Критерии идентификации электрофоретического спектра для целей сортового контроля и сертификации - Статья

Насыщение современного сельскохозяйственного рынка, полноценное осуществление всех степеней защиты прав патентообладателей на сорта, введение процедуры сертификации семенного материала является предпосылкой к тому, что реализация некачественных семян, фальсификация сортов становится невозможной ввиду полноценного, объективного контроля и применения санкций к недобросовестным поставщикам семян. Сортовую идентификацию на основе электрофоретического разделения белков, как правило, проводят путем анализа единичных зерен с колоса, растения или в случайной выборке из партии семян. Для того чтобы идентифицировать сорт, необходимо иметь оригинальные семена всех районированных сортов, каталоги, базы данных спектров, максимально охватывающие генетическое разнообразие культуры или в целом вида, в том числе всех допущенных к использованию сортов [6, 7]. Первый основан на определении относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) каждого белкового компонента на электрофоретическом спектре анализируемого образца или относительно отдельных «маркерных» компонентов какого-либо стандартного сорта, или относительно компонентов «эталонного» спектра, полученного при электрофорезе смеси белков сортов различных культур [10, 11]. Второй подход основан на знании наследования и генетического контроля запасных белков и заключается в простом визуальном сравнении типов совместно наследуемых компонентов (блоков компонентов), или с эталонным спектром (спектрами) данного сорта, или с каталогом типов блоков компонентов [4, 12].Проанализированные подходы могут быть использованы в системе идентификации белковых компонентов спектра в условиях SDS-электрофореза.

Сортимент сельскохозяйственных культур, включенных в государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород, ежегодно пополняется новыми, высокопродуктивными формами, сохранение и контроль качества которых является обязательным, начиная с питомников семеноводства и заканчивая производственными посевами. В современных экономических условиях именно качество семян является главной составляющей их включения в оборот, сферой взаимных интересов патентообладателя сорта, продавца и потребителя. Насыщение современного сельскохозяйственного рынка, полноценное осуществление всех степеней защиты прав патентообладателей на сорта, введение процедуры сертификации семенного материала является предпосылкой к тому, что реализация некачественных семян, фальсификация сортов становится невозможной ввиду полноценного, объективного контроля и применения санкций к недобросовестным поставщикам семян. Однако выполнение задач по объективной идентификации сортов, оценке их сортовых качеств требует применения точных и быстрых методов.

Идентификацию видов, семейств растительных организмов традиционно проводили на основе комплекса морфологических признаков. По аналогии с онтогенетическими свойствами они являлись объектом сельскохозяйственной биологии и селекции растений. Именно на их основе проводится анализ генофонда популяции, оценивается генетическое разнообразие и целый ряд подобных оценок растительной популяции. Вместе с тем данные признаки находятся в большой зависимости от воздействия окружающей среды, в силу чего бывает очень трудно отличить фенотипическую или морфологическую изменчивость от генотипической изза недостатка маркерных признаков и систем. Кроме этого, генетически близкие сорта (чаще всего сорта, имеющие в родословной родительские формы с высокой сортообразующей способностью) имеют труднодифференцируемые морфологические показатели, что затрудняет их однозначную идентификацию. Только с момента появления методов молекулярного маркирования стало возможным использовать практически неограниченное количество потенциальных маркеров. Наиболее удобным для целей сортовой сертификации и селекции представляется метод молекулярного маркирования на основе запасных белков семян - электрофоретический анализ.

Правовая актуализация применения метода электрофоретического анализа для контроля качества семян в рамках сертификации на территории Республики Беларусь в полной мере была осуществлена с момента внесения изменений в СТБ 1073-97«Семена зерновых культур. Сортовые и посевные качества. Технические условия» [1]. Внесенные изменения регламентировали применение данного метода оценки сортовых качеств семян как законного метода сортового контроля и сертификации, однако в то же время обусловили ряд вопросов, а именно: поиск идентификационных критериев белкового электрофоретического спектра для унификации и правомерности использования в системе сортового контроля, наиболее оптимальные алгоритмы в оценке сортовой чистоты и сортовой идентификации.

Анализ источников

Относительно растительных систем понятие идентификации подразумевает установление критериев и соответствия отдельного объекта (генотипа, линии, биотипа, сорта) соответствующим справочным данным для известных объектов этого же вида [2]. Для облегчения идентификации, оптимизации ее проведения организуют специальные «банки» (генетические, молекулярные, морфологические и др.), благодаря которым возможно проведение сравнительного анализа и идентификации растительного организма.

