Кріоконсервування культивованих фібробластоподібних клітин шляхом повільного заморожування і вітрифікації - Автореферат

Враховуючи їх стромальну локалізацію в різних тканинах, Міжнародне товариство клітинної терапії (International Society for Cellular Therapy - далі ISCT) нещодавно прийняло рішення називати ці клітини мультипотентними мезенхімальними стромальними клітинами (МСК) і визначило основні критерії їх ідентифікації (Dominici M. et al., 2006). Враховуючи те, що потенціал і пластичність МСК знижуються в перебігу онтогенезу (Gotherstrom C. et al., 2005), пошук МСК серед онтогенетично ранніх джерел, зокрема ФПК ембріонів ранніх стадій органогенезу, сприятиме подальшому вивченню властивостей цих клітин. Мета дисертаційної роботи - визначити вплив кріоконсервування шляхом повільного заморожування та вітрифікації на морфофункціональні властивості і здатність до спрямованого диференціювання культивованих фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу. Дослідити вплив кріоконсервування шляхом вітрифікації на морфофункціональні властивості і здатність до спрямованого диференціювання ФПК ранніх стадій органогенезу. Для оцінки збереженості і вивчення морфофункціональних властивостей клітин застосовували методи світлової мікроскопії; для аналізу експресії маркерних антигенів - метод проточної цитофлуориметрії; для вивчення диференціювального потенціалу - методи культивування в середовищах з індукторами диференціювання з подальшим цитохімічним фарбуванням; для визначення відновленої форми АВ - метод флуоресцентної спектроскопії; для вивчення здатності до склування розчинів кріопротекторів - метод диференціальної скануючої калориметрії (ДСК).Суспензію тканинних фрагментів і клітин культивували в середовищі ?-МЕМ (Sigma, США), що містило 15% сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (ЕС, ТОВ «БІОЛОТ», Росія), 100 од пеніциліну, 100 мкг стрептоміцину, при 37°С / 95% вологості в атмосфері з 5% СО2. Підрахунок кількості клітин проводили в камері Горяєва згідно зі стандартними методиками. Відновлення АВ (Serotec, США) у ФПК досліджували в перебігу культивування у присутності і за відсутності азиду натрію (5 ММ), антиміцину А (2 мкг), монойодацетату (МИА, 10 ММ), дигитоніну (100 мкг/106 клітин). Результати наводили як різницю між флуоресценцією дослідної і контрольної (без мітохондрій або без клітин) проби і виражали в умовних одиницях флуоресценції (УОФ). Первинний скринінг ефективних композицій проводили за візуальною оцінкою наявності кристалізації (Baudot А. et al., 2004) при швидкому заморожуванні аліквот розчинів обємом 0,5 мл у кріопробирках Corning шляхом занурення в рідкий азот і відігріванні на водяній бані при 40°С.У роботі наведені теоретичне узагальнення та вирішення наукової проблеми низькотемпературного консервування фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, що мають імунофенотип і диференціювальні властивості мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин. Alamar Blue-тест є чутливим методом визначення збереженості, метаболічної та проліферативної активності фібробластоподібних клітин ранніх стадій органогенезу; Alamar Blue відновлюється в клітинах з неушкодженою мембраною, що адгезували до субстрату, і рівень його флуоресценції зростає в процесі культивування.

Основний зміст роботи

У роботі наведені теоретичне узагальнення та вирішення наукової проблеми низькотемпературного консервування фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, що мають імунофенотип і диференціювальні властивості мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин.

1. Імунофенотипічний аналіз показав, що культивовані фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу експресують характерний для МСК імунофенотип (позитивні за CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за CD34, CD38, CD45); вміст клітин з даним імунофенотипом становить близько 95% і не змінюється у перебігу субкультивування до 12-го пасажу.

2. Встановлено, що фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу здатні до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах в умовах моношарового культивування.

3. Alamar Blue-тест є чутливим методом визначення збереженості, метаболічної та проліферативної активності фібробластоподібних клітин ранніх стадій органогенезу; Alamar Blue відновлюється в клітинах з неушкодженою мембраною, що адгезували до субстрату, і рівень його флуоресценції зростає в процесі культивування.

