Географические особенности Арктики. Свойства и условия обитания облигатных психрофилов, изучение сообществ палеоорганизмов вечной мерзлоты. Численность жизнеспособной микрофлоры в мерзлых породах, ее исследование методом накопительного культивирования.
Одним из уникальных мест обитания экстремофильных микроорганизмов, является арктическая зона с присущей ей многолетней мерзлотой.
Арктические моря отличаются от остальных акваторий Мирового океана мощным влиянием абиотических факторов, важнейшим из которых является длительный ледовый режим и, как следствие, короткий (3-4 месяца) период вегетации фитопланктона.
Высокая специфичность процессов биосинтеза и биотрансформации органического вещества (ОВ) в полярных водоемах связана с низкой первичной продукцией фитопланктона, поступлением ОВ в составе мощных речных стоков, с густой заселенностью частиц взвеси бактериями и легким изотопным составом органического углерода (Сорг) взвеси и поверхностного слоя донных осадков. Изза суровых климатических условий и своей территориальной удаленности моря Восточной Арктики изучены слабо.
В арктических морях роль микробных сообществ в трансформации ОВ на границе вода-дно может быть весьма значительной. Накоплению высоких абсолютных масс Сорг при сравнительно низкой продуктивности морей способствует значительное терригенное поступление ОВ и обусловленная низкими температурами малая скорость его деструкции.
В арктических морях в слое осадков 0- 1 см изотопный состав углерода отличается от такового во взвеси, что указывает на активные бактериальные процессы, протекающие как на частицах взвеси, так и на геохимическом барьере вода - осадок.
Первая количественная оценка микробной биомассы в арктических морях была сделана Буткевичем B.C. во время высокоширотной экспедиции в 1935 г. Им отмечено невысокое содержание клеток бактерий в воде Карского моря, подавляющее большинство содержало от 103 до 104 кл/мл.
В 1993 г. сотрудниками Института микробиологии РАН были проведены экспедиционные работы в район Карского моря, подверженный влиянию стока крупных рек - Оби и Енисея. В результате было установлено, что в морской части акватории содержание бактерий в воде колебалось от 2-3 тысяч до 250-280 тысяч клеток в 1 мл, что близко к данным других авторов.
Затем исследования, проведенные Ильинским В.В., показали, что численность евтрофных бактерий превышала в арктическом регионе численность бактерий двух других групп (олиготрофы и углеводородокисляющие) в два раза и более.
Численность евтрофных бактерий - от 0 до 2140 КОЕ/л, в среднем 409 КОЕ/л - примерно на половине станций была на уровне значений 0-160 кл/л. Количество углеводородокисляющих микроорганизмов (УВОМ) в поверхностных водах центральной Арктики в целом невелико (от 20 до 1000 кл/л.).
По современным данным, большинство морских микроорганизмов Арктики имеют психрофильный характер, однако так было не всегда.
Последние исследования биологической активности морского дна, проводимые Университетом Ньюкасла у берегов Шпицбергена, выявили наличие спор термофильных бактерий, проявляющих активность в диапазоне температур от 20 до 550С. Наличие этих спор этих бактерий может служить доказательством теории, говорящей, что примерно 100 млн. лет назад (именно этим возрастом датируются споры термофилов), расположение материков позволяло теплым океаническим течениям, приходящим с экватора, доходить намного севернее, чем в наше время, обеспечивая на планете более равномерный и мягкий климат.
В целом же, данные о микрофлоре Арктики, как и данные о полярных регионах в целом, в силу суровости местного климата имею недостаточную изученность и высокую степень разрозненности.
Попробуем обобщить данные об арктической микрофлоре, которые мы имеем на сегодняшний день.
ОБЩАЯ ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
АРКТИЧЕСКОГО РЕГИОНА
Арктика - единый физико-географический район Земли, примыкающий к Северному полюсу и включающий окраины материков Евразии и Северной Америки, почти весь Северный Ледовитый океан с островами (кроме прибрежных островов Норвегии), а также прилегающие части Атлантического и Тихого океанов. Южная граница Арктики совпадает с южной границей зоны тундры. Площадь около 27 млн. кв. км; иногда Арктику ограничивают с юга Северным полярным кругом (66° 33? с. ш.), в этом случае ее площадь составит 21 млн. кв. км.