Сортовую идентификацию на основе электрофоретического разделения белков, как правило, проводят путем анализа единичных зерен с колоса, растения или в случайной выборке из партии семян. В данном случае размер анализируемой выборки и способ интерпретации результатов электрофореза определяется структурой сорта, которая обусловлена рядом причин и прежде всего способом размножения. В связи с этим способы сортовой идентификации для самоопылителей и перекрестноопыляющихся культур существенно отличаются.

«Сортовая чистота», «подлинность», «оригинальность» - характеристики, для оценки которых пригодны методы, прошедшие всесторонние испытания и зарекомендовавшие себя на практике [3, 4, 5].

Как свидетельствуют имеющиеся данные [4, 5], наиболее распространенной ошибкой в области практического использования метода молекулярных маркеров является смешение понятий «идентификация сорта» и «дифференциация сортов», или их различение. Идентифицировать сорт (генотип, гибрид, линию, клон) - значит гарантированно узнать его с использованием метода в любой ситуации. Для того чтобы идентифицировать сорт, необходимо иметь оригинальные семена всех районированных сортов, каталоги, базы данных спектров, максимально охватывающие генетическое разнообразие культуры или в целом вида, в том числе всех допущенных к использованию сортов [6, 7].

Одним из наиболее важных моментов, который следует учитывать при проведении сортовой идентификации и определении чистосортности семян, является генетическая гетерогенность сортов. Критерием гетерогенности на уровне запасных белков служит отсутствие единообразия белковых спектров в исследуемом образце того или иного сорта [8, 9].

В интерпретации и регистрации (записи) электрофоретических спектров белков существует несколько принципиально различных подходов. Первый основан на определении относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) каждого белкового компонента на электрофоретическом спектре анализируемого образца или относительно отдельных «маркерных» компонентов какого-либо стандартного сорта, или относительно компонентов «эталонного» спектра, полученного при электрофорезе смеси белков сортов различных культур [10, 11].

Второй подход основан на знании наследования и генетического контроля запасных белков и заключается в простом визуальном сравнении типов совместно наследуемых компонентов (блоков компонентов), или с эталонным спектром (спектрами) данного сорта, или с каталогом типов блоков компонентов [4, 12].

Международная ассоциация по контролю за качеством семян (ISTA) предлагает использовать в качестве стандарта при записи и интерпретации электрофореграмм анализируемых сортов спектр сорта Atem. Этот стандарт должен присутствовать в каждом опыте (в каждой пластине геля при электрофорезе). Затем рассчитывать относительную электрофоретическую подвижность «наиболее четких компонентов» анализируемых образцов относительно маркерных компонентов стандарта [5].

Методики, разработанные ВИРОМ [3, 13, 14], предлагают использовать для записи электрофореграмм эталонный спектр, полученный при электрофорезе смеси глиадинов пшеницы, гордеинов ячменя и авенинов овса. Эталонный спектр разделен на зоны ?, ?, ?, ?, и в каждой зоне компоненты пронумерованы. Задача состоит в том, чтобы анализируемые спектры сравнить с эталонным, указать номера совпадающих компонентов, а также отметить их большую или меньшую интенсивность, указать цифровым индексом смещение сравниваемого компонента относительно стандартного.

Для оптимизации процедур идентификации результатов электрофореза активно применяются методы, основанные на использовании цифровых устройств - систем гель-документирования в комплексе с программным обеспечением, денситометров [15, 16, 17, 18]. Однако в данном случае для корректного сравнения полученного результата с «эталонным» уровнем в программный пакет должны быть внесены как можно больше вариантов сочетаний компонентов представителей анализируемого вида, методики должны обладать очень высокой воспроизводимостью результатов.

Методы исследования

Проведение всех процедур, предусмотренных методиками электрофоретического анализа, отработка алгоритмов и критериев идентификации белковых компонентов проводились в Испытательной лаборатории качества семян УО БГСХА (аттестат аккредитации №BY/112 02.1.0.0425 от 15.03.2004 г.).

В качестве метода исследований применялся метод электрофоретического фракционирования запасных белков согласно методикам определения как включенных в область аккредитации лаборатории, так и разрабатываемых коллективом лаборатории.

В качестве материала для исследований использовались семена сельскохозяйственных культур районированных сортов.

Отработка идентификационных критериев белковых спектров, анализ существующих подходов в этой области проводились с использованием обновленной, модернизированной и поверенной (аттестованной) приборно-технической базы Испытательной лаборатории качества семян.

