої по 8-у добу включно. Але, на відміну від групи імунізованих курчат, у групі інфікованої птиці це збільшення було значно сильнішим. У період з 15-ї і по 51-у доби відбувалося стабільне зниження величини відсоткового вмісту цієї субпопуляції, що вірогідно можна пояснювати переходом IGM в IGG.

При вивченні субпопуляції В-лімфоцитів з поверхневим маркером IGG у перші два тижні після інокуляції збудника не було встановлено стійкої тенденції до збільшення або зменшення кількості IGG. Це могло вказувати на те, що кінцеве формування IGG з його попередника IGM відбувається на 14-у добу життя.

Як і в імунізованих курчат, так і в групі інфікованих курчат при вивченні В-лімфоцитів з поверхневим маркером IGA не було встановлено чіткої тенденції до збільшення або зменшення відсоткового вмісту IGA в селезінці протягом перших 13-ти діб досліджень. На 21-у й на 51-у доби встановлено різке збільшення кількості клітин кластера IGA, особливо на 51-у добу, коли його відсоток становив 0,761±0,094 % при 0,263±0,063 % у групі контролю.

У цілому дослідження групи лімфоцитів з маркерами імуноглобулінів у селезінці свідчили про відсутність чітких проявів збільшення кількості глобулінекспресуючих субпопуляцій клітин, зокрема лімфоцитів з маркерами IGG та IGA та про супресію субпопуляції IGM, яка розвивалася наприкінці періоду досліджень.

Зростання субпопуляції мононуклеарів з поверхневим маркером CVI (макрофагів) відзначалося в більш ранні строки, ніж у інших субпопуляцій, тобто вже на 3-ю добу, і зберігалося до 6-ї доби, що пояснюється, можливо, їхньою найбільш ранньою взаємодією з антигеном як ланки, що забезпечує подання переробленої антигенної субстанції виконавчим клітинам.

Дослідженнями кластерів імунних клітин у бурсі Фабриціуса в курчат установлено, що в субпопуляції лімфоцитів з поверхневим маркером CD3, який характеризує загальну кількість тканинних Т-лімфоцитів у лімфоїдному органі, у інфікованої птиці на 1-у та 2-у доби спостерігалася тенденція до зниження, і лише з 3-ї доби спостерігалися незначні позитивні зрушення із збільшенням відсотка CD3-4,550±0,592 % проти 2,781±0,562 % у курчат на 1-у добу. Максимальне зростання кількості CD3 клітин установлено на 8-у добу, коли в цій групі піддослідних курчат відсоток CD3 становив 19,311±1,278 % проти 8,513±2,428 % на 6-у добу.

Величина маркера CD4 виявляла слабку тенденцію до збільшення в перші дві доби. На 3-ю добу збільшення відсотка Т-хелперів досягало в групі інфікованих курчат високого значення (1,113±0,458 % проти 0,474±0,178 % на 2-у добу). Як свідчать дані, подані на рис. 2, вірогідне збільшення площі клітин з маркером CD4 тривало до 21-ї доби.

При вивченні динаміки змін субпопуляції Т-лімфоцитів з поверхневим маркером CD8 у бурсі Фабриціуса в групі заражених курчат була встановлена деяка супресія. Але з 8-ї доби після інфікування спостерігався процес збільшення вмісту маркера з максимальним рівнем на 13-у добу-14,769±1,196 %.

Кількісні зміни кластера TCR1 також указували на його активну участь у захисті курчат проти сальмонельозу. Так, на 2-у добу спостерігали супресію TCR1. Але, на відміну від CD8, процес різкого підвищення починався раніше - вже на 6-у добу та тривав до 10-ї доби (3,920±0,507 % проти 3,623±0,594 % на 8-у добу). Від групи імунізованих курчат рівень TCR1 відрізнявся більш тривалим і сильним постсупресивним його зростанням.

Суттєве зниження кількості лімфоцитів з маркером TCR2, більш виражене, ніж TCR1, спостерігалось уже на 3-ю добу. Значне підвищення кількості TCR2 відзначали на 8-у добу, і особливо на 10-у (1,415±0,190 % при 0,864±0,143 % на 8-у добу).