По особенностям рельефа в Арктике выделяют: шельф с островами материкового происхождения и прилегающими окраинами материков и Арктический бассейн. Область шельфа занята окраинными морями - Баренцевым, Карским, Лаптевых, Восточно-Сибирским и Чукотским.
Рельеф суши российской Арктики преимущественно равнинный; местами, особенно на островах, гористый. Центральная часть - Арктический бассейн, область глубоководных котловин (до 5527 м) и подводных хребтов.
Особенности природы: низкий радиационный баланс, близкие к 0°C средние температуры воздуха летних месяцев при отрицательной среднегодовой температуре, существование ледников и многолетнемерзлых пород, преобладание тундровой растительности и арктических пустынь.
Ледовитость морских акваторий около 11 млн. кв. км зимой и около 8 млн. кв. км летом.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПСИХРОФИЛЬНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ АРКТИКИ
Это криофильные микроорганизмы, способны хорошо расти при 0°С и более низких температурах (до -10°С). Оптимальная температура роста у облигатных психрофилов 10-15°С и ниже, у факультативных - 25-30°С.
Верхний температурный предел у облигатных психрофилов не превышает 20°С, у факультативных - 30°С, т. е. их температурные диапазоны перекрываются с таковыми у мезофильных микроорганизмов.
Для всех психрофильных микроорганизмов характерны слабая чувствительность метаболических процессов к холоду, в т. ч. низкие температурные оптимумы действия ферментов, особенности липидного обмена (увеличение относительного содержания ненасыщенных жирных кислот) и др.
Известны почти среди всех групп микроорганизмов (кроме актиномицетов). Облигатные психрофилы живут в относительно стабильных температурных условиях, факультативные могут существовать и в средах с резкими перепадами температур. Психрофильные микроорганизмы широко распространены в природе. Часто встречаются в водах Арктики и Антарктики, в пещерах, на поверхности снега и ледников в горах.
Некоторые виды микроскопич. водорослей (чаще Chlamydomonas nivalis) образуют оранжевые или красные пигменты, окрашивая снег в красный цвет (т. н. красный снег).
В водах Арктики на сегодняшний день обнаружены только облигатные психрофилы, поэтому факультативных психрофилов в этом обзоре мы рассматривать не будем.
ЖИЗНЕСПОСОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ В ВЕЧНОЙ МЕРЗЛОТЕ
АРКТИКИ
К сожалению, в литературных источниках отсутствуют данные, повествующие об истории открытия облигатных психрофилов Арктической зоны, поэтому сразу перейдем к современным исследованиям этой проблемы.
Исследования последних лет показали возможность длительного сохранения жизнеспособных прокариотных и эукариотных микроорганизмов в условиях постоянных отрицательных температур многолетнемерзлых толщ, возраст которых составляет от нескольких тысяч до 2-3 млн. лет. Из многолетнемерзлых отложений выделены аэробные и анаэробные бактерии, зеленые и сине-зеленые микроводоросли, дрожжи и мицелиальные грибы.
Обнаружены споры мхов и семена высших растений, способные к прорастанию после длительной криоконсервации.
В ходе комплексных работ по изучению сообществ палеоорганизмов вечной мерзлоты выделены жизнеспособные цисты свободноживущих простейших, находившиеся в состоянии криптобиоза в течение десятков и сотен тысяч лет.
Простейшие являются полифилетической группой протистов (Protista Haeckel, 1866) и включают гетеротрофные свободноживущие и паразитические, преимущественно одноклеточные организмы.
Свободноживущие простейшие распространены в природе чрезвычайно широко и заселяют практически все возможные для жизни среды обитания. В почвенных биоценозах всех географических зон они являются обязательным компонентом, по разнообразию и численности уступая только бактериям.
Простейшие способны существовать в большом диапазоне температур, адаптируясь к экстремально высоким и низким значениям. Эти эукариотные организмы широко распространены в различных биотопах полярных районов - в составе планктона и бентоса холодных морских и пресных вод, во льдах и талых водах, в наземных экосистемах Антарктиды и высоких широт Арктики.