В качестве маркеров молекулярных масс для точной оценки белковых компонентов использовались стандартные маркер-растворы белков «Thermo Scientific» - Unstained Protein Ladder (диапазон 10-150 КДА, число идентифицируемых белков 8). электрофоретический белковый сортовой зерновой

Основная часть

Результаты, используемые для оценки базовых критериев идентификации белкового электрофоретического спектра, были получены в рамках практической деятельности Испытательной лаборатории качества семян в системе сортового контроля, осуществляемого в Республике Беларусь. Основываясь на специфике работы, предъявляемым требованиям к процедуре оценки сортовой чистоты с использованием метода электрофоретического анализа запасных белков семян, были оценены, отработаны имеющиеся подходы в данной области. Причем отработка имеющихся подходов и адаптация их к специфике сортового контроля проводилась по группам сельскохозяйственных растений, имеющих отличия как по типу используемых белковых систем, так и по своим генетико-селекционным особенностям.

Идентификация белковых компонентов спектра, основанная на оценке их относительной электрофоретической подвижности, позволила выявить объективность данного метода вне зависимости от условий проведения анализа. В целом особенности данного метода идентификации можно выразить рядом базовых позиций: - применение данного метода возможно только в случае полного нивелирования собственного заряда белковой молекулы, что недостижимо в условиях стандартного нативного гель-электрофореза;

- в случае использования «маркерных» позиций (белковых компонентов) какого-либо сорта первоначальный анализ последнего следует проводить в условиях градации компонентов только по их молекулярному весу;

- создание «общего», одинакового заряда белковых молекул возможно только в условиях, создаваемых при использовании электрофореза в комплексе с ДДСNA (додецилсульфат натрия). Именно в данных условиях будет наблюдаться прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой белка и их относительной подвижностью;

- на основе использования данного метода возможно оценить как молекулярные массы неизвестных белков (позиций белкового спектра), так и относительную электрофоретическую подвижность на основе обратного калибровочного графика.

Определение молекулярных масс белков по подвижности осложняется различиями в их зарядах, связанных с различиями в первичной структуре. Нивелирование этих различий достигается при образовании комплексов белков с додецилсульфатом натрия (ДСН или SDS) (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат)

Примечание. 1 - сывороточный альбумин; 2 - яичный альбумин; 3 - пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 - миоглобин; 6 - цитохром с; Х - белок с неизвестной молекулярной массой.

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия, приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью гель-электрофореза белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что электрофоретическая подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму ее молекулярной массы и выражается линейной зависимостью.

Для применения данного метода идентификации компонентов необходимо использовать калибровочные наборы белков с известной молекулярной массой. Однако это также не является полной гарантией получения линейной зависимости молекулярной массы от подвижности компонента. Как установлено в наших исследованиях, только использование правильных рабочих стоковых растворов формирует такую молекулярную решетку гелевого носителя, в которой эффект разделения белковых компонентов прямо пропорционален их молекулярной массе.

В ходе практической работы вышеуказанная методика используется нами для идентификации белковых компонентов 11S-глобулинов зернобобовых культур и построения калибровочных спектров по пшенице, ячменю, овсу, тритикале.

Согласно методике определения для семян зернобобовых культур [17], для идентификации белковых компонентов используется «скользящая соевая шкала», градуированная с учетом условий хода фракционирования белков и позволяющая идентифицировать компоненты в виде сортовой белковой формулы. В качестве реперных позиций компонентов рекомендуется использовать стабильный спектр, полученный на основе фракционирования белков культурной сои. Однако именно на данном этапе нередко возникают затруднения с правильной идентификацией маркерных компонентов спектра сои, что может повлиять на результативность анализа в дальнейшем.

Вместе с тем возможно точное нахождение относительной электрофоретической подвижности неизвестных компонентов, если использовать калибровочный график, построенный для данного типа гелевого носителя с использованием тех маркеров молекулярного веса (набора стандартных белков), размах величин молекулярного веса которых перекрывает размах оцениваемых белков примерно на 10-20 КДА.

Определив таким образом относительную подвижность стандартных белков, возможно точное определение этого же параметра и у реперных позиций белкового спектра сои.

В отношении запасных белков зерновых возможно применение такой же модели на этапе построения калибровочного спектра сорта-стандарта, на основе реперных компонентов которого можно идентифицировать остальные позиции спектра. Однако в данном случае следует делать поправку с учетом того, что оценка подвижности реперных компонентов происходит в системе SDS-электрофореза, а фракционирование испытываемых проб - в алюминий-лактатном буфере (РН 3,1-3,3), где накладывается эффект собственного заряда белковых молекул.