При вивченні клітин з маркером IGM збільшення їхнього вмісту виявили на 6-у добу після інфікування (8,943±2,045 % проти 5,395±0,590 % у групі контролю). Потім відбувалося збільшення кількості клітин з цим поверхневим маркером на 10-у добу та різке зменшення на 13-у добу до 6,747±0,743 %, що можна було пояснити перетворенням клітин з маркером IGM на клітини з маркером IGG після 10-ї доби досліду.

Це положення підтверджувалося даними детекції лімфоцитів з поверхневим маркером IGG. Як засвідчили здійснені дослідження, кількість клітин з маркером IGG у бурсі Фабриціуса піддослідних і контрольних курчат зростала та утримувалась майже на однаковому рівні між 1-ю та 10-ю добами. Потім спостерігалося різке підвищення їхньої кількості на 13-у добу (до 1,848±0,801 % проти 0,624±0,121 % на 6-у добу).

При вивченні лімфоцитів з поверхневим маркером IGA в бурсі Фабриціуса встановлена винятково висока їхня активність, яка досить сильно виражена вже на 8-у добу (5,907±1,572 % проти 0,052±0,008 % на 1-у добу). На 51-у добу відзначено часткове зниження їхньої кількості, яка, однак, залишалася набагато вищою, ніж у контролі. На 13-у добу рівень вмісту IGA досягав максимуму та становив 8,914±3,385 %.

Отже, звертала на себе увагу активна участь у формуванні імунітету при сальмонельозі клітин бурси Фабриціуса, що продукують імуноглобуліни. У бурсі Фабриціуса лімфоцитів з маркером IGA було більше, ніж у селезінці, також багато було в ній і клітин з маркером IGG, у той час, як у селезінці вміст останніх був незначним, що підкреслювало вирішальне значення фабрицієвої бурси у формуванні гуморальної імунної відповіді птиці.

Проте, в бурсі Фабриціуса інфікованих курчат набагато сильніше зростав вміст клітин з маркерами CD3, CD4, CD8, TCR1, TCR2, IGM, IGA, а рівень вмісту клітин з маркером IGG був вищим у вакцинованої птиці. У інфікованих курчат у бурсі Фабриціуса, на відміну від імунізованих, набагато сильніше збільшується вміст лімфоцитів з поверхневими маркерами CD3, CD4, CD8, TCR1, TCR2, а в селезінці також і клітин з маркерами IGM, IGA. Збільшення кількості кластерів імунітету за винятком макрофагів (CVI) після імунізації було у фабрицієвій бурсі набагато сильніше виражено, ніж у селезінці. Наведені дані підтверджують висловлену раніше тезу про більшу роль бурси Фабриціуса, хоча свідчать про те, що обидва органи різною мірою беруть участь у формуванні імунного захисту як при інфікуванні сальмонельозом, так і при щепленні атенуйованою вакциною. Заслуговував на увагу той факт, що рівні вмісту клітин з маркерами IGG та IGA у фабрицієвій бурсі досягали максимуму на 13-ту - 15-ту доби, причому кількість IGG була більшою в імунізованої птиці, а рівень вмісту IGA був вищим у птиці, зараженої патогенним збудником. Отже, за даними імуногістохімічних досліджень формування імунітету в організмі щепленої та інфікованої птиці настає на 13-у-15-у доби за участі обох основних кластерів продуцентів імуноглобулінів.

Імунітет, що формувався після зараження сальмонельозом та щеплення курчат проти нього, мав певні відмінності. Як свідчать дані проведених досліджень, існують також інші відмінності в характері динаміки змін інших кластерів у групах щеплених та заражених курчат. Так, зокрема встановлено, що кількість клітин кластера CD8 у селезінці зростає значно сильніше в групах імунізованих курчат, у той час як кількість клітин з маркерами CD3, CD8, TCR1 та TCR2 стабільніше зростала в інфікованих курчат. Виходячи з цього, можна припускати, що при зараженні курчат більш активно спрацьовує функція первинного клітинного захисту, а при вакцинації сильніше виражені прояви антитільного, гуморального імунітету. Звертало на себе увагу й те, що при зараженні курчат у бурсі Фабриціуса сильніше визначалося збільшення кількості (а отже, й посилення активності) лімфоцитів з поверхневими маркерами CD3, CD4, CD8, TCR1, TCR2, IGA, IGM, а в селезінці - кластера IGM.

