Контекст-зависимый выбор поведения: нейротрансмиттерные механизмы - Автореферат

Механизмы выбора поведения привлекают исследователей многих областей в силу не только фундаментальной, но и социально-прикладной значимости проблемы. В этологии, физиологии поведения, психологии, социологии хорошо установлен факт зависимости поведенческого выбора от контекста, т.е. от определенных внешних и внутренних факторов, таких как время суток, температура, предыдущий опыт и другие. Большая часть нейрофизиологических описаний механизмов контекст-зависимого выбора основана на традиционном представлении о сетевой иерархической организации нервной системы, при этом ключевая роль отводится электрической активности определенных нейронов или отделов мозга и синаптическим (возбуждающим или тормозным) взаимодействиям между ними. Под интегративным действием сигнальной молекулы подразумевается характерная для объемной передачи (volume transmission) ситуация, когда возбуждающие, тормозные и модулирующие, а иногда и гормональные эффекты сигнальной молекулы на разные клеточные мишени складываются в скоординированный ответ локальной системы. Если гипотеза справедлива, то должны выполняться следующие условия: (1) при изменении поведенческого контекста происходят значимые изменения в интенсивности синтеза и/или высвобождения определенного нейротрансмиттера; (2) повышением содержания определенного нейротрансмиттера можно имитировать действие поведенческого контекста и, наоборот, подавлением соответствующей нейротрансмиттерной системы можно снимать влияние поведенческого контекста; (3) на клеточном уровне существуют механизмы, обеспечивающие изменение объемного высвобождения нейротрансмиттера при формировании поведенческого контекста; (4) нейрохимический контекст влияет на спонтанную или вызванную активность нейронального ансамбля и отдельного нейрона.Использовалась смешанная культура G. bimaculatus, которую поддерживали и разводили в лабораторных условиях, в отдельном помещении при температуре 270 С и световом режиме 12/12 часов. Использовали сверчков обоего пола в возрасте 2-3 недели после последней линьки, которых в течение 24 часов перед опытом содержали изолированно с достаточным количеством пищи и воды. Регистрировали интенсивность драки (0 - взаимное избегание, 1-избегание одного из самцов при первом контакте, 2 - агрессивное биение антенн, 3 - демонстрация раскрытых мандибул одним самцом, 4 - демонстрация раскрытых мандибул обоими самцами, 5 - толкания, 6 - укусы мандибулами) и длительность драки. Пару животных, самца и самку, помещали в разные отсеки прозрачной камеры (10х12х15 см), разделенные прозрачной перегородкой. Животным наносили на кутикулу грудного сегмента клейкое вещество и прикрепляли к специальному кронштейну, так чтобы они находились в подвешенном состоянии, обдували струей воздуха от вентилятора в течение 0.5, 1, 3 или 5 минут.Этот эффект также носил «дозо-зависимый» характер: чем дольше самцы летали перед дракой, тем дольше у них сохранялась способность вступать в повторные драки с победителем. Полет оказывал влияние и на поведение доминанта по отношению к субординанту, увеличивая длительность преследований, общее число атак и открытия мандибул. Сходный эффект полета на смещение выбора поведения в сторону агрессии наблюдался и у самок: полет значительно увеличил интенсивность и длительность драк в опытной группе. В опытной группе, в которой самцы летали в течение 5 минут перед встречей с самкой, достоверно вырос процент ухаживающих (поющих) самцов и, соответственно, возрос процент копуляций (Рис. В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты, соответствующие критериям необходимости и достаточности: (1) синтез и высвобождение октопамина увеличивается при полете; (2) агонист октопаминовых рецепторов имитирует действие полета на поведенческий выбор у субординантов; (3) эффект полета на агрессию снижается или снимается полностью при подавлении либо синтеза октопамина, либо блокировании октопаминовых рецепторов.Выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda, Ecdysozoa) зависит от предыдущего социального и моторного опыта (полет). Фармакологически вызванные изменения в нейрохимической среде (активация/блокада октопаминовых и опиатных рецепторов, изменения синтеза серотонина, октопамина, дофамина, оксида азота) оказывали специфическое и воспроизводимое влияние на поведенческий выбор при социальных и половых взаимодействиях у сверчков Контекст-зависимый выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка контролируется моноаминами серотонином и октопамином, а также эндогенной опиоидной системой.

.1. Контекст-зависимое поведение Gryllus bimaculatus и его нейротрансмиттерные механизмы.

3.1.1. Модуляция поведения сверчка социальным статусом и полетом.

3.1.1.1. Модуляция агрессивности (контекст-зависимая агрессия). Известно, что агрессивное поведение G. bimaculatus подавляется у побежденных особей и активируется у победителей (Alexander, 1961). Недавние работы выявили необычное физиологическое явление - изменение агрессивного поведения животного после моторного поведения, казалось бы, никак не связанного с агрессией, полета. У проигравших самцов полет вызывал немедленное высвобождение агрессии и провоцировал драки с победителем (Hofmann and Stevenson, 2000). Более детальное изучение эффектов полета на поведенческй выбор при внутривидовых взаимодействиях у сверчков стало первой целью наших исследований.

Было найдено, что полет способен усиливать драки у наивных, т.е. у исходно агрессивных самцов. Чем дольше предварительно изолированные самцы летали перед первой дракой, тем интенсивнее и длительнее становились их агрессивные взаимодействия. Полет до драки также оказывал существенное модулирующее влияние на последующее поведение проигравшего самца. В отличие от контрольных животных, летавшие до драки восстанавливали способность драться вновь с победителем уже через 15 минут после первого проигрыша. Этот эффект также носил «дозо-зависимый» характер: чем дольше самцы летали перед дракой, тем дольше у них сохранялась способность вступать в повторные драки с победителем. Полет оказывал влияние и на поведение доминанта по отношению к субординанту, увеличивая длительность преследований, общее число атак и открытия мандибул. Сходный эффект полета на смещение выбора поведения в сторону агрессии наблюдался и у самок: полет значительно увеличил интенсивность и длительность драк в опытной группе.