Для определения относительной электрофоретической подвижности также можно использовать метод, практикующийся в гель-хроматографии, активно используемый в целом ряде биохимических лабораторий. Суть этого метода основана на специфике маркерного лидирующего красителя, добавляемого совместно с буфером нанесения к экстракту фракционируемого белка, что выражается в гораздо большей подвижности маркера в сравнении с самым быстроподвижным белковым компонентом белка.

В целом принцип идентификации спектра основан на сопоставлении относительной электрофоретической подвижности оцениваемого белкового компонента и подвижности лидирующего красителя (рис. 2).

Рис. 2. Критерии идентификации белковых компонентов электрофоретического спектра пшеницы и тритикале

Примечание. Rf (а) - расстояние, пройденное лидирующим красителем;

Rf (b) - расстояние, пройденное белковым компонентом.

В данном случае значение относительной подвижности белкового компонента вычисляют по формуле

Rf = (Rpr / Rcol) • 100, (1) где Rf - относительная подвижность белкового компонента;

Rpr - расстояние, пройденное белковым компонентом от стартового кармана геля (мм);

Rcol - расстояние, пройденное лидирующим красителем от стартового кармана геля (мм).

Значение Rcol при оптимальных условиях электрофоретического фракционирования, как правило, совпадает с размером гелевой пластины, на которой проводят разгонку белка. Идентифицированные значения относительной подвижности (с коэффициентом равным 100) по отдельным белковым компонентам будут соответствовать порядковому номеру позиции.

Таким образом, описанные выше способы идентификации белковых компонентов позволяют наиболее четко оценить компонентную представленность анализируемого образца, его внутреннюю структуру (полиморфность или однородность), сформировать «белковую формулу» для целей составления каталога. Вместе с тем использование данных подходов в системе сортовой идентификации допустимо только в случае наработок в виде комплексного каталога, включающего максимально большое число вариантов сочетаний компонентного состава (сортовых белковых формул и электрофоретических спектров сортов и их белковых биотипов). Определенные трудности в данном случае вызывает идентификация форм перекрестноопыляемых культур или культур, имеющих сложную генетическую природу (тритикале, сахарная свекла), в связи с тем что внутренняя структура, определяемая методом электрофореза, представлена не двумя-тремя белковыми биотипами, а гораздо большим числом (иногда превышающим 10-12 биотипов). В таком случае довольно сложно идентифицировать сортовую принадлежность образца путем сравнения со всеми возможными биотипами. Для таких вариантов рекомендуется использовать калибровочный график на основе стандартных белков и на его основе определять подвижность (а, следовательно, и номер позиции) суммарного белкового спектра основных (занимающих наибольшую долю в популяции) белковых биотипов. Следует отметить, что подход, основанный на использовании суммарного электрофоретического спектра анализируемой формы, является одним из позиций международного стандарта ISO 8981:1993(Е) в области контроля качества семян с помощью электрофореза [10].

Наряду с критериями идентификации белковых компонентов, большое значение также имеют критерии оценки сортовой чистоты в рамках сортового контроля. Если в случае идентификации сорта необходимо использовать каталоги максимального разнообразия видовых форм, то в случае оценки сортовой чистоты дополнительно - каталоги оригинальных электрофоретических спектров и сортовых формул всех сортов, внесенных в Реестр сортов и древесно-кустарниковых пород. Однако следует заметить, что использование каталогов допустимо только в случае полной воспроизводимости методики определения, любое нарушение условий воспроизводимости может повлечь искажение визуальной картины распределения белковых компонентов и, как следствие, к неправильной оценке сортоспецифичных компонентов спектра (таблица).

Сравнительная оценка относительной подвижности с использованием разных критериев оценки

Показатели Rf (мм) эталонный спектр1 анализируемый образец 100 оригинальные семена маркерный белок

10 12 25 35 40 49 50 51 65 70 78 82 85 89 90 94 10 12 22 37 40 50 51 65 70 78 82 86 89 90 94 97 10 12 22 37 40 50 51 65 70 78 82 86 89 90 94 97

22*

40**

70***

Примечание: 1 - графическое изображение спектра (модельная матрица);

100 - значения приведены для образца со 100-%ной сортовой чистотой;

*- БСА;

** - овальбумин;

*** - эндонуклеаза рестрикции

Как наглядно свидетельствуют данные таблицы, при нарушении условий воспроизводимости методики определения, что может быть вызвано как человеческим фактором, так и технологическими неточностями в ходе анализа, получаемая картина распределения сортовых маркерных компонентов спектра может отличаться от ранее идентифицированной и, как следствие, вывод о сортовой чистоте будет некорректен.