Заслуговувало на увагу те, що в бурсі Фабриціуса дуже чітко, на протилежність групі інфікованих курчат, визначалося домінування на 8-у - 51-у доби клітин кластера IGG. Причому високий і стабільний рівень їхнього вмісту утримувався з 13-ї по 51-у доби включно. Отже, імуногістохімічне визначення кількості кластера IGG може бути критерієм визначення активності протисальмонельозних вакцин. Привертає увагу те, що в зараженої птиці превалюють клітини кластера IGA, у той час як у щеплених курчат превалюють клітини кластера IGG, що може бути використано для диференціації післявакцинального та післяінфекційного імунітетів за цього захворювання.

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена у внутрішніх та імунокомпетентних органах і тканинах курчат після орального зараження Salmonella enteritidis. Дослідження здійснювали на 90 головах курчат добового віку породи Білий Легорн, з яких було сформовано 2 групи: інфіковані та контрольні. Забій курчат проводили на 5-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-у та 51-у доби після інфікування.

Метою цих досліджень було розробити імуногістохімічний метод визначення специфічних антигенів сальмонел у тканинах хворої на сальмонельоз птиці для індикації уражених збудником органів і тканин.

Сальмонельозний антиген у гістологічних препаратах тканин і органів тварин дослідної групи після імуногістохімічного фарбування мав вигляд локальних або дифузних скупчень округлої та глибчастої форми коричневого кольору на загальному синьому фоні. На гістологічних зрізах тканин та органів тварин контрольної групи таких скупчень не спостерігалося.

При дослідженні змін у залозистому шлунку на 5-у добу було встановлено, що сальмонельозний антиген у вигляді дрібних глибок накопичувався лише в стінках головних залоз. Відсоткова кількість антигена становила 1,58±0,007 %. При вивченні імуногістохімічних змін у залозистому шлунку на 10-у добу спостережень було встановлено, що антиген сальмонели накопичувався в просвіті кровоносних судин. Поодинокі його глибки спостерігались у стінках головних залоз. Відсоткова кількість антигена складала 3,23±0,035 % відносно всієї площі гістологічного зрізу. Максимальних показників кількість сальмонельозного антигена набувала на 15-у добу досліджень і становила 5,09±0,055 %.

Досить слабко на зараження сальмонельозом реагували тканини бурси Фабриціуса в перші два тижні спостережень. Антиген виявляли лише в міжфолікулярній сполучній тканині у вигляді окремих дрібних глибок. Маса бурси Фабриціуса на 5-у добу дорівнювала 0,057±0,010 г у інфікованих курчат проти 0,085±0,011 г у групі здорових контрольних курчат. Звертав на себе увагу той факт, що з 17-ї доби спостерігалося різке збільшення відсоткової кількості антигена в бурсі Фабриціуса, коли його вміст досягав максимального значення та дорівнював 14,42±0,12 %.

При аналізі імуногістохімічних змін у селезінці встановлено дві хвилі помітного підвищення відсоткової кількості сальмонельозного антигена - на 8-у та 15-у доби досліджень. Кількість антигена на 5-у добу була в цілому невеликою - 2,23±0,031 %. Але вже на 8-у добу спостерігалася перша хвиля підйому вмісту сальмонельозного антигена, коли його відсоткова кількість становила 13,58±0,046 %. У цей період антиген накопичувався навколо ретикуло-ендотеліальних муфт, де він фіксувався періеліпсоїдами-клітинами, розташованими по периферії муфт. Друга хвиля різкого підвищення вмісту сальмонельозного антигена була зареєстрована на 15-у добу спостережень. Площа, яку займав антиген у селезінці на 15-у добу, становила 34,75±0,038 %. У наступний період, між 17-ю та 51-ю добами, спостерігався спад активності накопичення антигена сальмонели, особливо виражений на 21-у і 51-у доби досліджень.

Що стосується сліпої кишки, то динаміка накопичення антигена сальмонели в цьому органі була дуже схожою з такою в бурсі Фабриціуса. На 17-у добу досліджень спостерігали різке збільшення вмісту антигена, коли його рівень досягав 19,36±0,084 % і він накопичувався в підслизовому шарі та просвіті кровоносних судин. Максимальна кількість сальмонельозного антигена відзначена на 21-у добу (19,82±0,049 %).

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена в мязовій тканині дозволило встановити дуже низький його рівень. З 5-ї до 13-ї доби антиген виявляли лише між окремими мязовими волокнами у вигляді поодиноких гранул. Площа, яку займав антиген на 5-у добу, становила 1,02±0,014 %. Максимальний рівень накопичення антигена спостерігався на 17-у добу, коли його вміст досягав 2,85±0,053 %.