3.1.1.2. Модуляция избегательного/защитного поведения.

Активация избегательного поведения у проигравших самцов отчетливо наблюдалась в экспериментах со стимуляцией воздушной струей на подвижной сфере, позволяющей регистрировать перемещение насекомого (Рис.1).

Рис. 1. Влияние полета (П) на избегательное поведение наивных (К) и субординантных (С) самцов сверчка. По вертикальной оси - максимальная скорость пробежки (см/сек) в ответ на стимуляцию воздушной струей. Среднее значение, стандартная ошибка среднего, парный тест Вилкоксона, p<0.01. О - контрольный эксперимент, влияние обдува.

Полет в течение 3 минут, напротив, подавлял избегательное поведение как у наивных так и у проигравших самцов (Рис.1).

3.1.1.3. Модуляция полового поведения. Контекст-зависимости ухаживания и спаривания G. bimaculatus также был посвящен ряд работ, результатом которых стала демонстрация зависимости реализации полового поведения от исхода межсамцовых драк (Simmons, 1986). Мы исследовали влияние полета на взаимоотношения между самцами и самками. В первой серии изучали, как влияет полет на выбор поведения самцом. В опытной группе, в которой самцы летали в течение 5 минут перед встречей с самкой, достоверно вырос процент ухаживающих (поющих) самцов и, соответственно, возрос процент копуляций (Рис. 2).

Рис. 2. Влияние полета на ухаживание и копуляцию у самцов сверчка. а, процент самцов, издававших звуковые (призывные и копулятивные) сигналы. б, процент пар, в которых наблюдалась копуляция. К - контроль (нелетавшие самцы), к - 5 минут полета самца до встречи с самкой. F - критерий Фишера.

Полет существенно ускорил принятие решения о начале ухаживания: латентный период призывного пения был существенно короче в опытной группе (32 ± 7 сек, против 119 ± 35, H = 4.7, p<0.03, Kruskal-Anova test). Общая относительная длительность пения (процент времени активного ухаживания, пения, от общего времени, проведенного с самкой до копуляции), а также длительность отдельного эпизода непрекращающегося пения была достоверно выше в опытной группе (H=7.2, p<0.01; H=8.6, p<0.005, соответственно, Kruskal-Anova test).

В следующей серии было проверено, оказывает ли полет сходное влияние на выбор поведения самкой в паре с самцом. Животные были разделены на четыре группы: 1. Контроль, нелетавшие самец и самка (24 пары). 2. И самец, и самка перед взаимодействием летали (18 пар). 3. Летала только самка (30 пар). 4. Летал только самец (16 пар). Во всех трех экспериментальных группах значительно возросло число копуляций по сравнению с контролем. Наибольшего значения процент копуляций достиг в группе 4 (летал только самец), достоверно превышая этот показатель не только в контроле, но и в остальных экспериментальных группах. В тех группах, где летала самка, наблюдалось отчетливое увеличение агрессивных взаимодействий. Процент установления отношений победитель-побежденный между самцами и самками также был значительно выше в группах 2 (72%) и 3 (80%) по сравнению с контролем (37.2% , F=5,3 и F=10.7, р<0,05 и р<0.01, соответственно) и группой 4 (20%, F=8.2 и F=14.2, p<0.01 и р<0.001).

Сходный эффект на половое поведение самки оказывала ее победа в драке с другой самкой. Самки-победительницы достоверно чаще реагируют агрессией на самца, чем субординантные самки: 11 из 15 (73.3%) против 2 из 14 (14.3 %, F=11/86, p< 0.002). Уровень и длительность драки с самцом тоже существенно выше у самок, одержавших победу в драке с другой самкой. При этом процент копуляций и процент активно ухаживающих самцов также оказался выше в группе самок-победительниц, а именно 73.3 и 86.7 % против 28.6 и 14.3 % у субординантных самок (F= 6.22 , 6.77; p< 0.018, 0.015, соответственно.)

Подводя итог полученным результатам, можно заключить, что социальный статус и предыдущее моторное поведение являются факторами, оказывающими сильное и хорошо воспроизводимое влияние на поведенческий выбор сверчка. При этом эффекты полета и у самцов, и у самок сходны с проявлениями доминантности.

3.1.2. Нейротрансмиттерные механизмы контекст-зависимого поведения G. bimaculatus.

3.1.2.1. Роль октопамина в механизме модулирующего действия полета.

Предпосылкой для изучения возможной роли октопамина в механизме действия полета на поведение сверчков стала работа Адамо и соавтров (Adamo et al., 1995), которая показала выраженное изменение нейроактивного коктейля в гемолимфе G.bimaculatus после полета и увеличение концентрации октопамина в несколько раз.

В первой серии экспериментов было проверено, не заменит ли инъекция агониста октопамина хлордимеформа (ХДМ) действие полета на проигравших самцов. ХДМ (100 мкл, 1 ММ) вызвал высвобождение агрессивности у проигравших сверчков по отношению к победителям (Рис. 3). Поведение проигравших сверчков, получивших инъекцию ХДМ (черные столбики), четко отличалось от обоих контролей и было сходно с поведением летавших субординантов (черные столбики со штриховкой).

Во второй серии экспериментов ХДМ инъецировали наивным самцам и оценивали эффект на агрессивность в первой драке и способность субординантов вновь вступать в драку с победителем. В первом взаимодействии мы не нашли статистически достоверного эффекта ХДМ на интенсивность и длительность драки.

Рис. 3. Влияние агониста октопаминовых рецепторов хлодимеформа (ХДМ) в сравнении с действием полета и разных контролей на поведение субординантов при повторном контакте с победителем.

А, интенсивность (уровень ) агрессивных взаимодействий. Б, длительность драки (сек). В, относительная частота проявлений отдельных характеристик агрессивного поведения субординантов: демонстраций открытых челюстей, физических драк, побед над доминантами. К -контрольные нелетавшие интактные самцы (белые столбики), О- интактные обдуваемые воздушной струей (белые со шриховкой), Р- нелетавшие инъецированные Рингером (светло-серые столбики), П- интактные летавшие 3 минуты (черные со шриховкой), Хдм - инъецированные ХДМ (CDM, черные столбики) штрихованные столбики. Пунктиром показаны те же параметры поведения интактных субординантов через 18 часов после первой драки.

