Іммобілізована на кремнеземах галактозооксидаза: одержання, властивості та застосування - Автореферат

Проте обмежене використання галактозооксидази для аналітичного визначення галактозовмісних вуглеводів в значній мірі визначається високою вартістю ферменту (виділяється головним чином з грибів Fusarium graminearum, Polyporus circinatus та Dactyllium dendroides) і його низькою стабільністю. Дисертаційна робота виконувалася в Інституті хімії поверхні НАН України у відповідності з науково-дослідними тематиками держбюджетних тем: “Спрямовані синтези в поверхневому шарі дисперсних оксидів та вуглецевих адсорбентів з метою одержання прищеплених каталізаторів та вибіркових поглиначів токсичних речовин із біологічних рідин” (№ державної реєстрації 30023851), “Хімічне та геометричне модифікування кремнезему та вуглецевих матеріалів з метою одержання селективних адсорбентів і активних іммобілізованих препаратів” (№ державної реєстрації 01840049114), “Синтез та хімічні перетворення поверхневих структур оксидів кремнію, алюмінію, титану та їхніх композицій” (№ державної реєстрації 0199U002301), “Теоретичні дослідження і розробка лікарських композитів з сорбційним механізмом дії і регульованою фармакокінетикою” (№ державної реєстрації 0199U002299) та “Закономірності адсорбційної взаємодії та хімічних перетворень на поверхні дисперсних оксидів в суспензіях біоактивних молекул, полімерів, клітин та мікроорганізмів” (№ державної реєстрації 0103U006286) та у рамках комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”. Мета роботи полягала в розробці методів іммобілізації галактозооксидази на поверхні вихідного і модифікованих кремнеземів, вивченні впливу ряду ефекторів, а саме: ферріціаніду калію, натрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти та іонів міді(ІІ) на стабільність і активність гетерогенних біокаталізаторів, одержанні препаратів, які придатні для визначення галактози і галактозовмісних вуглеводів у складних сумішах, а також для синтезу гліцеринового альдегіду ферментативним шляхом. одержати активні і стабільні препарати галактозооксидази, ковалентно закріпленої на поверхні хімічно модифікованих кремнеземів; Одержано активні препарати галактозооксидази, адсорбованої на поверхні кремнеземних матриць, та встановлено, що при певних співвідношеннях фермент/носій можна створити препарати, що мають суттєво вищу (~ у 20 разів) активність порівняно із нативним біокаталізатором.У першому розділі дисертації проведено огляд літературних даних щодо способів іммобілізації ферментів, властивостей оксидоредуктаз і, зокрема, галактозооксидази. Наведено дані щодо методів звязування ферментів з поверхнею вихідних неорганічних носіїв, а також способів іммобілізації ферментів на функціональних органокремнеземах. Дослідження препаратів галактозооксидази, закріпленої на поверхні кремнезему хімічними звязками, показують (таблиця 3), що у випадку використання для іммобілізації розчинів галактозооксидази з активністю 12-80 од., одержані гетерогенні препарати зберігають 100-75% вихідної активності. Залежність активності сорбованого на вихідному силохромі ферменту від концентрації розчинної галактозооксидази (для сорбції галактозооксидази змішували 10 мл розчину біокаталізатора з активністю 0,1-2,5 од. та 1 г вихідного кремнезему; суміш інкубували протягом 2 год. при кімнатній температурі). Залежність активності сорбованої на вихідному силохромі галактозооксидази від РН (змішували 10 мл розчину біокаталізатора з активністю 0,98 од. з 1 г вихідного кремнезему у 0,05 М буферах із різними значеннями РН; суміш інкубували протягом 2 год. при кімнатній температурі). активність ферменту у вихідному розчині, од./мл Співвідношення фермент/носій при адсорбції, од./г РН буферу Активність гетерогенного препарату, од./гЯк свідчить аналіз літературних даних, іммобілізацію галактозооксидази на поверхні неорганічних носіїв досліджено недостатньо. Встановлено, що адсорбція галактозооксидази на поверхні кремнезему при певних співвідношеннях фермент/носій призводить до одержання препаратів, активність яких суттєво (у 20 разів) перевищує активність нативного біокаталізатора. Показано, що продукт ферментативної реакції окиснення галактози (2,4-галактогексодіальдоза) є ефективним зшиваючим реагентом, що дозволяє здійснити ковалентне звязування ферменту з носієм через аміногрупу поверхні. Це дозволило розробити зручний одностадійний метод “самоіммобілізації” галактозооксидази на поверхні аміноорганокремнеземів з одержанням препаратів, активність яких є вищою у порівнянні із ферментом, закріпленим на активованих кремнеземних матрицях.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Як свідчить аналіз літературних даних, іммобілізацію галактозооксидази на поверхні неорганічних носіїв досліджено недостатньо. Разом із тим гетерогенні препарати цього важливого мідьвмісного біокаталізатора є перспективними для використання в тонкому органічному синтезі і для аналітичного визначення галактози та інших галактозовмісних вуглеводів.