Тенденція до поступового збільшення вмісту сальмонельозного антигена відзначена і в тимусі.

Як свідчать дані рисунка 3, при аналізі імуногістохімічних змін у печінці встановлено різке (майже вдвічі) підвищення рівня накопичення антигена сальмонели (з 4,67±0,028 % на 5-у добу до 8,61±0,032 % на 8-у добу). Основним місцем накопичення антигена на цей час був просвіт кровоносних судин. У наступний період, з 10-ї до 13-ї доби, кількість антигена в органі повільно зростала на 13-у добу досліджень. Максимального рівня процес накопичення антигена досягав на 15-у добу після інфікування, коли відсоткова його кількість досягла 14,80±0,028 %. Антигенні скупчення набували дифузного характеру.

Отже, одержані результати свідчать, що більшу кількість антигена сальмонели було виявлено в гістологічних зрізах селезінки та печінки. З цього можна зробити висновок, що за орального зараження курчат збудник сальмонельозу в основному розмножується і накопичується в селезінці та печінці, і менше в інших органах, що досліджувалися. Частіше імунофарбований антиген спостерігався в структурах, багатих на ретикуло-ендотеліальні клітини.

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена у внутрішніх та імунокомпетентних органах і тканинах курчат після внутрішньомязового зараження Salmonella enteritidis. Дослідження проводили на 30 головах курчат породи Білий Легорн 14-добового віку, з яких було сформовано 2 групи: 1-а група-інфіковані, 2-а група-контрольна. Забій курчат проводили на 15-у, 30-у та 45-у доби після інфікування.

У залозистому шлунку інфікованих курчат відзначали накопичення сальмонельозного антигена в основному протягом першого місяця досліджень. Так, якщо на 15-у добу кількість антигена становила 9,79±0,042 %, то вже на 30-у добу вона досягла 8,77±0,043 %. Залозисті шлунки від контрольних, інтактних курчат переважали за масою інфікованих майже вдвічі.

При дослідженні імуногістохімічних змін у бурсі Фабриціуса було встановлено різке підвищення кількості сальмонельозного антигена на 15-у добу, коли максимальний його вміст становив 6,20±0,014 %. Слід зазначити, що в цей період досліджень зареєстровано велику різницю (майже у 8 разів) між масою цього органу в інфікованих та контрольних курчат. На 30-у добу спостережень рівень антигена в бурсі Фабриціуса різко знижувався і кількісний його показник становив 1,98±0,021 %.

На 15-добу досліджень кількість сальмонельозного антигена в селезінці була відносно невеликою-5,29±0,028 %, але вже на 30-у добу його кількість становила 44,10±0,042 %. Відповідно змінювалась і маса селезінки. Так, на 15-у добу вона становила 0,051±0,008 г у інфікованих курчат проти 0,150±0,024 г у групі контрольної птиці. На 30-у добу цей показник дорівнював 0,257±0,046 г проти 0,411±0,063 г у групі контролю відповідно. На 45-у добу спостерігали процес поступового, повільного зменшення кількості антигена збудника сальмонельозу до 36,9±0,033 %. Проте цей показник усе ж був досить високим.

Аналіз динаміки накопичення антигена в мязовій тканині засвідчив, що максимального рівня процес набуває вже на 15-у добу досліджень, коли його показник дорівнював 11,00±0,039 %.

Характер кривої змін у тимусі не відрізнявся від мязової тканини. Максимальних показників процес накопичення досяг на 15-у добу спостережень-46,51±0,039 %. При зважуванні тимуса було виявлено дуже низьку масу цього органу в інфікованих тварин порівняно з інтактними.

На відміну від інших органів і тканин, печінка була тим органом, де сальмонельозний антиген накопичувався та зберігався в дуже великій кількості протягом усього періоду досліджень. Максимального рівня процес накопичення досягав на 15-у добу, коли його відсоткова кількість досягала 26,81±0,043 %. Маса печінки становила в заражених тварин 2,337±0,102 г проти 4,087±0,082 г у групі контролю.