Однако, в последующих взаимодействиях инъецированные ХДМ пары сверчков существенно отличались по поведению от контроля и были сходны со сверчками, летавшими перед первой дракой. 85% проигравших сверчков демонстрировали раскрытые челюсти, 52% драк переступали уровень демонстрации агрессии и переходили в физическую драку, 20% субординантов выигрывали драку.

Пары сверчков, обработанные альфа-метил-тирозином (АМТ), вызывающим снижение синтеза октопамина и дофамина у насекомых, демонстрировали существенно более низкий уровень агрессии, чем контроль. Трехминутный полет был способен несколько повысить интенсивность агрессивности в первой драке до уровня 4-5, средняя длительность 3-5 сек. Однако последующий эффект полета на способность проигравших сверчков вновь вступать в драку с победителем не проявлялся. Хлордимеформ был по-прежнему эффективен при инъекции АМТ-инъецированным животным.

Эпинастин, высокоселективный антагонист нейрональных октопаминовых рецепторов у насекомых (Degen et al., 2000), блокировал эффект полета на агрессию (Рис. 4). Другой эффективный блокатор октопаминовых рецепторов насекомых фентоламин (Evans, 1981), антагонист адренергических рецепторов млекопитающих, в той же дозе оказывал похожее, но менее выраженное действие на агрессию и эффект полета, чем эпинастин. В отличие от эпинастина и фентоламина, адренергический антагонист млекопитающих пропранолол , имеющий более низкое сродство к октопаминовым рецепторам насекомых (Roeder, 1995), оказал слабый эффект на агрессию.

Рис. 4. Влияние различных антагонистов аминергических рецепторов на агрессивность сверчков и эффект полета на агрессию. Интенсивность агрессии (1-6, медиана с квартилями). Сверчки инъецированы Рингером (20мкл; n=20 пар), пропранололом, (20мкл; 20MM; n=19 пар), фентоламином (20 мкл; 20 MM; n = 14 пар), или эпинастином (20 мкл; 20 MM; n= 20 пар). На сером фоне показаны результаты экспериментов с другими группами сверчков, летавшими в течение 3 минут перед первой дракой. (*p_0.05; **p_0.01; ***p_0.001).

Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой о возможной роли октопамина в механизме контекст-зависимого агрессивного поведения сверчка, модулируемого полетом. В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты, соответствующие критериям необходимости и достаточности: (1) синтез и высвобождение октопамина увеличивается при полете; (2) агонист октопаминовых рецепторов имитирует действие полета на поведенческий выбор у субординантов; (3) эффект полета на агрессию снижается или снимается полностью при подавлении либо синтеза октопамина, либо блокировании октопаминовых рецепторов. Эти результаты стали первым указанием на связь агрессии с уровнем октопамина у насекомых.

3.1.2.2.Возможное участие других сигнальных молекул в модуляции поведения сверчка социальным статусом и полетом

Серотонин. АМТР, ингибитор синтеза серотонина, вызывает достоверное увеличение сильных избегательных ответов (прыжков) на тактильное раздражение церки. В норме в распределении ответов на тактильный стимул доля прыжков составляет 10 -20 %. У животных, инъецированных АМТР, она достигала 55%. «Пугливые» сверчки с фармакологическим дефицитом серотонина достоверно чаще проигрывают в драках. Длительность и интенсивность драк у них также существенно снижена. Эти данные хорошо согласуются с результатами японских исследователей, показавшими, что уровень серотонина снижается в мозге субординантов и неагрессивных самцов с удаленными антеннами (Murakami, Itoh, 2001; 2003). Напрашивается вывод, что контекст-зависимость избегательного поведения может опосредоваться уровнем серотонина.

Опиоид-подобные пептиды и опиатные рецепторы были идентифицированы у насекомых еще в 80-х годах. Поскольку опиоиды принимают участие в регуляции поведения, зависимого от социального контекста у позвоночных (Липина и др., 1998; Кудрявцева и др., 2001), было проверено возможное участие опиоидной системы в регуляции контекст-зависимого избегания и агрессии у сверчка. Результаты показали, что инъекция антагониста опиатных рецепторов налоксона (0.05, 0.1, 1 ММ) доминантам, а также предварительно изолированным самцам, активирует у них избегательное поведение в ответ на тактильное раздражение церки, так что по этому показателю они становятся сходными с субординантными сверчками. Напротив, инъекция агониста мю-рецепторов DAGO (0.05 MM) субординантам (и изолянтам) подавляла их защитное поведение в этом тесте, увеличивая выбор реакций игнорирования. Налоксон (0.05, 0.1 ММ) не влиял на длительность и интенсивность драк предварительно изолированных сверчков, а также не изменял агрессии доминанта по отношению к проигравшему сверчку. Однако у субординантов и у самок сверчка, которые в норме демонстрируют пассивное или активное избегание при столкновении с особью того же пола, налоксон высвобождал агрессивное поведение. Агонист мю-рецепторов DAGO (0.05 MM) уменьшал интенсивность драк между изолированными самцами и существенно подавлял агрессию доминанта по отношению к субординанту. Эти данные указывают на то, что опиоидная система у самок и субординантных самцов принимает участие в подавлении агрессии, а у доминантов в подавлении избегательного поведения.