Результаты практической работы наглядно показывают, что наиболее оптимальным, объективным и менее зависящим от условий воспроизводимости анализа является использование белкового экстракта оригинальных семян оцениваемого образца. В данном случае белковый экстракт оригинальных семян сорта наслаивается в два-три кармана в центре гелевой пластины в том же объеме и при тех же условиях, что и оцениваемый образец. В результате вне зависимости от условий фракционирования белка будет получена картина белкового спектра, на которой возможно корректно сопоставить маркерные позиции аутентичного образца (белок оригинальных семян) и оцениваемого сорта.

Таким образом, на основе многократной практической апробации подходов к идентификации компонентов белкового спектра, осуществляемой в рамках разработки методик определения для целей сортового контроля, установлена универсальность и приемлемость их для целей сортовой идентификации, сортовой дифференциации, оценки внутренней структуры сортов, линий, биотипов. Вместе с тем, несмотря на приемлемость данных методов идентификации, их следует применять в условиях использования стандартизированных и унифицированных методик определения актуализированных в области, аккредитации всех профильных лабораторий, использующих метод электрофоретического анализа.

1. Проанализированные подходы могут быть использованы в системе идентификации белковых компонентов спектра в условиях SDS-электрофореза.

2. Построение правильного калибровочного графика возможно только с использованием стандартных белков и при условии полной воспроизводимости методики определения.

3. На основании данных калибровочного графика возможно точное определение подвижности реперных позиций сортов-стандартов.

4. В качестве критерия оценки величин Rf неизвестных белковых компонентов допускается использовать величину отношения к подвижности лидирующего красителя.

5. Для оценки сортовой чистоты рекомендуется использовать экстракт белка оригинальных семян испытываемого образца.

1. Семена зерновых культур. Сортовые и посевные качества. Технические условия: СТБ 1073-97/ ИУ ТНПА №12-2010. введ. 01.07.2011. - Минск, 2011. - 20 с.

2. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / А.В. Конарев [и др.] // Цитология и генететика. - 2000. - Т. 34, №2. - С. 91?104.

3. Применение электрофореза белков в первичном семеноводстве зерновых культур: метод. Указания / Под. редакцией В.Г. Конарева и В.Г. Еникеева. - СПБ: ВИР, 1993. - 20 с.

4. Рекомендации по использованию белковых маркеров в сортоиспытании, семеноводстве и семенном контроле / Под редакцией В.Г. Конарева. - М.-Л.: ВИР, 1998. - 20 с.

5. International Rules for Seed Testing / International Seed Testing Association, 1996 // Seed Sci. Technol. Suppl. - Vol. 24. - H. 221-223.

6. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений / А.В. Конарев. - СПБ.: ВИР, 1998. - С. 3?25.

7. Поморцев, А.А. Идентификация и оценка сортовой чистоты семян ячменя методом электрофоретического анализа запасных белков зерна (теория вопроса, методика электрофореза, каталог электрофореграмм современных сортов ячменя, допущенных к использованию в Российской Федерации) / А.А. Поморцев, Е.В. Лямина. - М.: Изд-во МСХА, 2003. - 85 с.

8. Молчан, И.М. Структура и изменчивость сорта пшеницы по признаку остистости / И.М. Молчан, Т.В. Лезжова // Проблемы селекции сортов мягкой яровой пшеницы интенсив. типа. - Новосибирск, 1980. - С. 32-36.

9. Созинов, А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А. Созинов. - М.: Наука, 1985. - 327 с.

10. ИСО 8981:1993(Е), «Пшеница - идентификация сортов с помощью электрофореза».

11. Bushuk, W. Wheat cultivar identification by gliadin electrophoregrams.1. Apparatus, method, and nomenclature / R.R. Zillman // Canad. J. Plant Sci. - 1978, vol. 58, - P. 505-515.

12. Поморцев, А.А. Полиморфизм культурного ячменя (Hordeum vulgare L.) Южной Аравии по гордеин-кодирующим локусам / А.А. Поморцев, Е.В. Лялина // Генетика - 2007. - Т. 43, №5. - С. 660-667

13. Применение электрофореза белков в первичном семеноводстве зерновых культур: методические указания. - СПБ., 1993. - 25 с.

14. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / Под ред. В.Г. Конарева. - СПБ.: ВИР, 2000. - 186 с.

Размещено на .ru