Таким чином, за внутрішньомязового інфікування курчат збудником сальмонельозу найбільше нагромадження антигена спостерігалось у бурсі Фабриціуса, селезінці, тимусі й печінці в перші два тижні після інфікування. Печінка зберігала в собі велику кількість сальмонельозного антигена більш тривалий час, і тому, очевидно, цей орган є найбільш небезпечним для здоровя людини. Мязова тканина також може бути джерелом сальмонельозної інфекції.

Вивчення параметрів маси органів курчат після орального зараження збудником сальмонельозу При вивченні вмісту кластерів імунних клітин після зараження курчат сальмонелами визначалася також динаміка зміни мас досліджуваних органів у аналогічні строки, тобто через 5-ть, 8-м, 10-ть, 13-ть, 15-ть, 17-ть, 21-у, та 51-у добу після орального введення збудника. Отримані дані свідчать про те, що введені через рот патогенні сальмонели пригнічують загальну активність органів, тобто негативно впливають на тимус, бурсу Фабриціуса та селезінку, що виконують важливу імунологічну функцію. Їхня дія призводила також до значного зменшення маси залозистого шлунка і печінки. Менше, ніж у інших органів, знижувалася проти норми маса печінки. Знижені проти контролю рівні маси тимуса, бурси Фабриціуса та селезінки утримувалися до 21-ї доби, і лише на 51-у добу відзначалася тенденція до її підвищення, особливо це стосувалося тимуса, селезінки і залозистого шлунка. Таким чином, з наведеного вище видно, що сальмонели викликають тривале зниження маси органів імунітету, залозистого шлунка і печінки в інфікованих курчат.

Таблиця 4

Відсоток втрати живої маси внутрішніх органів курчат після орального зараження Salmonella enteritidis порівняно з контролем (n=5)

Доба/ орган Тимус Залозистий шлунок Бурса Фабриціуса Печінка Селезінка

5 32,22 39,13 32,95 15,06 30,24

8 34,64 29,29 48,39 15,75 29,10

10 54,23 21,39 45,37 14,72 34,10

13 27,42 18,89 19,65 16,67 -

15 39,22 10,95 36,68 9,67 -

17 34,39 13,48 31,04 16,58 20,12

21 31,71 15,25 39,98 18,75 9,45

51 17,36 15,10 37,94 19,11 15,391. Вивчено основні кластери клітин імунітету (CD3, CD4, CD8, TCR1, TCR2, CVI, IGM, IGG та IGA), динаміку розвитку цих компонентів клітинного імунітету у SPF курчат після інфікування патогенним збудником та щеплення атенуйованою вакциною проти сальмонельозу. Отримані дані про особливості складу кластерів за постінфекційного та поствакцинального імунітетів у птиці, визначена роль певних кластерів на різних етапах формування імунітету. Розроблено двоступеневий метод імуногістохімічної індикації сальмонельозного антигена в зрізах із тканин, інфікованих збудником сальмонельозу птиці шляхом використання поліклональних імуноглобулінів. Визначені строки та місця максимального накопичення антигена, що підвищує ефективність діагностики захворювання та удосконалює експертизу продуктів забою птиці, контамінованих сальмонелами.

2. У селезінці контрольних неінфікованих SPF курчат між 1-ю та 8-ю добами їхнього життя різко зростала кількість клітин з маркерами CD3, CD4, CD8, CVI, IGG. З 15-ї доби майже вдвічі зменшувалася кількість клітин з маркером IGA, яка потім помітно підвищувалася на 17-у - 51-у доби (0,263±0,063 % на 51-у добу).

3. У бурсі Фабриціуса SPF курчат з 13-ї по 51-у доби спостерігалося стабільне зменшення вмісту клітин з маркерами CD3, CD4 та CD8. Кількість клітин з маркером CVI незначна та була з 15-ї по 51-у доби практично на рівні одноденних курчат (16,085±0,239 % на 51-у добу). Істотно, але короткочасно, на 8-у-13-у доби збільшувалася кількість клітин з маркерами IGG (1,012±0,158 % на 10-у добу). Отже склад клітин із маркерами у фабрицієвій бурсі коливався, що свідчить про наявність у ній певних ознак зростання кількості кластерів залежно від віку, причиною чого могла бути відсутність антигенної стимуляції у SPF курчат.