Оксид азота. Исследовали эффекты неспецифического блокатора NO-синтаз LNNA на агрессивное и половое поведение G. bimaculatus и на эффект полета. Многомерный тест MANOVA показал статистически значимые различия между опытной и контрольной группой по параметрам поведения, характеризующим агрессивность в парах самцов. Все четыре параметра, характеризующие агрессивность, оказались существенно ниже в опытной группе по сравнению с контролем после полета. Напротив, в агонистическом взаимодействии самцов до полета не было выявлено отличий между контрольной и опытной группой ни по одному из показателей. Инъекция L-NNA перед полетом снизила действие последнего и на половое поведение самцов. Тест MANOVA, учитывающий латентный период и длительность призывного пения, выявил значимые различия между группами: Рингер/полет и Рингер, а также Рингер/полет и LNNA/полет. Различия не наблюдались между группами, содержавшими нелетавших самцов, инъецированных соответственно Рингером и LNNA, а также между летавшими и нелетавшими самцами, инъецированными LNNA. Эти данные указывают на то, что во время полета может происходить активация NO-синтазы, и что превышение продукции NO над исходным фоном вносит существенный вклад в формирование вызванного полетом поведенческого состояния. поведение секреция нейротрансмиттер фенотип

3.2. Контекст-зависимое поведение моллюска Lymnaea stagnalis и его нейротрансмиттерные механизмы.

3.2.1. Модуляция поведенческого выбора прудовика пищевой депривацией и моторной нагрузкой. Исследовали, как влияет голод и вызванное голодом араузальное состояние на ответ животного на относительно нейтральные стимулы. Достоверные различия наблюдались между группами голодавших (38 часов) и сытых животных по распределению ответов на тактильное раздражение щупальца (р< 0.001). Наиболее характерным ответом сытых улиток оказалась умеренная защитная реакция - втягивания щупальца в ответ на прикосновение. Напротив, у голодавших особей 50% ответов составляла ориентировочная реакция - поворот в сторону раздражителя. Далее мы исследовали влияние того же поведенческого контекста на реакцию животного на внезапное предъявление нового объекта. Для этой задачи был разработан метод, который позволял анализировать ответы улитки на неожиданное появление перед ней нейтрального объекта - небольшого камушка (см. Материалы и методы). У голодавшей группы также было выявлено значительное преобладание исследовательского поведения: наползания и ощупывания (Рис. 6).

Результаты экспериментов с модуляцией поведенческих ответов голодом легко трактуются в терминах биологической целесообразности. Действительно, усиление ориентировочной и исследовательской компоненты поведения является характерной чертой голодного поведения всех исследованных в этом отношении животных. Однако предыдущий опыт работы со сверчком G. bimaculatus указывал на существование разных видов влияний предыдущего поведения на последующее, биологический смысл которых не всегда лежит на поверхности. Так, до сих пор существуют только разнообразные спекуляции в отношении биологического смысла мощных поведенческих перестроек, запускаемых полетом у сверчка. Мы предположили, что эффект полета у G.bimaculatus мог развиться в эволюции на основе некоего общего феномена, а именно влияния повышенной моторной нагрузки на поведенческое состояние животных. Примечательно, что к моменту исследований данные о существовании таких эффектов были получены на млекопитающих (Salmon, 2001). Существует ли подобный феномен у других групп животных?

Действительно, оказалось, что после периода повышенной моторной нагрузки у L. stagnalis снизился латентный период локомоции (p<0.001, z =3.3, парный тест Вилкоксона), увеличилась скорость водной локомоции (p<0.05, z=1.9), активировался мышечный тип локомоции в водной среде. Изменились защитные реакции на пугающие и нейтральные стимулы. Так, длительность втягивания в раковину на затемнение достоверно сократилась после периода наземной локомоции (p<0.008, z=2.6). В ответ на тактильную стимуляцию щупальца улитки демонстрировали меньший процент защитных реакций, втягиваний, напротив, доля игнорирований достоверно увеличилась (Рис. 5). Перечисленные выше характеристики свидетельствовали о двигательном араузале улиток после интенсивной моторной нагрузки и о подавлении защитных реакций. Эти эффекты в целом сходны с описанными у сверчка и млекопитающих.

Рис. 5. Распределение ответов улиток на тактильное раздражение щупальца в контроле (слева), после 20 минут наземной локомоции (в центре), после 30 минут локомоции в низком слое воды.

(i) частичное втягивание тела в раковину (ii) втягивание щупальца (iii) игнорирование (iv) поворот в сторону стимула. Среднее значение и стандартаная ошибка среднего. Результат многомерного теста Manova указывает на достоверное изменение в распределении ответов после моторной нагрузки (Rao’s R (4,25)= 3.7, p=0.01 и Rao’s R (4,19)= 12.6, p=0.001)

3.2.2. Роль серотонина в механизмах модулирующего действия голода и моторной нагрузки.

В совместной работе с венгерскими коллегами мы исследовали влияние голода на содержание серотонина в разных ганглиях прудовика. Голод достоверно увеличил содержание серотонина в буккальных и педальных ганглиях, ответственных за пищевое поведение и локомоцию: 9 ± 0.44 пкмоль/мг и 136 ± 14.8 пкмоль/мг, соответственно, против 4.5 ± 0.56 пкмоль/мг и 90 ± 15.2 пкмоль/мг в контроле у сытых животных. Повышенное содержание серотонина наблюдалось и у прудовиков, голодавших 48 часов (8 ± 0.65 пкмоль/мг и 135± 15 пкмоль/мг). В качестве контроля отслеживали также уровень дофамина в этих ганглиях, он достоверно не изменялся при голодании 12, 24, 48 часов. Повышение содержания серотонина в нервной системе прудовика зафиксировано Е. Каботянским и после повышенной моторной нагрузки (Kabotyanski et al., 1992).

Метаболический предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан (5-НТР) используется в нейрофармакологии для повышения синтеза серотонина, эффективен и у моллюсков (Fickbohm et al., 2005). 5-НТР, так же как и голод, вызывал активацию ориентировочного и исследовательского ответа и подавление защитного. В ответ на тактильное раздражение щупальца улитка не втягивала его, как это делают контрольные особи, а поворачивала голову в сторону раздражителя. Сходный эффект вызывал также серотонин, а действие 5-НТР снималось предварительной инкубацией улиток в растворе ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот м-гидроксибензил гидразина (0.01 ММ), предотвращающего превращение 5-НТР в серотонин. Прудовики, инкубированные в 5-НТР, в ответ на внезапное предъявление объекта подползали к нему и исследовали, касаясь губами и радулой (Рис. 6, р< 0.01, тест Фишера).

