Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов - Статья

Для многих целей и прежде всего для структурных исследований белков биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения аминокислот, меченных стабильными изотопами, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений. Данный метод в сочетании с обращенно-фазовой ВЭЖХ хорошо зарекомендовал себя для исследования уровня изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их мультикомпонентных смесей, каковыми являются препараты культуральных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот и гидролизаты белков, полученные со сред, содержащих стабильные изотопы. В отличие от культивирования на 2Н2О-среде, где необходимо проводить клеточную адаптацию к дейтерию, при получении [13С]аминокислот за счет утилизации 13СН3ОН данный этап не является обязательным, поскольку этот изотопный субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые характеристики метилотрофов (см. табл. Основные этапы при выделении [2H]-и [13С]-аминокислот заключались в выращивании штаммов-продуцентов на средах с мечеными субстратами - (2Н)метанолом, (13С)метанолом и 2Н2О или L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланином, L-[3,5-2Н]тирозином и L-[2,4,5,6,7-2Н]триптофаном (бактериородопсин), отделении культуральных жидкостей, содержащих секретируемые аминокислоты, от микробной биомассы, разрушении клеток, выделении фракции суммарных белков биомассы и бактериородопсина с последующим их гидролизом, дериватизации смесей аминокислот дансилхлоридом, бензилоксикарбонилхлоридом и диазометаном, разделении метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот и N-Cbz-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, масс-спектрометрии электронного удара полученных производных аминокислот. Для получения летучих производных аминокислоты переводили в метиловые эфиры N-Dns-аминокислот или N-Cbz-аминокислоты, которые затем разделяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ.

1. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology. 1992. V. 263. ?. 1. P. 214-220.

2. MCINTOSH L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 1-38.

3. Young V. R., Tu Y. M., Krempf M. //New techniques in nutritional research/ Ed. Whitehead R. G. New York. Academic Press. 1990. V. 9. P. 17-72.

4. Fesic S. W. & Zuiderweg E. R. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. ? 2. P. 97-131.

5. Haris P. I., Robillard G. T., Vandijk A. A., Chapman D. // Biochemistry. 1992. V. 31. ? 27. P. 6279-6284.

6. Rothschild K. J., Braiman M. S., Yi-Wu He., Marti T. and Khorana H. G. // J. of Biological Chemistry. 1990. V. 121. P. 16985-16990.

7. Raap J., Winkel C., de Wit A. H. M., van Houten A. H. H., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Anal. Biochem. 1990. V. 191. P. 9-18.

8. Stockman B. J., Reily M. D., Westler W. M., Ulrich E. L., Markley J. L. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 230-236.

9. Ellman J. A., Volkman B. F., Mendel D. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7959-7961.

10. Redfield C. , Dobson C. M. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 122-136.

11. Zuiderweg E. R. P., MCINTOSH L. P., Dahlquist F. W., Fesik S. W. // J. Magn. Reson. 1986. V. 2. P. 210-216.

12. Hruby V. J. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. 1985. V. 4. P. 287-292.

13. Berger A., Smolarsky M., Kurn N., Bosshard H. R. // J. Org Chem. 1973. V. 38. P. 457-460.

14. Raap J., Wolthuis W. N. E., Hehenkamp J. J. J., Lugtenburg J. // Amino Acids. 1995. V. 8. P. 171-186.

15. Lugwig S. N., Unkefer C. J. // J. Labelled Compd. Radiopharm. 1992. V. 31. P. 95-102.

16. van der Berg E. M. M., van Liemt J. H., Willem B. S. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ? 9. P. 304-313.

17. MCINTOSH L. P., Griffey R. H., Muchmore D. C., Nielson C. P., Redfield A. G., Dahlquist F. W. // Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1244-1248.

18. Karnaukhova E. N., Reshetova O. S., Semenov S. Y., Skladnev D. A., Tsygankov D. Y. // Amino Acids. 1994. V. 6. ? 2. P. 165-176.