4. Найбільш низька кількість усіх досліджених кластерів клітин селезінки була в одноденних курчат. На 8-у добу їхня кількість виходила на певні стартові рівні, які у 2-5 разів перевищували значення кластерів у одноденних курчат. У фабрицієвій бурсі така закономірність не спостерігалась, і тільки вміст клітин з маркерами імуноглобулінів у цьому органі помітно зростав, починаючи з 13-ї доби для IGG від 0,496±0,083 (1-а доба) до 0,740±0,046 (51-а доба) та для IGA від 0,019±0,003 (1-а доба) до 0,188±0,036 (на 51-у добу).

5. Імунітет у щепленої птиці відрізнявся від такого в зараженої більшою кількістю клітин з маркерами CD8 та IGG у бурсі Фабриціуса, а в селезінці - клітин з маркерами TCR2, IGM, IGA, CD8, CVI, CD3.

6. За даними визначення вмісту різних імунокомпетентних клітин у селезінці та бурсі Фабриціуса після імунізації курчат проти сальмонельозу, на відміну від зараженої птиці, швидше розвивався процес формування глобулінпродукуючих клітин. При цьому переважну роль відігравала бурса Фабриціуса. Важливе значення в створенні захисту проти сальмонельозу відігравали також секреторні імуноглобуліни, найбільший відсоток яких продукувався в бурсі (7,263±0,045 % на 21-у добу) і менша частина в селезінці (0,606±0,013 % на 51-у добу).

7. Кількість глобулінпродукуючих клітин (IGG) у бурсі Фабриціуса стабілізувалася на максимальному рівні в імунізованих та інфікованих курчат на 13-у добу й утримувалася на постійному рівні до 51-ї доби включно та була вищою в щепленої птиці, у той час як кількість секреторних імуноглобулінів (IGA) досягала в ній стабільно високого рівня на 15-ту добу (7,158±0,146 %), починала знижуватися після 21-ї доби (4,175±0,138 % на 51-у добу) та була більшою в інфікованої птиці, що дозволяє відрізнити післяінфекційний імунітет від післявакцинального при сальмонельозі птиці.

8. Запропонований двохетапний метод імуногістохімічного визначення сальмонельозного антигена дозволяє виявляти його в зрізах тканин хворої на сальмонельоз птиці, визначати місця локалізації, вивчати динаміку та кількість накопичення.

9. У курчат, орально інфікованих збудником сальмонельозу, антиген інтенсивніше накопичувався в печінці (14,80±0,028 % на 15-у добу) та селезінці (34,75±0,038 % на 15-у добу). За внутрішньомязового інфікування курчат спостерігалося накопичення антигена, особливо в бурсі Фабриціуса (6,20±0,014 % на 15-у добу), селезінці (44,10±0,042 % на 30-у добу) та мязовій тканині (11,00±0,039 % на 15-у добу).

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Методичні рекомендації з імуногістохімічної діагностики та оцінки імунітету при сальмонельозі птиці затверджені науково-методичною радою Держдепартаменту ветеринарної медицини України, протокол № 3 від 20. 12. 2006 року.

1. Красников Г.А., Шутченко П.А. Применение иммуноферментного и иммуногистохимического методов анализа для диагностики сальмонеллеза и изучения его иммуногенеза // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х., 2004. - Вип.83. - С.125-129. (Дисертант здійснив аналіз літературних даних щодо питань застосування імуноферментних та імуногістохімічних методів досліджень при хворобах сільськогосподарських тварин).

2. Изучение субпопуляций лимфоцитов и макрофагов селезенки у цыплят после заражения S. enteritidis и прививки аттенуированной вакциной / А. Берндт, У. Метнер, Г.А. Красников, П.А. Шутченко // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х., 2004. - Вип.84. - С.94-99. (Дисертант провів дослідження з вивчення динаміки змін субпопуляцій лімфоцитів та макрофагів селезінки курчат після вакцинації проти сальмонельозу, а також після їхнього зараження збудником сальмонельозу. Крім цього, дисертант описав стадійність розвитку імунної реакції).

3. Красников Г.А., Шутченко П.А., Берндт А. Применение иммуногистохимических методов исследования при изучении иммунитета животных // ІІІ конференція Всеукраїнського товариства ветеринарних патологів, 21-23 квітня 2004 р., м. Харків. - Х., 2004. - Ч.1. - С.35-38. (Дисертант проаналізував стан розвитку досліджень у галузі імуногістохімії з використанням методів визначення поверхневих маркерів клітин імунітету та перспектив їхнього застосування в науковій і практичній ветеринарній медицині).