Рис. 6. Распределение отставленных ответов у сытых (Сыт.), голодных (Гол.) и инъецированных 5-НТР улиток. 24 ч. - одна из голодавших групп после 24 часового кормления ad libitum. Средний процент по 5 группам и стандартная ошибка среднего. Черные столбики - избегательная реакция (поворот более, чем на 900 градусов), светлые с точечной штриховкой - обход (смена курса на угол менее 900 градусов), светлые столбики с сетчатой штриховкой - исследоваетльская реакция (наползание на камень, ощупывание губами и щупальцами).

Проведенные эксперименты, показали, что можно имитировать действие голода и повышенной моторной нагрузки на поведенческий выбор фармакологическими агентами, влияющими на состояние серотониновой системы. Принципиальным оставался вопрос о том, почему поведенческий контекст, с одной стороны, тотальная аппликация серотонина, адресующаяся в основном к экстрасинаптическим рецепторам, с другой, и метаболический предшественник серотонина, вызывающий повышенный выброс серотонина в синаптических контактах, с третьей, вызывают сходные изменения в поведении.

3.3. Клеточные механизмы, обеспечивающие изменения экстраклеточного содержания нейротрансмиттеров при изменении поведенческого контекста

3.3.1. Поведенческое состояние сохраняется в изолированной нервной системе. Электрическую активность серотонинергических клеток РЕА, которые расположены большой симметричной группой (кластером) в медиальной области педальных ганглиев и иннервируют мышцы и ресничный эпителий ноги прудовика, в препаратах изолированной ЦНС, взятой от сытых и голодных особей, достоверно различалась. Нейроны в ЦНС голодавших в течение 36-40 часов животных демонстрировали более высокий уровень деполяризации и электрической активности (ANOVA F =4.6; 9.6, p= 0.005, N=40, 37). Увеличение длительности голода до 5 суток и выше вызывала противоположный эффект. Эффект кратковременного голодания на электрическую активность сохранялся и у полностью изолированных нейронов РЕА кластера (N=16). Эти результаты показали, что поведенческое состояние (поведенческий контекст) сохраняется в изолированной нервной системе, что позволяет изучать клеточные механизмы контекст-зависимого поведения.

3.3.2. Изучение клеточных механизмов действия метаболического предшественника серотонина 5-НТР. Результаты предыдущих экспериментов показали, что непосредственый предшественник серотонина 5-НТР, имитирующий влияние голода и моторной нагрузки на поведенческий выбор, повышает электрическую активность РЕА нейронов (Каботянский и др. 1991). Его эффект полностью снимался ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот, отвечающей за синтез серотонина из 5-НТР (Чистопольский и Сахаров, 2000). Мы исследовали влияние 5-НТР на полностью изолированный нейрон, когда исключаются опосредованные влияния со стороны остальной нервной системы.

3.3.2.1. Метаболический предшественник серотонина возбуждает изолированные серотониновые нейроны РЕА. 5-HTP (0.025, 0.05 и 0.1 ММ) во всех случаях оказывал активирующее действие на электрическую активность изолированных РЕА нейронов прудовика. У исходно активных клеток (n = 23) начальная частота разряда составляла 8 ± 3 потенциалов действия (ПД) в мин, через 5 мин после подачи 0.1 ММ 5-НТР она поднялась до 20 ± 6 (р < 0.001). Исходно молчавшие клетки под влиянием 5-НТР (0.1 ММ) деполяризовались (12 из 12), у 11 появилась устойчивая импульсация с частотой 21 ± 7 ПД\мин.

3.3.2.2. Эффект 5-НТР снимается ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот м-гидроксибензилгидразином (NSD-1015). NSD-1015 (0.025, 0.05, 0.1 и 1 ММ) угнетал электрическую активность изолированных РЕА нейронов. Клетки, у которых исходная частота составляла 12 ± 3 ПД в мин, через 5 минут после подачи 0.05 ММ NSD-1015 разряжались с частотой 6 ± 2 (n = 7, р 0.5). В отличие от 5-НТР, серотонин продолжал оказывать возбуждающее действие на фоне NSD-1015.

3.3.2.3. Влияние антагониста серотониновых рецепторов мианзерина на активность изолированных нейронов РЕА, эффект серотонина и 5-НТР. Мианзерин в концентрации 10 МКМ полностью снимал действие 0.5 МКМ серотонина и достоверно снижал возбуждающий эффект 1 МКМ серотонина на изолированные РЕА нейроны. На фоне мианзерина 5-НТР не вызывал достоверного увеличения частоты потенциалов действия. Существенно также, что мианзерин сам по себе вызывал небольшую гиперполяризацию изолированных нейронов ( - 2-3 МВ, N=8, z =2, P < 0.05) и небольшое снижение частоты импульсации. Эффект мианзерина на РЕА клетки был обратимым.

3.3.2.4. Ингибитор везикулярных моноаминовых транспортеров резерпин препятствует возбуждающему эффекту 5-НТР. 5-НТР на фоне резерпина не вызывал достоверного увеличения импульсации (n = 8). В ответ на подачу смеси 5-НТР и резерпина слабое учащение активности было заметно всего у двух из восьми спонтанно-активных изолированных нейронов, обработанных в течение 20 мин резерпином (в среднем 17± 7 ПД/мин до, и 14 ± 3 после подачи 5-НТР, р> 0.5). Резерпин снимал возбуждающий эффект 5-НТР и на молчащих клетках.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о существовании экстрасинаптической секреции серотонина, повышающейся в ответ на усиление синтеза нейротрансмиттера, и в свою очередь, по механизму положительной обратной связи, усиливающей электрическую активность и, следовательно, секрецию серотонина. Наличием такого механизма самораскрутки на уровне даже отдельного изолированного нейрона очевидно объясняются сильные поведенческие эффекты 5-НТР (Рис. 7).

Рис. 7. Возможный механизм влияния предшественника серотонина на электрическую активность изолированного серотонинового нейрона. (1) 5-НТР декарбоксилируется в серотонин (эффект снимается ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот; (2) серотонин переносится в везикулы (эффект снимается ингибитором везикулярных монаминтранспортаз резерпином); (3) неизвестный механизм активации выброса везикулярного серотонина в ответ на повышение его синтеза (не зависит от ПД); (4) активация возбуждающих серотониновых ауторецепторов.