19. Katz J. J., Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. 1972. V. 32. P. 221-250.

20. Patel G. B., Sprott G. D., Ekiel I. // Applied and Environmental Microbiology. 1993. P. 1099-1103.

21. LEMASTER D. M., Cronan J. E. // Journal of Biological Chemistry. 1982. V. 257. ? 3. P. 1224-1230.

22. LEMASTER D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 133-174.

23. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. 1993. N. 9. С. 16-20.

24. Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. // Биотехнология. 1993. N. 8. С. 45-50.

25. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ? 3. С. 3-12.

26. Stoeckenius W., Bogomolni R. A. // Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 587-616.

27. Первушин К. В., Арсеньев А. С. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. ? 2. С. 83-111.

28. Steel J. C. H., Reynolds J. A. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1633-1638

29. Звонкова Е. Н., Зотчик Н. В., Филлипович Е. И., Митрофанова Т. К., Мягкова Г. И., Серебренникова Г. А. // Химия биологически активных природных соединений. М.: Химия, 1970. С.65-68.

30. Cohen J. S., Putter I. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 222. P. 515-520.

31. Egorova T. A., Eremin S. V., Mitsner B. I., Zvonkova E. N., Shvets V. I. // Journal of Chromatography B. 1995. V. 665. P. 53-62.

32. Daniely B. // J. Org. mass spectrometry. 1989. V. 24. P. 225-229.

33. Физер Л. Ф., Физер М. // Реагенты для органического синтеза. М.: Мир, 1971. Т. 2. С. 92.

34. Griffiths D. V., Feeney J., Roberts G. C., Burgen A. S. // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. V. 446. P. 479-585.

35. Matthews H. R., Kathleen S., Matthews K. and Stanley J. // Biochim. et Biophys. Acta. 1977. V. 497. P. 1-13.

36. Miller J. H. // Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1976. P. 393.

37. Oesterhelt D., Hess B. // Eur. J. Biochem. 1973. V.37. ?.1. P. 316-326.

38. Tokunada F., Ebrey T. // Biochemistry. 1978. V.17. ?.10. P. 1915-1922..

39. Oesterhelt D., Stoeckenius W. // Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 660-668.

40. Bligh E. G., Dyer W. J. // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. ?. 8. P. 911-918.

41. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ? 4. С. 27-32.

MASS-SPECTROMETRY EVALUATION OF 2H AND 13C ENRICHMENT LEVELS OF AMINO ACIDS, OBTAINED FROM BACTERIAL OBJECTS

O.V.MOSIN

M. V. Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow, 117571

The high-sensitive method of electron impact mass-spectroscopy was employed for evaluation of 2H and 13C enrichment levels of secreted amino acids of methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum and Methylobacillus flagellatum, and amino acid resigues of total protein obtained from media contaning as a sourse of stable isotopes (2H)methanol, (13C)methanol and 2H2O. The incorporation of L-[2,3,4,5,6-2Н]phenylalanine, L-[3,5-2Н]tyrosine and L-[2,4,5,6,7-2Н]tryptopan in bacteriorhodopsin synthesised in membrane of halophilic bacterium Halobacterium halobium ET 1001 was also made. For mass-spectrometric analysis the multicomponential mixures of amino acids, derived from cultural media and protein hydrolysates after hydrolysis in 6 M 2HCL (3% phenol) and 2 M Ва(OH)2 were modified to N-benzyloxycarbonyl-derivatives of amino acids as well in methyl esters of N-dansyl-derivatives of amino acids which were preparative separated using a method of reverse-phase high column liquid chromatography (HCLP). [2H]- and [13C]amino acids obtained represented the mixures differing in quantities of isotopes incorporated into molecule. The levels of 2H and 13С enrichment of secreted amino acids and amino acid resigues of protein were found to vary from 10% to L-leucine/isoleucine up to 97.5% for L-alanine depending on concentration of labelled substrates.