В ответ на действие низких температур, а также сопутствующего высушивания и изменения химизма среды, протисты используют различные стратегии выживания. Один из путей - переход в состояние физиологического покоя, сопровождающийся образованием особых морфологических структур - цист покоя, которые защищены от неблагоприятных воздействий многослойной водо- и газонепроницаемой оболочкой.
При этом выживание обеспечивается посредством почти полного прекращения метаболической активности, в связи с чем стратегию этого типа нередко называют криптобиозом. В состоянии криптобиоза протисты способны переносить влияние отрицательных температур в диапазоне от -60°С в природе и до -269 °С в условиях эксперимента.
Описаны случаи сохранения жизнеспособности цистами простейших после нескольких десятков лет консервации в замороженном или высушенном состоянии: во льдах Гренландии и Балтийского моря, в сухих почвенных образцах. Из гренландского льда выделены цисты инфузории Colpoda steinii и амебы Vahlkampfia sp., сохранившие способность к эксцистированию после нескольких столетий криоконсервации.
В 30-х гг. прошлого века об обнаружении жизнеспособных цист амеб и инфузорий в мерзлых толщах Забайкалья сообщал П.Н. Каптерев, проводивший исследования на Сковородинской мерзлотной станции. Однако эти находки были приурочены к подошве слоя сезонного оттаивания.
Сведений о находках жизнеспособных цист простейших в мерзлых отложениях нет.
Кроме того, изучение радиолярий в осадках внутренней (не прибрежной) Арктики показало их специфический, эндемичный характер, отразивший относительную устойчивость местной популяции, изолированной от проникновения морской биоты из соседних Атлантического и Тихого океанов.
С другой стороны, комплексы микроорганизмов арктических морей у побережья России, в частности, моря Лаптевых, несут на себе признаки динамичного взаимодействия водных масс различного происхождения: пресноводного стока р. Лены, солоноватых и более соленых шельфовых вод, морских арктических и североатлантических вод.
Общее число аэробных микроорганизмов в мерзлых толщах, установленное прямым счетом составляет 108 - 109 клеток на 1 г грунта. Это относится и к антарктическим отложениям, со следовым количеством Сорг., накапливавшимся в условиях полярной пустыни, без растительности, и к арктическим осадкам, богатым органикой, растительными и животными остатками, формировавшимися в режиме тундры. Это означает, что необходимым и достаточным фактором постоянного присутствия микроорганизмов в природе является наличие лишь минеральных частиц и воды.
Табл. 1. Общее число аэробных микроорганизмов в мерзлых породах (108 кл/г)
Антарктида Арктика
Глубина, м Общая численность Глубина, м Общая численность эоловые и ледниковые осадки атласные и морские осадки
4.5 0.4 7.0 0.6
6.8 1.4 18.0 2.2
8.2 0.6 20.7 1.3
9.4 1.1 осадки едомной и олерской свит
10.1 0.1 2.2 1.5
12.2 0.05 4.4 1.4
13.0 1.0 7.2 3.2
14.7 0.1 13.5 0.4
15.3 2.5 18.8 0.5
16.3 0.8 34.8 0.2
Число культивируемых аэробов клеток в осадочных породах Арктики варьирует от 103 до 107 в 1 г грунта (0.01 - 1.3% от их общего числа в мерзлых породах), а в Антарктиде падает до 102 - 103 кл/г (0.001 - 0.1%). Число культивируемых аэробных бактерий определяется длительностью их пребывания в мерзлоте. С увеличением возраста мерзлых пород (а не осадков), число клеток сокращается. Максимум аэробных микроорганизмов связан с голоценовыми осадками, а переход к более древним породам маркируется падением численности микробного населения. Долгое пребывание в мерзлом окружении является биодиагенетическим фактором, сокращающим число аэробов. Сравнение численности культивируемых из мерзлоты клеток, с таковыми за пределами криолитозоны говорит, что отрицательные температуры являются не экстремальным, а стабилизирующим фактором, обеспечивающим сохранение биологических систем.