3.3.3. Серотонин, синтезируемый РЕА нейронами - нейротрансмиттер, нейромодулятор или нейрогормон?

Результаты, описанные в предыдущем разделе, указывали на существование тонической экстрасинаптической секреции серотонина и об усилении этой секреции при повышении синтеза серотонина. Эксперименты И.А. Чистопольского и Д.А. Сахарова (Chistopolsky, Sakharov, 2003) подтвердили наличие функционально-значимой секреции серотонина телами РЕА нейронов и продемонстрировали роль несинаптического экстраклеточного серотонина в поддержании определенного уровня тонической активности этих клеток. Мы проверили, зависит ли экстрасинаптическая секреция РЕА кластера от поведенческого состояния улитки. Биосенсор подводили к области РЕА кластера нервных систем, изолированных из сытых и голодных улиток (n=20) поочередно (Рис. 8). Оценивали изменения частоты его активности около РЕА кластера по отношению к нейтральной позиции, равноудаленной от обоих препаратов. Из 10 опытов в 8 наблюдалось существенно более сильное (более 20% ) возбуждающее действие со стороны голодного препарата, в одном опыте был получен противоположный эффект, и в одном опыте различия были недостоверны (менее 5%). Парный тест Вилкоксона свидетельствует о достоверности различий (р= 0.02, z=2.2).

Нервная система моллюсков отделена от циркулирующей по всему организму гемолимфы двумя слоями оболочек. Мы нашли, что биосенсор реагирует возбуждением на подведение к педальным ганглиям, у которых сохранены интактными оболочки (n=8). Ответ в среднем был ниже, чем при подведении к ганглиям со снятыми оболочками. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует механизм влияния РЕА нейронов на другие отделы нервной системы по нейрогуморальному пути.

Рис. 8. Изменения в активности двух биосенсоров (б1, б2) при подводе к области РЕА кластера препаратов ЦНС прудовика от сытых и голодных животных в одном опыте. Серой линией обозначена активность биосенсора у “голодного” препарата, черной - у “сытого”, o - нейтральное положение, вертикальные линии - начало перемещения биосенсора.

3.4.4. Повышение синтеза нейротрансмиттера усиливает несинаптическую секрецию нейротрансмиттера и у других нейронов. Уникален ли описанный выше случай несинаптической секреции нейротрансмиттера, управляемой интенсивностью синтеза нейротраснмиттера? Чтобы ответить на этот вопрос, для дальнейших исследований была выбрана клетка, по ряду характеристик отличающаяся от нейронов РЕА кластера: (1) нейрон другой эргичности; (2) нейрон с тормозными ауторецепторами; (3) одиночный нейрон, не имеющий в своем окружении сходных клеток по эргичности и функции; (4) интернейрон, а не мотонейрон. Конкретно, мы использовали детально охарактеризованный многими авторами дофамин-продуцирующий нейрон RPED1 L. stagnalis (Magoski et al., 1995). Проведенные эксперименты показали, что у изолированного RPED1 L-DOPA вызывает возбуждение, которое затем переходит в торможение. Тормозный эффект снимается (1) ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот, который препятствует превращению L-DOPA в дофамин, (2) антагонистом дофаминовых рецепторов и (3) самим дофамином. Возбуждающий эффект, напротив, усиливается на фоне ингибитора декарбоксилазы, а также на фоне дофамина. Эти данные указывают на то, что возбуждение является результатом прямого действия L-DOPA, а гиперполяризующий эффект опосредован экстрасинаптической секрецией дофамина.

Таким образом, в результате проведенных и описанных в этой главе экспериментов, впервые удалось показать клеточные механизмы, обеспечивающие изменение несинаптической экстраклеточной секреции медиатора при изменении функционального состояния. Показано, что вызванное естественным фактором (голодом, повышенной моторной нагрузкой) повышение синтеза серотонина может увеличивать электрическую активность серотониновых клеток и экстрасинаптическую секрецию нейротрансмиттера. Описан возможный механизм усиления экстрасинаптической секреции в ответ на активацию синтеза на полностью изолированных нейронах и показано, что такая секреция не только создает функционально-значимый фон для нейронов РЕА кластера, но и может обеспечить влияние на другие отделы ЦНС и весь организм животного по нейрогормональному типу действия. Эксперименты на дофаминергическом интернейроне RPED1 свидетельствуют о том, что найденный механизм не является уникальным для серотониновой группы клеток РЕА кластера.

3.4. Влияние химического контекста на выбор программы активности нейрональным ансамблем и отдельным нейроном.

3.4.1. Модификация оксидом азота (NO) эффектов глутамата в паттерн-генерирующей сети пищевого поведения Lymnaea stagnalis.

Ранее на виноградной улитке было показано, что NO контролирует ответ определенных нейронов на глутамат (Дьяконова Т., 1998, 2002). В центральном генераторе буккального ритма прудовика глутамат является нейротрансмиттером интернейрона N2v, отвечающего за координацию активности интер- и мотонейронов во второй фазе ритма (Brierley et al., 1997). NO синтезируется нейронами буккальных ганглиев и участвует в хемосенсорной активации пищевой программы. Представлялось целесообразным проверить возможную зависимость эффектов глутамата в этой системе от уровня NO. В качестве мониторов активности буккального генератора использовали мотонейроны В4, которые тормозятся во время 1 и 2 фазы трехфазного ритма и активируются во время 3 фазы (Staras et al., 1998).

3.4.1.1. Действие глутамата на активность нейронов В4. На 17 нейронов из 29 глутамат оказал тормозное действие, а на 12 - возбуждающее. Характер ответа В4 на глутамат не зависел от уровня мембранного потенциала. Возбуждающий ответ характеризовался деполяризацией и активацией дополнительных возбуждающих входов, при этом стандартный трехфазный пищевой паттерн мог существенно модифицироваться, превращаясь в двухфазный, названный ритмом II типа (Рис. 9а).