4. Studying of chicken immune cell subpopulations after infection with salmonella enteritidis and inoculation with attenuated vaccine / A. Berndt, U. Methner, G.A. Krasnikov, P.A. Shutchenko // Animals. Health. Food Quality: International scientific conference proceedings, 15 october 2004, Jelgava, Latvia. - Jelgava, 2004. - P.36-39. (Дисертант дослідив динаміку формування субпопуляцій імунокомпетентних клітин у селезінці та бурсі Фабриціуса в нормі та після зараження Salmonella enteritidis).

5. Визначення поверхневих маркерів імунокомпетентних клітин у курчат у ранній період імуногенезу при сальмонельозі / А. Берндт, У. Метнер, Г.А. Красніков, П.О. Шутченко //Вісник аграрної науки. - 2004. - №9. - С.30-33. (Дисертант дослідив динаміку складу відповідальних субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів та макрофагів при формуванні імунної відповіді на введення протисальмонельозної вакцини та після зараження курчат Salmonella enteritidis).

6. Застосування методів імуногістохімії при вивченні сальмонельозу птиці / Г. Красніков, П. Шутченко, А. Берндт, У. Метнер // Ветеринарна медицина України. - 2004. - №12. - С.8-9. (Дисертант провів дослідження з вивчення сальмонельозу птиці із застосуванням імуногістохімічного методу міченого стрептавідин-біотину).

7. Динамика маркированных иммунокомпетентных клеток селезенки и фабрициевой бурсы после введения штаммов S. enteritidis с различной патогенностью / А. Берндт, У. Метнер, Г.А. Красников, П.А. Шутченко // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х.,2005. - Т.1., Вип.85. - С.112-121. (Дисертант провів дослідження з вивчення динаміки змін субпопуляцій Т-і В-лімфоцитів та макрофагів в селезінці та бурсі Фабриціуса із застосуванням фмуногістохімічної детекції стрептавідин-біотиновим методом.

8. Красников Г.А., Шутченко П.А. Субпопуляции иммунокомпетентных клеток в селезенке и фабрициевой бурсе SPF-цыплят // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х.,2005. - Т.1., Вип.85. - С.608-611. (Дисертант дослідив відсотковий вміст показових маркерів імунокомпетентних клітин у SPF курчат у період з 1-ї по 13-у доби після виведення).

9. Фабрициева бурса как индикаторный орган при гистологическом изучении состояния иммунитета у кур / Г.А. Красников, Е.А. Медведь, П.А. Шутченко и др. // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных. - Воронеж, 2006. - С.141-147. (Дисертант дослідив імунну активність фабрицієвої бурси за допомогою імуногістохімічного методу).

10. Шутченко П., Красніков Г. Імуногістохімічне вивчення клітинного імунітету при сальмонельозі курчат // Ветеринарна медицина України. - 2006. - №7. - С.26-27. (Дисертант вивчив зміни субпопуляцій клітин імунітету курей до 51-денного віку).

11. Гистологическое, иммуногистохимическое и морфометрическое изучение фабрициевой бурсы у кур / Г.А. Красников, Е.А. Медведь, П.А. Шутченко, В.Б. Гурьева // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х.,2006. - Вип.86. - С.206-210. (Дисертант визначив вміст девяти основних субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів та макрофагів у бурсі Фабриціуса).

12. Шутченко П.О., Красніков Г.А. Динаміка кластерів імунітету при сальмонельозі курчат //Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: Зб. наук. праць. - Х.,2006. - Вип.13.- Ч.2. - С.253-256. (Дисертант вивчив особливості формування імунітету при зараженні курчат сальмонельозом та після щеплення атенуйованою вакциною).

13. Шутченко П.О. Імуногістохімічний метод діагностики сальмонельозу курей // Ветеринарна медицина: Міжвід.темат.наук.зб. - Х.,2007. - Вип.88. - С.268-272.

14. Патент 25815 Україна МПК G01N33/00 Спосіб імуногістохімічної діагностики сальмонельозу курей / Г. А. Красніков, Б. Т. Стегній, П. О. Шутченко; ННЦ "ІЕКВМ"; Заявлено 30.03.2007; Опубл. 27.08.2007, Бюл. № 13.

15. Патент 26855 Україна. Імуногістохімічний спосіб експертизи мяса і продуктів забою птиці на контамінованість сальмонелами.