Табл. 2. Численность жизнеспособной микрофлоры в мерзлых породах
Колымская низменность Канадская Арктика Антарктида осадки глубина кл/г скважина глубина кл/г скважина глубина кл/г супеси и суглинки олерской свиты 3.4 м 1.7x106 Taglu 107.2 м 1.6x105 956/3 ледниковые пески 13.9 м 3.9x103
12.8 м 5.4x106 326.4 м 1.3x105 16.3 м 1.0x103
14.1 м 2.2x107 Unipkat 9.5 м 1.6х105 956/4 1.6 м 5.9x104
16.5 м 1.4x107 15.0 м 8.8х104 956/8 2.8 м 3.4x103
32.4 м 1.6x106 24.2 м 1.4х103 1/99 1.0 м 5.2x102 морские супеси 7.0 м 2.2x105 41.2 м 1.5х103 14.5 м 6.2х104
Глубина залегания пород не влияет на жизнеспособные микробные сообщества в криолитосфере. Сегрегационный лед, цементируя дисперсные осадки, формирует из них прочный каркас, что сводит на нет воздействие геостатического давления на клетки.
Сохранность клеточных структур, на 90% состоящих из воды, определяется равновесным состоянием клеточной и пленочной воды внутри и вне клетки, нарушение которого ведет к ее гибели. Поэтому, пленки незамерзшей воды (Wнз) играют решающую роль в сохранении микроорганизмов. Обволакивая органоминеральные частицы, они защищают сорбированные на поверхности частиц жизнеспособные клетки от растущих кристаллов сегрегационного льда.
Численность клеток в суглинках на 2-3 порядка выше, а микробные спектры разнообразнее, чем в песках.
Не установлено прямой связи между численностью микроорганизмов с содержанием органического вещества в мерзлых толщах. Микроорганизмы из вечной мерзлоты Арктики, в отличие от морских арктических микроорганизмов, не являются психрофилами.
Основное микробное население здесь обладает свойствами: Topt>15OC, Tmax> 20OC, Tmin < 0OC, с оптимумом роста 4 - 20ОС в антарктических и 10 - 20ОС в арктических осадках.
В присутствии криопротектора рост клеток происходит и при минусовых температурах. При -5ОС колонии появлялись через 6 - 8 месяцев, а при -8ОС лаг-период занимает 1 год. Таким образом, отрицательные температуры не являются запрещающим фактором для сохранения жизнеспособности палеокультур и их метаболической активности при наличии доступного питательного субстрата.
При криоконсервации микроорганизмов в геологическом масштабе времени при температурах пород (t) = (-3) - (-4)ОС на Аляске, (-5) - (-6)ОС в дельте р. Макензи и (-9) - (-12)ОС на Колыме, число жизнеспособных клеток не зависит от температуры мерзлых толщ. Вблизи южной границы мерзлоты в Западной Сибири с (t) =(-1) - (-2)ОС и в Антарктиде при (t) = (-18) - (-25)ОС, численность жизнеспособных микроорганизмов падает на несколько порядков.
Режим переохлажденных и пластичномерзлых пород Западной Сибири не обеспечивает длительной криоконсервации биологических систем, а в Антарктиде падение числа жизнеспособных клеток объясняется переходом большей части микробного комплекса в некультивируемое состояние изза крайне низких температур вмещающих пород.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АРКТИЧЕСКОЙ МИКРОФЛОРЫ
Из полученного путем бурения мерзлого ненарушенного керна диаметром 50-100 мм отбирают центральную часть с соблюдением условий асептики. Работу с керном проводят в полевом боксе, керн зачищают стерильным скальпелем, поверхность обрабатывают 95%-м этиловым спиртом и помещают в стерильные алюминиевые бюксы или пакеты.
В поле пробы хранят в скважине-“морозильнике” при температуре их естественного залегания -8…-10 °С. В конце полевого сезона образцы в термостатах с криосмесью в мерзлом состоянии доставляют в лабораторию.