3.4.1.2. Действие донора NO нитропруссида на активность нейронов В4 и эффект глутамата. Во всех случаях нитропруссид вызывал обильный возбуждающий приток на В4, в том числе, связанный с формированием пищевого ритма. Влияние донора NO на эффект глутамата смотрели на нейронах, исходно демонстрировавших тормозную реакцию на глутамат (n=14). Если нитропруссид вводили в инкубационный раствор на 5-20 мин до глутамата, то исходно тормозное действие глутамата превращалось в возбуждающее (n=9). При действии нитропруссида менее 5 мин тормозный ответ подавлялся, но возбуждения не было (n=4). В контрольных опытах (n=2) с повторным введением глутамата через 20 мин характер ответа В4 не изменялся.

3.4.1.3.. Действие акцептора NO PTIO на активность нейронов В4 и эффект глутамата. Если исходно глутамат активировал буккальный генератор и нейрон В4 (n=7, Рис. 9а), то предварительное воздействие PTIO (0.25 ММ) в течение 5-20 минут превращало этот ответ в тормозный (Рис. 9б). Если исходно ответ был тормозным (n=2), то после воздействия PTIO направление ответа не изменялось.

Рис. 9. Трансформация ответа на глутамат акцептором оксида азота PTIO. Нейрон В4 в препарате изолированной ЦНС. (а) Исходно глутамат (глу; 0,1 ММ) учащает и изменяет буккальный ритм, вызывая исчезновение одной из фаз (стрелки). (б) После воздействия PTIO (0,25 ММ) в течение 20 мин глутамат вызывает полное выключение активности.

3.4.1.4. Действие блокатора (ODQ) NO-зависимой гуанилатциклазы (ГЦ) на глутаматный ответ нейронов В4. ODQ (0,025 ММ) вводили за 10-15 мин до глутамата (6 неизолированных нейронов B4 и 5 полностью изолированных нейронов). Во всех случаях, ODQ подавлял возбуждающее действие глутамата: оно существенно снижалось по сравнению с контролем, но в большинстве случаев становилось тормозным. Эти результаты показывают, что эффекты глутамата на нейроны В4 зависит от активности NO-зависимой ГЦ.

3.4.1.5. Источники глутамата в буккальных ганглиях и возможная функциональная роль двухфазного ритма. Гистохимическое окрашивание выявило интенсивную иннервацию буккальных ганглиев глутамат-иммунореактивными волокнами с множеством варикозных расширений. Было очевидно, что должны существовать другие источники глутамат-иммунореактивности нейропиля буккальных ганглиев помимо интернейронов N2v. В дорзобуккальных нервах наблюдалось два мощных пучка глутаматиммунореактивных волокон. Исследование периферии, связанной с этими нервами, показало, что в пищеводе, особенно в нижнем его отделе, выявляются многочисленные иммунореактивные нейроны. Эти мульти- и биполярные клетки образуют сеть, охватывающую всю поверхность пищевода на уровне наружного мышечного слоя, отростки этих нейронов входят в дорзо-буккальный нерв. Эти результаты свидетельствуют о том, что существенный вклад в глутаматергическую иннервацию буккальных ганглиев вносят нейроны пищевода. Выявленная в пищеводе сеть глутаматиммунореактивных нейронов, дающих проекции в буккальные ганглии, наряду с описанными нами эффектами глутамата (торможение трехфазного ритма, гиперполяризация ключевых мотонейронов, активация двухфазного «эвакуаторного» ритма), позволяют рассматривать глутамат в качестве кандидата на роль агента, ответственного за сигнализацию из пищевода. В случае подтверждения этой гипотезы возникает теоретически интересная коллизия нейротрансмиттерного изохимизма центральных (N2v) и периферических нейронов, участвующих в обеспечении общей поведенческой функции. Полученные результаты демонстрируют, что ответ буккальной системы нейронов на глутамат радикально меняется при изменениях уровня NO.

3.4.2. Роль экстрасинаптического контекста координации моторных ритмов и в выборе нейроном В2 характера активности.

3.4.2.1. Координация ритмов буккального генератора и нейронов, модулирующих сокращения пищевода. В буккальных ганглиях прудовика помимо описанного выше центрального генератора, управляющего моторикой радулы (ЦБГ), находятся нейроны, отвечающие за контроль моторики пищевода (Perry et al., 1998). Это гигантские парные нейроны В2, синтезирующие NO, ацетилхолин и миомодулин (Park et al., 1998; Perry et al., 1998) и способные к генерации собственного пачечного ритма. Существует несколько вариантов координации ритмов ЦБГ и нейрона В2. Сопоставление уровня мембранного потенциала В2 с активностью ЦБГ свидетельствует о том, что активация ЦБГ в большинстве случаев сопровождается тонической гиперполяризацией В2.

3.4.2.2. NO активирует буккальный ритм и тормозит активность В2. При параллельном мониторинге активности буккального генератора и нейрона В2 показано, что доноры NO (SNP, SNAP, нитрит натрия) вызывают синхронную активацию буккального ритма и торможение ритма нейрона В2. Блокатор NO зависимой гуанилатциклазы ODQ (0.05 ММ), напротив, оказывал выраженное деполяризующее и возбуждающее действие и подавлял тормозные эффекты доноров NO. Блокатор NO-синтазы L-NNA (n=16, Рис. 10a) вызывал деполяриз

1. Dyakonova V.E., Dyakonova T.L., and Sakharov D.A. Edogenous opioids of "model" gastropods: Coordination of motor programmes for feeding and defensive behaviour in the pond snail Lymnaea stagnalis // Biol. Membranes. 1992. Т. 9. С. 1874-1876.

2. Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Участие эндогенной опиоидной системы в регуляции пищевого и защитного поведения моллюска // Журн. высш. нерв. деят. 1994. Т. 44. N 2. С. 316-322.

3. Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Нейротрансмиттерная основа поведения моллюска: управление выбором между ориентировочным и оборонительным ответом на предъявление незнакомого объекта // Журн. высш. нерв. деят. 1994. Т. 44. N. 3. С. 526-531.