4. Кріоконсервування шляхом повільного заморожування під захистом 10% диметилсульфоксида дозволяє значною мірою зберегти життєздатність і метаболічну активність фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, а також їх здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

5. Показано, що під час швидкого заморожування й відігрівання розчинів, що містять 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози або 10% диметилсульфоксида, 15% етиленгліколя, 15% 1,2-пропандіола і 1 М цукрози, обємом 0,5 мл у пластикових кріопробірках виключається розвиток кристалізації.

6. Застосування розчину, що містить 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози, для вітрифікації суспензії культивованих фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу дозволяє зберегти їх морфофункціональні властивості та здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

1. Петренко Ю.А. Влияние высокомолекулярных соединений на жизнеспособность и функциональную активность клеток эмбриональной печени человека до и после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 375 - 379.

2. Определение метаболической активности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека с помощью Alamar Blue-теста / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, Б.П. Сандомирский, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 4. - С. 599-606.

3. The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes and isolated mitochondria / Yu.A. Petrenko, N.A. Gorokhova, E.N. Tkachova, A.Yu. Petrenko // Укр. Біохім. Журн. - 2005. - Vol. 77, № 5. - Р.100-105.

4. Morphological and functional assessment of human fetal liver cells in longterm culture / P. Todorov, R.Konakchieva, J. Dimitrov, V. Novachkov, D. Kyurkchiev, N. Tchoob, S. Drokin, N. Gorokhova // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 2. - С. 201-206.

5. Горохова Н.А. Выбор криозащитной среды для витрификации суспензии эмбриональных фибробластоподобных клеток / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 1. - С. 50-58.

6. Выделение и дифференцировка стромальных клеток из тканей плодов и взрослого человека / А.Ю. Петренко, С.П. Мазур, Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова // Трансплантология. - 2007. - Т. 9, № 1. - С. 218-220.

7. Культивирование стромальных клеток-предшественников в трехмерных носителях / Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко, В.И. Лозинский, И.В. Гурин, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова, Б.П. Сандомирский // Трансплантология. - 2007. - Т. 9, № 1. - С. 221-223.

8. Горохова Н.А. Alamar Blue-тест как метод определения жизнеспособности клеток до и после криоконсервирования / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 4. - С. 728-729.

9. Gorokhova N.A. Alamar Blue-test as a method of assessing metabolic activity of human embryonic cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, E.N. Tkachova // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів [«Молодь і поступ біології»]. - Львів, 2006. - С. 353-354.

10. Изучение активности метаболических процессов в клетках по восстановлению ресазурина / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, Е.Н. Ткачева, А.Ю. Петренко // IX Український біохімічний зїзд : Тез. доп. - Харків, 2006. - С. 117.

11. Горохова Н.А. Криоконсервирование фетальных фибробластоподобных клеток человека методом витрификации / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 4. - С. 423.

12. The effect of cryopreservation on the differentiation potential of human fetal fibroblast-like cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, N.A. Volkova, A.I. Pravduk, A.Yu. Petrenko // Abstracts of the 6th Parnas Conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling, Krakow, Poland. - Acta Biochimica Polonica. - 2007. - Supplement 2. - P. 15.

13. Горохова Н.А. Жизнеспособность клеток после экспозиции и быстрого замораживания-отогрева в многокомпонентных витрифицирующих растворах / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 2. - С. 199.

14. Multilineage differentiation of human stromal cells isolated from different sources / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, N.G. Skorobogatova, A.I. Pravduk, N.A. Gorohova, N.A. Volkova, S.P. Mazur, V.P. Grischuk // ІІІ Всероссийский симпозиум с международным участием [«Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» ] : Сб. тезисов. - Москва, 2007. - С. 90.

15. Growth and differentiation of human stromal cells in two- and three-dimensional carriers / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, A.I. Pravduk, N.A. Gorokhova, V.I. Lozinsky, L.G. Damshkaln, I.V. Gurin, Yu.V. Malutin, I.A. Borovoy, N.G. Skorobogatova, N.A. Volkova, S.P. Mazur // 2-ий Зїзд українського товариства клітинної біології : Тез. доп. - Київ, 2007. - С. 213.