Образцы погребенных почв и материал нор ископаемых грызунов отбирают из свежих мерзлых стенок обнажений. Стенки зачищают до слоя, не затронутого оттаиванием, затем в мерзлой породе вырубают нишу глубиной 30-40 см, из которой отбирают образцы, обрабатывают их 95%-м этиловым спиртом, помещают в стерильный пакет и хранят в мерзлом состоянии. В лаборатории образцы хранятся в морозильных камерах при температуре -20 °С.
Для выделения жизнеспособных простейших из многолетнемерзлых отложений используют метод накопительного культивирования. Мерзлые образцы (1-2 г) помещают в стерильные чашки Петри со средой Прескотта и Джеймса (Cerophyl-Prescott infusion): CACL2 х 2H2O - 0,433 г, KCL - 0,162 г, K2HPO4 -0,512 г, MGSO4 х 7H2O - 0,28 г и культивируют при температуре 5 и 20 °С в течение 4 месяцев.
Для предохранения от высыхания и заражения чашки оборачивают парафилмом. Наблюдения в накопительных культурах проводят в закрытых чашках Петри с использованием инвертированного микроскопа, а также на “стеклах обрастания” - стерильных покровных стеклах, помещенных в накопительную культуру.
При обнаружении простейших образец высевают повторно. Все манипуляции с образцами грунта и высев проб в чашки Петри осуществляют в микробиологическом боксе c соблюдением условий стерильности.
Из накопительной культуры получают клональные и монокультуры простейших. Дальнейшее культивирование проводят на агаризованных и жидких средах Прескотта и Джеймса с добавлением различных пищевых объектов - бактерий Escherichia coli, Klebsiella aerogenes и Pseudomonas fluorescens, церофила, зерен риса.
Морфологическое исследование выделенных простейших выполняют в культурах и на тотальных препаратах.
Для видовой идентификации инфузорий используют методы окраски ядерного аппарата по Фельгену, выявления инфрацилиатуры импрегнацией нитратом серебра по Шаттону-Львову и протеинатом серебра по Фойснеру.
Для определения амебоидных организмов на родовом и видовом уровнях проводят их ультраструктурные исследования, а также окраску цист протеинатом серебра и гематоксилином. Особенности тонкого строения покоящихся стадий простейших изучают с применением трансмиссионного электронного микроскопа, используя ультратонкие срезы, полученные на ультратоме.
Постоянные и временные препараты исследуют с применением светового микроскопа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На сегодняшний день исследования полярных и приполярных областей земного шара ведутся очень интенсивно и имеют огромное научное, экономико-политическое и иногда - даже военное значение.
Однако, несмотря на огромную перспективность и актуальность этих исследований, изученность полярных регионов остается достаточно низкой в связи с суровыми условиями климата и рельефа местности.
Стоит также отметить, что на сегодняшний день техническая оснащенность российских исследовательских полярных экспедиций далека от идеала и сильно отстает от оснащенности европейских и американских коллег, что, безусловно, негативно сказывается на эффективности исследований.
Тем временем, исследования полярных зон имеют большое стратегическое и медицинское значение.
Доказательством этому служит разрабатываемая на сегодняшний день система вакцинаций, связанных с внедрением части генотипа арктических психрофильных непатогенных бактерий в генотип патогенных штаммов микроорганизмов.
Исходя из вышесказанного, можно с уверенностью говорить о том, что интенсивность изучения и освоения полярных регионов будет нарастать еще не один десяток лет.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Воробьева Е.А. Сине-зеленые и зеленые водоросли из вечномерзлых осадочных пород Арктики // Криосфера Земли, 1997, т. I, №2, с. 71-76.
2. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г. и др. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны // Изв. АН СССР. Сер. геол., 1989, №6, с. 103-115.
3. Суслова М.Ю., Парфенова В.В., Павлова О.Н., Косторнова Т.Я., Федотов А.П., Ходжер Т.В. Разнообразие культивируемого микробного сообщества в шельфе Карского моря, заливе Гыданская Губа и бассейне реки Енисей // Лимнологический институт СО РАН, Иркутск.
4. Шатилович А.В., Шмакова Л.А.,. Губин С.В, Гиличинский Д.А. Жизнеспособные простейшие в вечной мерзлоте Арктики // Криосфера Земли, 2010, т. XIV, №2, с. 69-78