4. Baker M.W., Croll R.P., Dyakonova V., Khabarova M., Sakharov D.A., Voronezhskaya E. Mode of action of antipsychotic drugs: Lessons from simpler models // Acta biol. hung. 1995. Т. 46. N. 2-4. C. 221-227.

5. Dyakonova V.E., Elofsson R., Carlberg M., Sakharov D.A. Complex avoidance behaviour and its neurochemical regulation in the land snail Cepaea nemoralis // Gen. Pharmac. 1995. T. 26. C. 773-777.

6. Dyakonova V.E., Carlberg M., Sakharov D.A., Elofsson R. Anatomical basis for interactions of enkephalins with other neurotransmitters in the CNS of a snail // J. Comp. Neurol. 1995. T. 361. C. 38-47.

7. Дьяконова В.Е. Эндогенная опиоидная система тонически активирует локомоторные нейроны Lymnaea stagnalis // Журн. высш. нерв. деят. 1998. Т. 48. N. 1. C. 113-120.

8. Dyakonova V., Elofsson R., Carlberg M., D.A. Sakharov Effects of Naloxone on c-jun/AP-1 in Met-enkephalin- and FMRFAMIDE-immunoreactive Neurons of a Gastropod Snail // Acta Biol. Hung. 1999. T. 50. N.1-2. C. 43-54.

9. Dyakonova V.E., Sakharov D.A., Schuermann F.-W. Effects of serotonergic and opioidergic drugs on escape behavior and social status of male crickets // Naturwissenschaften. 1999. T. 86. C. 435-437.

10. Dyakonova V.E., Schuermann F.-W., Sakharov D.A. Social aggressiveness of female and subordinate male crickets is released by opiate receptor antagonist // Acta Biol. Hung. 2000. T. 51. N. 2-3. C. 363-367.

11. Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Изолированный серотониновый нейрон: уровня синтеза нейротрансмиттера влияет на импульсацию // Доклады РАН. 2001. T. 376. N. 2. C. 267-270.

12. Дьяконова В.Е. Поведенческие функции опиоидных пептидов у беспозвоночных. Обзор // Журн. эвол. биохим. физиол. 2001. T. 4. C. 253-261.

13. Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А. Изолированный серотониновый нейрон: механизм возбуждения, вызванного активацией синтеза нейротрансмиттера // Доклады РАН. 2001. T. 378. N. 5. C. 694-696.

14. Dyakonova V.E., Schuermann F.-W., Sakharov D.A Effects of opiate ligands on intraspecific aggression in crickets // Peptides. 2002. T. 23. N. 5. C. 835-842.

15. Дьяконова В.Е., Крушинский А.Л. Усиление полового поведения и агрессивности у сверчков после полета. ДАН. 2003. T. 390. N. 5. C. 709-712.

16. Hernadi L., Hiripi L., Dyakonova V., Gyori J., and Vehovszky A. The effect of food intake on the central monoaminergic system in the snail, Lymnaea stagnalis // Acta Biol. Hung. 2004. T. 55. N. 1-4. C. 185-194.

17. Alania M., Dyakonova V., Sakharov D.A. Hyperpolarization by glucose of feeding related neurons in snail // Acta Biol. Hung. 2004. T. 55. N. 1-4. C. 195-200.

18. Stevenson P., Dyakonova V.E., Rillich J., Schildberger K. Octopamine and Experience-Dependent Modulation of Aggression in Crickets // J. Neurosci. 2005. T. 25. N. 6. C. 1431-1441.

19. Дьяконова В.Е., Крушинский А.Л. Влияние ингибитора NO-синтазы на агрессивное и половое поведение сверчка // Росс. физиол. журн. им И.М. Сеченова. 2005. T. 91. N. 6. C. 616-624. Переведена в Neurosc.Behav.Physiol. 2006. T. 36. N. 5. C. 565-571.

20. Дьяконова В.Е., Дьяконова T. Л., Сахаров Д.А. Двуфазное действие L-DOPA на электрическую активность изолированного дофаминергического нейрона // ДАН. 2005. T. 403. C. 253-256.

21. Дьяконова T. Л, Дьяконова В.Е. Модификация оксидом азота (NO) эффектов глутамата в паттерн-генерирующей сети // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2007. T. 93. N. 3. C. 236-247.

22. Дьяконова В.Е. Поведенческие эффекты октопамина и серотонина: некоторые парадоксы сравнительной физиологии // Успехи физиол. наук. 2007. T. 38. N. 3. C. 3-20.

23. Dyakonova V.E., Krushinsky A.L. Previous motor experience enhances courtship behavior in male cricket Gryllus bimaculatus // J. Insect Behavior. 2008. T. 21. C. 172-180.

24. Дьяконова T. Л, Дьяконова В.Е. Электрическая активность NO-синтезирующего нейрона зависит от уровня NO // Бюлл. эксп. биол. мед. 2008. T. 145. N. 6. C. 608-612.

25. Dyakonova T.L., Dyakonova V.E. Possible involvement of nitric oxide in coordination of buccal feeding rhythm and gut motility in Lymnaea stagnalis // Acta Biol. Hung. 2008. T. 59. C. 33-37.

26. Dyakonova V.E., Chistopolsky I.A., Dyakonova T.L., Vorontsov D.D., Sakharov D.A. Direct and decarboxylation-dependent effects of neurotransmitter precursors on firing of isolated monoaminergic neurons // J. Comp. Physiol. A. 2009. T. 195. N. 6. C. 515-527.

27. Дьяконова Т.Л., Дьяконова В.Е. Участие рецепторов NMDA-типа в регуляции глутаматом пищевой моторной программы пресноводного моллюска Lymnaea // Журн. эвол. биохим. физиол. 2010. T. 46. C. 45-51.

28. Dyakonova T.L. and Dyakonova V.E. Coordination of rhythm-generating units via NO and extrasynaptic neurotransmitter release // J. Comp. Physiol. A. 2010. T. 196. N. 8. C. 529-541.

Размещено на .ru