2. Встановлено, що адсорбція галактозооксидази на поверхні кремнезему при певних співвідношеннях фермент/носій призводить до одержання препаратів, активність яких суттєво (у 20 разів) перевищує активність нативного біокаталізатора. Препарати стабільні при промиванні буферними розчинами з РН=4,5-8,2.

3. З використанням аміновмісних кремнеземів, активованих хлористим ціануром або 2,4-толуілендіізоціанатом, одержано активні та стабільні препарати галактозооксидази, що закріплені на поверхні носія за допомогою ковалентних звязків.

4. Показано, що продукт ферментативної реакції окиснення галактози (2,4-галактогексодіальдоза) є ефективним зшиваючим реагентом, що дозволяє здійснити ковалентне звязування ферменту з носієм через аміногрупу поверхні. Це дозволило розробити зручний одностадійний метод “самоіммобілізації” галактозооксидази на поверхні аміноорганокремнеземів з одержанням препаратів, активність яких є вищою у порівнянні із ферментом, закріпленим на активованих кремнеземних матрицях.

5. Досліджено вплив ефекторів на властивості нативної та іммобілізованої галактозооксидази. Показано, що максимальна активність та стабільність гетерогенних препаратів ферменту досягається при неперервному прокачуванні через проточний реактор буферного розчину, що містить CUCL2 та Na-ЕДТА, та при умові введення в розчин субстрату K3[Fe(CN)6].

6. Створено проточно-інжекційну систему, що містить іммобілізовану галактозооксидазу та проточний кисневий електрод Кларка, для аналізу субстратів ферменту в розчині. Встановлено, що області лінійної зміни відгуку аналітичної системи від концентрації субстрату становлять: для галактози 2 - 20 ммоль/л, для лактози 5-100 ммоль/л і для раффінози 0,1-2,0 ммоль/л.

7. Показано можливість застосування іммобілізованої галактозооксидази для визначення галактозовмісних вуглеводів в складних сумішах, зокрема в молочних продуктах дитячого харчування і продуктах цукрового виробництва. Гетерогенні препарати перспективні також для одержання гліцеринового альдегіду ферментативним окисненням гліцерину.

1. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Королева О.В. Некоторые свойства галактозооксидазы из Fusarium graminearum ИМВ-F-1060, иммобилизованной на аминоорганокремнеземах // Укр. биохим. журн. - 1984 - т.56, № 4. С. 394-398.

Здобувачем одержано препарати галактозооксидази, іммобілізованої на аміноорганокремнеземах, модифікованих за допомогою 2,4-толуілендіізоціанату і хлорангідриду ціанурової кислоти, вивчено субстратну специфічність, РН-залежність і стабільність одержаних препаратів.

2. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Скоробагатько О.В. Влияние феррицианида калия и ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // Укр. биохим. журн. - 1988 - т.60, № 6. С. 34-38.

Здобувачем вивчено вплив ферріціаніду калію іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованої галактозооксидази у проточно-інжекційній системі. Порівняно властивості розчинної та іммобілізованної галактозооксидази.

3. Кондакова Л.В. Свойства галактозооксидазы в иммобилизизованном и растворимом состоянии. Материалы конференции молодых ученых химического факультета МГУ, ч.2, М.: МГУ, 1989. - С.81-85. - Деп. в ВИНИТИ, 08.08.89, №5358-В89.

Здобувачем вивчено вплив натрієвої солі ЕДТА на активність розчинної та іммобілізованної на кремнеземі галактозооксидази

4. Kondakova L.V., Yanishpolskii V.V., Tertykh V.A., Adsorption and chemisorption of galactose oxidase on silica surface // Chemistry, Physics and Technology of Surfaces. - Kyiv: KM Academia. - 2002. - Iss. 7-8. - P. 150-157.

Здобувачем розроблено метод одержання активних та стабільних препаратів адсорбованої галактозооксидази.

5. Кондакова Л.В., Янишпольський В.В., Тьортих В.А. Адсорбційна та ковалентна іммобілізація галактозооксидази на кремнеземніх носіях // Збірник наукових праць “Фізико-хімія конденсованих систем і міжфазних границь”, Київ: ВПЦ “Київський університет” - 2005. - С. 46-51.

Здобувачем розроблено оптимальні умови для одержання гетерогенізованих препаратів галактозооксидази.

6. А. с. 1521775 СССР Способ получения иммобилизованой галактозооксидазы/ Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т., Скоробагатько О.В. Опубл. 1987, Бюл. № 42. - 3 с.

Здобувачем розроблено спосіб ковалентної іммобілізації галактозооксидази на поверхні аміновмісного кремнезему за допомогою продуктів ферментативної реакції (2,4-галактогексодіальдоза). Підібрано оптимальні співвідношення компонентів для одержання максимально активних препаратів.

7. А. с. 1723124 СССР Способ иммобилизации галактозооксидазы / Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т. Опубл. 1991, Бюл. № 12. - 3 с.

Здобувачем запропоновано і розроблено спосіб іммобілізації галактозооксизази на вихідному силохромі з метою одержання активних препаратів гетерогенного біокаталізатору.

8. А. с. 1742326 СССР Способ активации галактозооксидазы / Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А., Буглова Т.Т. Опубл. 1992, Бюл. № 23. - 4 с.

Здобувачем запропоновано і розроблено спосіб активації біокаталізатору шляхом введення активатора в розчин ферменту.

9. Кондакова Л.В. Повышение стабильности галактозооксидазы из Fusarium graminearum ИМВ-F-1060 при иммобилизации на неорганических матрицах. // IV Всесоюзный симпозиум ”Инженерная энзимология”. - Москва, май 1983. - С.26.

Здобувачем вивчено стабільність препаратів іммобілізованної галактозооксидази.

10. Кондакова Л.В., Королева О.В., Буглова Т.Т. Аналитическое использование галактозооксидазы // IV Всесоюзный симпозиум ”Инженерная энзимология”. - Москва, май 1983. - С. 27.

Здобувачем досліджено можливість аналітичного використання галактозооксидази у біотехнологіі.

11. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Буглова Т.Т. Исследование влияния сорбции ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // V Всесоюзный симпозиум поинженерной энзимологии. - Кобулетти. - 1985. - С. 65.

Здобувачем детально досліджено вплив іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованної галактозооксидази.

12. Кондакова Л.В. Иммобилизация галактозооксидазы на активированных аминоорганокремнеземах // Школа-семинар по химии поверхности дисперсных твердых тел. - Славско - 1987, март - С. 52.

Здобувачем розроблено методи ковалентного звязування ферменту з носієм через аміногрупи поверхні.

13. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В. Влияние сорбции ионов меди(ІІ) на свойства иммобилизованной галактозооксидазы // Школа-семинар по химии поверхности дисперсных твердых тел. - Славско - 1989, март 6-9. - С. 76.

Здобувачем вивчено вплив іонів міді(ІІ) на властивості іммобілізованної галактозооксидази в проточно-інжекційній системі.

14. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А. Иммобилизация галактозооксидазы на исходных и модифицированных кремнеземных матрицах // ІІІ Международная конференция “Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии”. Авторефераты докладов. - С.-Петербург, 2001, 24-29 июня. - С. 303-306.

Здобувачем розроблено методи іммобілізації галактозооксидази на вихідному кремнеземі, підібрано оптимальні умови для одержання активних та стабільних препаратів.

15. Kondakova L.V., Tertykh V., Yanishpolskii V., Adsorption and covalent immobilization of galactose oxidase on silica matrices // Proceedings of VII Polish-Ukrainian Symposium on Theoretical and Experimental Studies of Interfacial Phenomena and their Technological Applications. - Lublin. - 2003. - P. 115-116.

Здобувачем вивчено властивості одержаних препаратів гетерогенного біокаталізатора.

16. Кондакова Л.В., Янишпольский В.В., Тертых В.А. Влияние эффекторов на активность и стабильность препаратов иммобилизованной галактозооксидазы // Тезисы Межд. конф. “Функционализованные материалы: синтез, свойства и применение”. - Киев. - 24-29 сентября 2002 г. - С. 110.

Здобувачем детально вивчено концентраційні межі, в яких спостерігається максимальна активність і стабільність препаратів іммобілізованної галактозооксидази.

17. Тьортих В.А., Янишпольський В.В., Кондакова Л.В., Кліщар І.В. Іммобілізовані на кремнеземних матрицях органічні ліганди і біокаталізатори для чутливих елементів сенсорних систем // Конференція-звіт з Комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”. - Київ, 2-3 лютого. - 2005. - С. 24.

Здобувачем запропоновано метод визначення галактозовмісних вуглеводів у розчинах з використанням іммобілізованого ферменту.